Name: זיהוי ובידוד של Viable IL-17-מפריש תאים עכבר T (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: למד לזהות ולבודד תאי T עכבריים המפרישים IL-17 באמצעות מערכת ניתוח ציטוקינים ברמת התא הבודד. שיטה זו משפרת דיוק בחקר תגובות חיסוניות ומחלות אוטואימוניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הכנת ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך חוצץ המכיל PBS עם ארגון ה-BSA (0.5%), ו - 2 mM EDTA. בגלל בועות אוויר יכול לחסום MACS עמודות הפרדה, המאגר צריך להיות degassed ומאוחסנים ב 2-8 מעלות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים RPMI 1640 בינוני המכילה סרום עכבר 5%. בינוני תרבות לא יכילו BSA או FCS, כמו תרכובות אלו תשנה את הספציפיות של גירוי התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IL-17 עכבר Assay הפרשת - העשרה תא ערכת זיהוי מ-Miltenyi BIOTEC. הערכה מכילה את הרכיבים הבאים: IL-17 מגיב תפוס, IL-17 נוגדן איתור (ביוטין), Anti-ביוטין-PE, ו Anti-PE microbeads. </li></ol> גירוי Splenocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטוקול זה מתבצע בנוכחות של פקד שליליות וחיוביות, כגון splenocytes unstimulated ו counterstain עבור ותאי T. פרוטוקול זה מבוצעת באמצעות טכניקה סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ההשעיה תא בודד של העכבר splenocytes שהיו מבודדים באמצעות Dissociator ™ gentleMACS. ריכוז של תאים צריך להיות קבוע מראש באמצעות ספירת התאים. גלולה התאים ב × 200 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, לשאוב supernatant את גלולה באמצעות פיפטה. אין למזוג את הצינור כדי למנוע אובדן של גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו, resuspend התאים במדיום תרבות ולאחר מכן להוסיף את באר. הוסף בינוני מספיק ריכוז של 10,000,000 תאים לכל מ&quot;ל ו - 5,000,000 תאים לס&quot;מ מרובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעורר תגובה חיסונית בתאי resuspended שלנו, אנו להוסיף ionomycin (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו PMA (10 ng / mL) המדגם ומערבבים את הפתרון על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. ואז בארות מסומנים בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו, אנו דגירה התאים שלנו במשך 3 שעות ב 37 ° C, ללא ערבוב כדי להתחיל את תקופת גירוי. המשך IL-17 3 שעות מתחילת הניתוח של גירוי, ולכן התוכנית בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעצור את הפרשה, התאים ממוקמים על קרח אנו אוספים את התאים מגורה על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה עם חיץ קר. תאים מועברים לאחר מכן מהבאר אל צינור ו נשטפים בפעם השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להבטיח כי כל התאים נאספים, זה רעיון טוב כדי לבדוק המנה שלך תחת מיקרוסקופ. אם התאים עדיין להישאר מחובר, אתה יכול לאסוף את התאים הנותרים על ידי שטיפת צלחת עם חיץ קר. גושים כל תא ההשעיה הסלולרי שלך ניתן להסיר באמצעות טרום הפרדה מסננים. </li></ol> סימון תאים עם מגיב תפוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה הוא בעל חשיבות עליונה לציין, כי assay זה עובד באופן אופטימלי אם פחות מ 2% של IL-17-מפריש תאים קיימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ריכוז של IL-17 תאים להפריש צפוי להיות יותר מ 2% להתאים כמויות בהתאם. <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="דמות 8" width="500" height="162" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשול אפשרי אחד של הליך זה הוא זיהום לחצות של מגיב תפוס, אשר יכול להתרחש במהלך תיוג כאשר נוגדן ספציפי דו נקשר לתא להפריש ללא טי ומלכודות IL-17 מופרש מן לימפוציטים שכנה, ובכך לייצר תוצאות חיוביות שגויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקוף בעיה זו, חשוב לתאי להתקרר לפני תיוג לעבוד עם חיץ קר להאט דיפוזיה של IL-17 ו להימנע זיהום לחצות. בנוסף לשמירה על התאים קר, הם חייבים להיות כל הזמן בריכוז מוגדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את ההליך תיוג, אנו משתמשים 10,000,000 תאים צינור closable 15 מ&quot;ל. אם המספרים גבוהים יותר התא צריך להיות בשימוש, פשוט בקנה מידה את כל הכרכים בהתאם. לאחר ריכוז אופטימלי תא התקבל, לשטוף את התאים על ידי הוספת 10 מ&quot;ל של חיץ קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התאים ב 300 × גרם במשך 10 דקות בצנטריפוגה בקירור (2-8 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, לשאוב supernatant לחלוטין בעזרת פיפטה. אין למזוג supernatant כמו זה יוביל לאובדן התא כרכים מדויק. חזור על השלב