סינתזת פאזה מוצקה

1. טעינת השרף

1. לכלי סינתזה פפטיד 100mL, להוסיף 2-כלורוטיל כלוריד (CTC) שרף (1.1 mmol/ g, 0.360 גרם, 0.400 mmol). הוסף 20 מ"ל DMF ולאפשר להם להתנפח במשך 30 דקות תחת N_2.
2. מסננים את החרוזים תחת ואקום ומוסיפים 10 מ"ל DMF.
3. יש להוסיף 500 מ"ג Fmoc-Ala-OH (1.60 מ"ל) ו-2.5 מ"ל i-Pr₂EtN, ומערבבים מתחת ל-N₂ במשך 15 דקות.
4. מסננים את הממס תחת ואקום וחוזרים על הטעינה עם Fmoc-Ala-OH במשך 15 דקות.
5. מסננים את הממס תחת ואקום לשטוף את החרוזים עם 10 מ"ל DMFunder N₂, ולנקז תחת ואקום 3x.

2. הסרת ההגנה של קבוצת Fmoc

1. מוסיפים 10 מ"ל 20% 4-מתילפיפרידין ב- DMF ומערבבים את החרוזים מתחת ל- N₂ במשך 15 דקות.
2. מסננים את הממס תחת ואקום וחוזרים על ההגנה.
3. לשטוף את החרוזים עם 10 מ"ל DMF תחת N₂ ולנקז תחת ואקום 3x.

3. ביצוע מבחן הקייזר

1. בצע את מבחן קייזר על ידי הוספת 1-2 טיפות של פתרון A (0.5 מ"ל 0.01 M KCN, 24.5 מ"ל פירידין), פתרון B (1 גרם ניינהידרין, 20 מ"ל n-butanol), ופתרון C (20 גרם פנול, 10 מ"ל n- butanol) כל אחד לתוך שתי מבחנות. מבחנה אחת תהיה השליטה ואילו השנייה תפקח על התגובה.
2. הוסף כמה חרוזים של שרף מכלי התגובה מבחנה תגובה לחמם את שתי המבחנות ל 110 °C (50 °F).
3. אם ההגנת הושלמה, התוכן של המבחנה יהפוך צבע כחול כהה / סגול. אם הסרת ההגנה אינה שלמה או נכשלה, הפתרון יישאר צהוב. השווה את מבחנה התגובה עם מבחנה הבקרה.

4. צימוד אבני הבניין הבאות

1. מסננים את הממס תחת ואקום.
2. לשטוף את החרוזים עם 10 מ"ל N-מתיל-2-פירולידון תחת N₂ ולנקז את הממס תחת ואקום.
3. כדי להתחיל את הזיווג הבא, להוסיף 10 מ"ל NMP, 620 mgFmoc-Phe-OH (1.6 mmol), 610 מ"ג HBTU (1.6 mmol), ו 2.5 מ"לi-Pr₂EtN, ולאפשר את השרף לבעבע מתחת N₂ במשך 30 דקות.
4. מסננים את הממס תחת ואקום.
5. לשטוף את החרוזים עם 10 מ"ל DMF תחת N₂ ולנקז תחת ואקום 3x.
6. בצע את מבחן קייזר (ראה שלבים 3.1-3.3) כדי לחפש את השלמת הצימוד. החרוזים והפתרון במבחנה צריכים להיות צהובים.

5. מבקע את הפפטיד מהשרף

1. Cleave קבוצת Fmoc הנותרת באמצעות שלבים 2.1-2.3.
2. לאחר הממס מנוקז תחת ואקום, להוסיף פתרון מחשוף 40 מ"ל (95% TFA, 2.5% H₂O, 2.5% טיפים) לשרף ובועה תחת N₂ עבור 3 שעות.
3. מניחים בקבוקון קבלה חדש על סינתיסייזר הפפטיד ומנקזים את תמיסת ה-TFA המכילה את הפפטיד הרצוי תחת ואקום לתוך הבקבוקון החדש.

6. משקעים ואני זוחלים של הפפטיד

1. הפרד את פתרון TFA ל -4 בקבוקונים חרוטים והוסף אתר קר 25 מ"ל (−20 °C (70 °F) לכל בקבוקון כדי לזרז את הפפטיד.
2. צנטריפוגה הבקבוקונים (3,000 סל"ד, 0-4 מעלות צלזיוס) במשך 20 דקות. זלזלו בפתרון TFA ואתר הנותרים מהבקבוקונים החרוטים ורכזו את משקעים הפפטידים כדי להרשות לעצמם את הדיפפטיד הרצוי כמוצק לבן.