כביסה אשר מורכב הוספת 10 מ&quot;ל של חיץ צנטריפוגה קור, והשאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו יש לנו גלולה של טוהר הרצוי, resuspend התאים μL 80 של המדיום תרבות קר. לתייג אותם, נוכל כעת להוסיף 20 μL של מגיב עכבר IL-17 תפוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים למשך 5 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת דגירה 5 דקות על הקרח, להסיר את הצינור לדלל את התאים 10 מ&quot;ל של מדיום 37 מעלות צלזיוס חם. ואז לאבטח את הצינור על Rotator Tube MACSmix ו דגירה צינור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות תחת תנועה רציפה. הגדלת הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס יהיה להתחיל מחדש הפרשת ציטוקינים. </li></ol> סימון תאים עם נוגדן IL-17 Detection (ביוטין) ו Anti-ביוטין-PE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הפרשת 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, במקום צינור מיד על הקרח. זה יעצור הפרשת ציטוקינים. מכאן ואילך זה קריטי לשמור על התאים על הקרח.עבודה עם חוצץ קר ימנע זיהום לחצות של מגיב תפוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הצינור עם חיץ צנטריפוגות קר בבית 300xg ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לשאוב supernatant לחלוטין. חזור על לשטוף את השלב עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התא resuspended ב 80 μL של חיץ קר הצינור ממוקם על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע מחייב נוקבים של הנוגדן, אנו ממליצים על תוספת של מגיב FCR 10μl חסימת לדגור על קרח דק &#39;5. אז נוסיף 20 μL של נוגדן עכבר IL-17 Detection (ביוטין) כי הוא מצומדות כדי ביוטין ו דגירה במשך 10 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב, לשטוף תאים כפי שעשינו לפני כן על ידי הוספת 10 מ&quot;ל של חיץ צנטריפוגות קר בבית 300xg ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב μl 80 של המאגר הקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μL של נוגדנים משני שלנו, Anti-ביוטין-PE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את התאים פתרון נוגדנים משנית, ושוב דגירה הצינור במשך 10 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע זה הדגירה השני הוא מלא, לשטוף את התאים עם חיץ 10 מ&quot;ל ו - קר צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה כעת ניתן resuspended ב μL 500 של המאגר הקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התאים יש להפריד לניתוח נוסף במורד הזרם, הם יכולים להיות מתויג מגנטית עם Anti-PE-microbeads ומופרד באופן ידני או אוטומטי באמצעות MACS עמודות מפרידים MACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלמנו עתה את התוויות של splenocytes והם מוכנים לניתוח. </li></ol> FACS ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח שלנו, נוכל להשוות את splenocytes מגורה unstimulated ידי cytometry הזרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ניתוח תזרים cytometric, התאים הם מוכתמים יודיד propidium על 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​לשער את התאים המתים. Analyzer ™ MACSQuant היתה עמוסה 200,000 תאים עבור כל דגימה ואנחנו עכשיו הולכים להסתכל על מגרשים פיזור של תגובתיות נוגדן יחסית הדגימות. שני השיקולים החשובים לניתוח של תאים נדירים - כמו IL-17 תאים חיובית - ידי זרימת cytometry הם: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת השער על הלימפוציטים פיזור קדימה לעומת פיזור העלילה בצד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ו gating את התאים המתים (מוכתמים propidium יודיד) ו-B-תאים (אשר עלול לגרום מכתים רקע נוקבים) כדי לשפר עוד יותר את הרגישות של זיהוי </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשנו CD4-APC נוגדנים ותאי T לזהות את הנוגדן CD45R/B220-PerCP לזהות את התאים B. אנו רואים את המאפיינים פיזור קדימה בצד של הדגימות ולהחיל השער על אוכלוסיית הלימפוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השער השני היה ליישם כדי לראות את התאים המתים מוכתם ותאי B מוכתם (ציר Y). תאים אלה אינם נכללים בניתוח תא T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוגמה זו, אשר היא למעשה שליטה שלילית שלנו, אנו יכולים לראות כי יש מעט מאוד IL-17 CD4 מפריש תאים חיובית T בדגימות unstimulated כ - 0.003% (איור 4). כאשר מסתכלים על האוכלוסייה מגורה תא T, אנו יכולים לראות מספר לא מבוטל של CD4 חיובי תאי T להפריש IL-17 - על 0.367% (איור 5A) לפני ההפרדה 60.76% לאחר הפרדה מגנטי עם MACS וטכנולוגיה (איור 5 ב). </li></ol>

כל הפרוטוקולים וגליונות נתונים זמינים www.miltenyibiotec.com. אזהרות ריאגנטים מכילים נתרן אזיד. בתנאים חומציים אזיד הנתרן התשואות חומצה hydrazoic, שהוא רעיל ביותר. תרכובות אזיד צריך להיות מדולל במים זורמים לפני השלכת. אמצעי זהירות אלה מומלץ להימנע פיקדונות אינסטלציה שבו התנאים נפץ עלול להתפתח.

תאים TH17 לשחק תפקיד אינטגרלי חסינות אדפטיבית את התגובה הדלקתית הם מרכיב מרכזי נהיגה דלקת אוטואימונית. זה וידאו ומסמכים כיצד להשתמש בעכבר של Miltenyi IL-17 Assay הפרשת - העשרה תא ערכת זיהוי (PE). כשעושים הליך זה חשוב יש הערכת התדירות של IL-17-מפריש תאים לקראת ההתחלה שלך התא. ריכוז התא המתאים במהלך תיוג ועל הפרשת ציטוקינים תקופה מונע זיהום צולבות על ידי תאים אחרים השעיה שלך מבטיחה תוצאות אמינות.

<table><tbody><tr><td>ערכה להעשרה של תאים וגילוי בבדיקה להפרשת IL-17 בעכברים (PE) </td><td>ריאגנט</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-213</td><td>&lt;קישור ל-&quot;ערכה להעשרת תאים ולזיהוי של בדיקת הפרשת IL-17 בעכברים&quot;&gt;ערכה להעשרה של תאים ולגילוי הפרשת IL-17 בעכברים&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>מצע</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-440</td><td>&lt;קישור ל-&quot;RPMI 1640, מדיה לגידול תאיים&quot;&gt;מערך RPMI 1640 (מדיום שאישורי)

תיאור:
מערך RPMI 1640 הוא מדיום בסיס המיועד לגידול של תאי למפציטים וסוגים שונים של תאי דם, וכן לסוגים מסוימים של תאי אפיתל. המדיום מכיל חומצות אמינו, ויטמינים ואנרגיה המותאמות לצורכי התאים. הוא נמכר ללא גלוטמין (L-glutamine) וללא תוספות של סרום, כדי לאפשר למשתמש להוסיף את הרכיבים הדרושים בהתאם לדרישות הספציפיות של הניסוי.

מאפיינים:
* פורמולה סטנדרטית לגידול תאי למפציטים.
* ללא L-glutamine.
* ללא סרום.
* מותאם לשימוש במערכות בידוד ומיון תאים של Miltenyi Biotec.

אחסון:
יש לשמור בקירור בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>ריאגנט</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-611</td><td>&lt;קישור ל-&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&quot;&gt;בדיקת CD4 באמצעות שיטת ה-Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS)

הערכה זו מאפשרת את הפרדתו של תאי CD4+ מתוך דגימות דם פריפרי. הקיט כולל נוגדני CD4 המסומנים בביוטין, נוגדני אנטי-מעכבי ביוטין המסומנים בחלקיקי מגנט, ועמודי הפרדה מגנטית. התהליך מבוסס על ספיחה סלקטיבית של תאי CD4+ על ידי החלקיקים המגנטיים, המאפשרים את הפרדתם מהשאר דגימת התאים.

מרכיבי המוצר:
- נוגדני CD4 המסומנים בביוטין
- נוגדני אנטי-מעכבי ביוטין מסומנים בחלקיקים מגנטיים
- עמודי הפרדה מגנטית
- תמיסות שטיפה ותמיסות שימור

פרוטוקול עבודה:
1. הכנת התאים: הכנת תרחיף של תאי מונונוקליאריים מדם פריפרי (PBMC).
2. סימון: הוספת נוגדני CD4 מסומני ביוטין לתמיסת התאים.
3. ספיחה מגנטית: הוספת נוגדני אנטי-מעכבי ביוטין מסומנים בחלקיקים מגנטיים לקשירת התאים המסומנים.
4. הפרדה: העברה של תרחיף התאים דרך עמוד הפרדה מגנטית.
5. איסוף: איסוף התאים שאינם CD4+ (החלק הבלתי קשור) ושטיפה של העמוד.
6. אלגאוציה (Elution): שחרור של תאי CD4+ מהעמוד המגנטי באמצעות תמיסת אלגאוציה.

יישומים:
- מחקרים אימונולוגיים
- ניתוח תאי T
- אבחון רפואי ומחקר קליני

מילות מפתח: הפרדת תאים, CD4, MACS, ביוטין, סיווג מגנטי, תאי T.&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD8a-FITC</td><td>ריאגנט</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-605</td><td>&lt;קישור ל-&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>תמיסת פרופידיום יודיד</td><td>ריאגנט</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;קישור אל=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;מ 용דן Propidium Iodide&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>ריאגנט לחסימת FcR, עכבר </td><td>ריאגנט</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td>&lt;קישור ל-&quot;מאגיי Blocking Reagent למסייעי FcR בעכברים&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>ערכה להסרת תאים מתים </td><td>ריאגנט</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>מסובב מבחנות MACSmix</td><td>מכשיר</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>&lt;קישור ל-&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; מפריד (Dissociator)</td><td>מכשיר</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;קישור ל-&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>ערכת התנעה ל-autoMACS Pro</td><td>מכשיר</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>&lt;קישור ל-&quot;ערכה להתחלה עבור autoMACS Pro&quot;&gt;ערכת התחלה של autoMACS Pro&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>עמודי MACS</td><td>כלי</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>&lt;קישור ל-&quot;עמודות במבט חטוף&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>מפריד MACS</td><td>כלי</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי ובידוד של viable il-17-מפריש תאים עכבר t

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

המקים הפרשת ציטוקינים Assay הטכנולוגיה מאפשרת זיהוי של ציטוקינים המופרשים על רמת תא בודד ובידוד רגיש של ציטוקינים, מפריש תאים קיימא. כדי תווית IL-17-מפריש תאים, ההשעיה של תא בודד splenocytes העכבר מוכן ועורר על 37 מעלות צלזיוס עם PMA / ionomycin לעורר הפרשת ציטוקינים. כדי לעצור את הפרשת התאים ממוקמים אז על קרח נחשפים מגיב IL-17 מלכוד נוגדן ספציפי דו הנקשרת CD45 על פני התא של לויקוציטים וכן IL-17 כפי שהוא מופרש ותפס ליד פני התא. הפרשת הוא מחדש אשר נכתבו על ידי הגדלת הטמפרטורה ל 37 ° C ו-IL-17 הוא לכוד על ידי מגיב תפוס. הפרשה היא נעצרה שוב, על ידי הצבת תאים על הקרח. כדי לזהות את IL-17 לכודים, תאים מודגרת עם IL-17-נוגדן ספציפי שנייה מצומדות כדי ביוטין ו נוגדן Anti-ביוטין-PE. תאים כעת ניתן לנתח באופן ישיר על ידי cytometry זרימה או מוכן בידוד והעשרה על ידי תיוג הבאים עם Anti-PE microbeads מצומדות.

הליך זה מתאר את זיהוי ובידוד של לויקוציטים עכבר TH17 כי להפריש באופן פעיל IL-17 על גירוי.

זיהוי ובידוד של Viable IL-17-מפריש תאים עכבר T

טכנולוגיית ה-MACS Cytokine Secretion Assay מאפשרת זיהוי של ציטוקינים מופרשים ברמת התא הבודד ובידוד רגיש של תאים חיוניים...

טכנולוגיית בדיקת הפרשת הציטוקינים max מאפשרת זיהוי של ציטוקינים מופרשים ברמת התא הבודד ובידוד רגיש של תאים חיוניים מפרישי ציטוקינים, במטרה לסמן תאים מפרישי IL 17. תרחיף של תאי לוקוציטים בודדים מעכבר מוכן ועובר גרייה בטמפרטורה של 37 °C באמצעות PMA ion mycin כדי להשרות הפרשת ציטוקינים, ולאחר מכן ההפרשה נעצרת. התאים מועברים לקירור על קרח, שם הם נחשפים לריאגנט הלכידה (catch reagent) של IL 17.ברגע שההפרשה מתחדשת על ידי העלאת הטמפרטורה ל-37 °C, ה-IL 17 נלכד על ידי ריאגנט הלכידה. נוגדן בי-ספציפי הנקשר ל-CD 45 על פני השטח של לוקוציטים ול-IL 17 בעת הפרשתו ולכידתו בקרבת פני השטח של התא, עוצר שוב את ההפרשה באמצעות הנחת התאים על קרח כדי לזהות את ה-IL 17 שנלכד. התאים מדגרים עם נוגדן שני ספציפי ל-IL 17 המשורשר ל-biotin ונוגדן anti-biotin PE. כעת ניתן לנתח את התאים ישירות באמצעות flow cytometry או להכינם לבידוד והעשרה על ידי סימון עוקב עם microbeads המשורשרים ל-anti-PE. היי, שמי אלי רנקין, אחת המדעניות ב-Miltenyi Biotec.היום אדגים לכם פרוצדורה לבידוד וזיהוי של לוקוציטים מסוג TH 17, אשר בעת גרייה מפרישים IL 17. ל-IL 17 תפקיד חשוב בחסינות הסתגלנית ובתגובה הדלקתית, והוא גם משמעותי בהנעת דלקת אוטואימונית. הרשו לי להראות לכם כיצד מתבצעת הבדיקה. עבור הפרוטוקול של היום, עלינו להכין תחילה באפר המכיל PBS עם BSA ו-2 mM EDTA. מכיוון שבועות אוויר עלולים לחסום עמודי הפרדה מסוג max, יש לנוון את הבאפר ולאחסנו בטמפרטורה של 2 עד 8 °C לפני השימוש.שנית, אנו משתמשים במצע RPMI 1640 המכיל 5% סרום עכבר. מצע התרבית לא צריך להכיל BSA או FCS, שכן תרכובות אלו ישנו את הספציפיות של גירוי התאים. לבסוף, תזדקקו לערכת העשרה וזיהוי תאים לבדיקת הפרשת IL 17 מעכבר מבית MIL 10 E Biotech.הערכה מכילה את הרכיבים הבאים: רכיב ללכידת IL 17, נוגדן לגילוי IL 17, ביוטין, anti biotin pe, ומיקרו-חרוצים של anti PE. באופן לוגי, סביר להניח שתבצעו פרוטוקול זה עם ביקורת שלילית וחיובית, כגון תאי PLE לא מעוררים, וצביעה נגדית לתאי T. לצורך ההדגמה שלנו, נתמקד בתאים מעוררים בלבד.פרוטוקול זה יבוצע תוך שימוש בטכניקה סטרילית. הפרוטוקול שלנו מתחיל בתליה של תאים בודדים של תאי SP מעכבר, אשר בודדו באמצעות gentle max associator. את ריכוז התאים יש לקבוע מראש באמצעות ספירת תאים.שקיעו את התאים ב-200 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגציה, נשאב את העלייה (supernatant) מעל המשקע באמצעות פיפטה. אין לשפוך את תוכן המבחנה כדי למנוע איבוד של המשקע. כעת יש להשעות מחדש את התאים במצע התרבית שלנו, ולאחר מכן להוסיפו לבאר; הוסיפו מצע מספיק כדי להגיע לריכוז של 10 מיליון תאים ל-milliliter ו-5 מיליון תאים ל-square centimeter.כדי לעורר תגובה חיסונית בתאים שהושעו מחדש, נוסיף ion mycin ו-PMA לדגימה ונערבב את התמיסה באמצעות פיפטינג עדין למעלה ולמטה. לאחר מכן, נסמן את הבארות בהתאם. כעת נדגרי את הדגימות למשך שלוש שעות ב-37 °C ללא ערבוב, כדי להתחיל את תקופת הגירוי.יש לבצע את אנליזת ה-IL 17 שלוש שעות לאחר תחילת הגירוי, לכן יש לתכנן זאת בהתאם. כאן אנו רואים תאי טחול של עכבר שעברו גירוי.שימו לב למורפולוגיה המובחנת ולצבירי התאים של התאים שעוברו גירוי. לצורך בהירות, נמשיך במעקב אחר התאים שעוברו גירוי בלבד. משלב זה ואילך, כדי להפסיק את ההפרשה, נאסוף את התאים שעוברו גירוי באמצעות פיפוט עדין למעלה ולמטה.לאחר מכן מעבירים את התאים מהבאר למבחנה באמצעות בופר קר ושוטפים אותם פעם שנייה. כדי להבטיח שכל התאים נאספו, מומלץ לבדוק את הצלחת תחת מיקרוסקופ. אם תאים עדיין נותרים דבוקים, ניתן לאסוף את התאים שנותרו על ידי שטיפת הצלחת.בעזרת בופר קר, ניתן להסיר גושים של תאים מתלי suspension התאים באמצעות מסנני טרום-השתתפות. מלכודת פוטנציאלית (Pitfall) של הליך זה היא זיהום צולב של ריאגנט הלכידה, שעלול להתרחש במהלך הסימון. כאשר הנוגדן הבי-ספציפי נקשר לתא T שאינו מפריש ולוכד IL 17 שהופרש מלימפוציט סמוך, נוצרים תוצאות חיוביות שגויות. כדי לעקוף בעיה זו, קריטי לקירר את התאים לפני הסימון ולעבוד עם בופר קר כדי להגביל את ההפרשה ולהאט את הדיפוזיה של IL 17, ובכך למנוע זיהום צולב זה.חשוב לציין כי זיהום צולב עלול להתרחש גם אם נוכחים יותר מ-2% של תאים המפרישים IL 17. אם ריכוז התאים המפרישים IL 17 צפוי להיות גבוה מ-2%, יש להתאים את הנפחים בהתאם. לפיכך, בנוסף לשמירה על התאים בקירור, יש לשמור אותם בריכוז מוגדר.כדי להתחיל את הליך הסימון, נשתמש ב-10 מיליון תאים בתוך מבחנה סגירה של 15 מיליליטר. במידה ויש להשתמש במספר תאים גבוה יותר, יש להגדיל את כל הנפחים בהתאם. לאחר השגת ריכוז התאים האופטימלי, יש לשטוף את התאים על ידי הוספת 10 מיליליטר של באפר קר.כעת סבבו את התאים ב-300 Gs למשך 10 דקות בצנטריפוגה מקוררת. לאחר הצנטריפוגציה, שאבו את העליון (supernatant) באופן מלא באמצעות פיפטה. אין לשפוך את העליון, שכן הדבר יוביל לאובדן תאים ולנפחים לא מדויקים. חזרו על שלב השטיפה, הכולל הוספת 10 milliliters של בופר קר, צנטריפוגציה ושאיבה.כעת, לאחר שיש לנו משקע בדרגת הטוהר הרצויה, השביה מחדש את התאים במיקרוליטרים של מצע גידול קר כדי לסמן אותם. כעת נוסיף 20 µL של רכיב לכידה (catch reagent) של mouse IL 17. דגרו את התאים במשך חמש דקות על קרח.לאחר תקופת דגירה של חמש דקות על קרח, הוצא את המבחנה ודלל את התאים ב-10 milliliters של מצע חם בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. לאחר מכן, אחסן את המבחנה על מסובב המבחנות max mix ודגור את המבחנה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 45 דקות.תחת תנועה רציפה, העלאת הטמפרטורה ל-37 °C תפעיל מחדש את הפרשת הציטוקינים. לאחר תקופת הפרשה של 45 דקות ב-37 °C, יש להניח את המבחנה מיד על קרח. פעולה זו תעצור את הפרשת הציטוקינים.מנקודה זו והלאה, קריטי לשמור על התאים על קרח. עבודה עם באפר קר תמנע זיהום צולב של ריאגנט הלכידה. מלאו את המבחנה בבאפר קר וסבבו בצנטריפוגה ב-300 Gs בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות Celsius למשך 10 דקות.שאבו את העליון (supernatant) לחלוטין. חזרו על שלב השטיפה פעם אחת נוספת. השעיריה של התאים (cell pellet) תסבסס ב-80 µL של בופר קר, והמבחנה תונח על קרח.כדי למנוע קישור לא ספציפי של הנוגדן, אנו ממליצים להוסיף 10 µL של סוכן חסימת FCR ולהדגיר על קרח למשך חמש דקות. לאחר מכן נוסיף 20 µL של נוגדן גילוי ל-IL 17 של עכבר המצומד לביוטין ונהדגיר למשך 10 דקות על קרח. שוב, נשטוף את התאים כפי שעשינו קודם לכן על ידי הוספת 10 mL של בופר קר וסבב בצנטריפוגה ב-300 Gs בטמפרטורה של 2 עד 8 °C למשך 10 דקות.כעת יש לשאוב את הנוזל ולערבב שוב את משקע התאים ב-80 µL של בופר קר, ולהוסיף 20 µL של הנוגדן המשני שלנו, Anti biotin pe. ערבבו את התאים עם תמיסת הנוגדן המשני והדגירו שוב את המבחנה למשך 10 דקות על קרח.עם סיום הדגירה השנייה, יש לשטוף את התאים עם 10 milliliters של בופר קר ולצנטריפוג. כעת ניתן לתלות מחדש את המשקע ב-500 microliters של בופר קר. אם יש להפריד את התאים לצורך אנליזות המשך, ניתן לסמן אותם מגנטית באמצעות חרוזי מיקרו anti PE ולהפרידם באופן ידני או אוטומטי באמצעות max columns ו-max separators.השלמנו כעת את סימון תאי ה-SPLU שלנו והם מוכנים לניתוח. נשווה בין תאי ה-SP המעוררים לבין הבלתי מעוררים באמצעות ציטומטריית זרימה לפני ההרצה. תאי העובדה נצבעים ב-propidium iodide בריכוז 0.5 µg/mL כדי לסנן תאים מתים.הציטומטר הזרימה נטען עם 200,000 תאים עבור כל דגימה, וכעת נבחן את תרשימי הפיזור של תגובתיות נוגדנים יחסית בדגימות. שני שיקולים חשובים לניתוח של תאים נדירים, כגון תאים חיוביים ל-IL 17, באמצעות ציטומטריה של זרימה הם הגדרת שער (gate) ללימפוציטים בתרשים של פיזור קדמי (forward scatter) לעומת פיזור צדי (side scatter), והוצאה מהשער של תאים מתים שצבעו עם propidium iodide ותאי B שעלולים לגרום לצביעה רקעית לא ספציפית. כדי לשפר עוד יותר את רגישות הגילוי.כאן אנו משתמשים בנוגדן CD4 APC כדי לזהות תאי T ובנוגדן CD45RB 20 per CP כדי לזהות תאי B. כדי לזהות את תאי ה-B, אנו בוחנים את תכונות הפיזור הקדמי והצדי (forward and side scatter) של הדגימות ומחילים שער (gate) על אוכלוסיית הלימפוציטים. שער שני הוחל כדי לזהות את התאים המתים הצבועים ואת תאי ה-B הצבועים על ציר ה-Y.תאים אלו מוחרגים מניתוח תאי ה-T. בדוגמה זו, המהווה למעשה את הביקורת השלילית שלנו, ניתן לראות שישנם מעט מאוד תאי T חיוביים ל-CD4 המפרישים IL 17 בדגימות שלא עוברו בגירוי, כ-0.003%. במבט על אוכלוסיית תאי ה-T המגורים, ניתן לראות מספר משמעותי של תאי T חיוביים ל-CD4 המפרישים IL 17, כ-0.367% לפני ההפרדה ו-60.76% לאחר הפרדה מגנטית בטכנולוגיית max. הצגנו לכם כעת באמצעות תיעוד וידאו כיצד להשתמש בערכה להעשרה וזיהוי תאים עבור בדיקת הפרשת mouse IL 17 של mul 10 biotech באמצעות pe.החלק החשוב ביותר בהליך זה הוא קבלת מושג לגבי התדירות של תאים המפרישים IL 17 באוכלוסייה ההתחלתית. ריכוז תאים נכון יבטיח שיהיו פחות זיהומים צולבים במהלך הסימון ותקופת הפרשת הציטוקינים, ובכך יבטיח תוצאות מהימנות. זהו כל הפרוצדורה.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

detection-and-isolation-of-viable-mouse-il-17-secreting-t-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי T רוצחים טבעיים אינווריאנטיים, הידועים גם בשם תאי iNKT. ההליך מתחיל בהזרקת גליקוליפיד סינתטי לעכבר כדי לעורר את ההפעלה וההתרבות של תאי iNKT בטחול. לאחר מכן, מתלים חד-תאיים מוכנים מהטחול ומודגרים עם קומפלקסים מזהי תאי iNKT המסומנים בפלואורופורים, ולאחר מכן הפרדה מבוססת חרוזים מגנטיים, כדי לבודד את תאי ה-iNKT.

בידוד תאי T רוצחים טבעיים אינווריאנטיים ממודל עכבר

עם פונקציות מפעיל להבדיל מתת תא T אחר, תאי Th17 היו מעורבים באופן מרכזי באוטואימוניות דלקתיות. במבחנה פרוטוקול בידול Th17 זו מספק אמצעי כדי לקבוע אם לימפוציטים מסוג CD4 + T נאיביים יכולים להתמיין לתאי Th17, ולבחון את תפקידם באוטואימוניות ותגובת מארח נוסף.

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

ניתוח במבחנה של רקומבינציה של מתג מחלקה בעכברים הוא מאתגר עקב מולקולות IgE ציטופיליות הקשורות לקולטני Fc על פני תאי B.  אנו מתארים שיטה לזיהוי IgE באמצעות מחשוף בתיווך טריפסין של IgE קשור לפני השטח לפני קיבוע וחדירות לצביעה פלואורסצנטית ציטופלזמית.

איתור של True IgE להביע תאי Lineage העכבר B

תאי T נאיביים CD4+ מקוטבים לתת-קבוצות שונות בהתאם לסביבה בזמן ההפעלה.  ניתן להשיג את ההתמיינות של תאי CD4+ T נאיביים לתת-קבוצות אפקטורים שונות במבחנה באמצעות הוספת גירויים של קולטני תאי T ואותות ציטוקינים ספציפיים.

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

תת-קבוצות תאים דנדריטיות נפרדות קיימות כאוכלוסיות נדירות באיברי לימפה, ולכן הן מאתגרות לבידוד במספרים ובטוהר מספיקים לניסויים אימונולוגיים. כאן אנו מתארים שיטת יעילות גבוהה ותפוקה גבוהה לבידוד של כל תת-הקבוצות העיקריות הידועות כיום של תאים דנדריטיים של טחול עכבר.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח הפנוטיפ של תאי T רגולטוריים (Treg) שבודדו מעכברים נגועים בנגיף כוריומנינגטיס לימפוציטי נאיבי וכרוני. בנוסף, אנו מספקים תהליך להערכת הפעילות המדכאת של תאי ה-Treg.

פנוטיפי אנליזה פונקציונלית של תאים תקינה T הופעל מבודדת מן עכברים הנגועים בנגיף לימפוציטית כרונית Choriomeningitis

אנו מתארים כאן מודל של עכבר מדווח טרנסגני כדי לדמיין את התאים המייצרים IL-22 בתוך רקמות עכבר שונות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעקוב אחר מיקומם של ציטוקינים אחרים או חלבוני מזכיר בעכבר.

ויזואליזציה של לימפוציטים-22-להביע IL באמצעות עכברים Reporter

תאי לימפה מולדים מקבוצה 2 (ILC2s), המעורבים בדלקת מסוג 2, משתתפים בעיקר בתגובה לזיהום הלמינת'ס, מחלות אלרגיות, הומאוסטזיס מטבולי ותיקון רקמות. במחקר זה מודגם הליך לבידוד ILC2s מרירית האף וזיהוי הביטוי של CD226.

בידוד תאי לימפה מולדים מקבוצה 2 מרירית האף של העכבר כדי לזהות את הביטוי של CD226

פרוטוקול זה מתאר את ההתמיינות של תאי CD4+ T נאיביים לתאי Th17 פתוגניים במבחנה. באופן ספציפי, בשילוב עם גישה מבוססת ציטומטריה של זרימה מרובת פרמטרים, ניתן לקבל 90% טוהר של תאי Th17 פתוגניים מתאי T נאיביים CD4+ באמצעות שיטת התמיינות זו.

התמיינות חוץ גופית של תאי T נאיביים CD4+ לתאי Th17 פתוגניים בעכבר

המחקר הנוכחי מציג פרוטוקולים להערכת המחויבות לגורל מוקדם של תאיT FH ספציפיים לווירוס ומניפולציה של ביטוי גנים בתאים אלה.

גישה להבחנה מוקדמת של תאי T CD4+ עוזר זקיקים ספציפי לווירוס בעכברים נגועים ב- LCMV חריף

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד וזיהוי אוכלוסיות נדירות של תאי T ספציפיים לאנטיגן בריאות עכברים באמצעות העשרת תאי T מבוססי חרוזים מגנטיים וטטרמרים מסוג peptide:major histocompatibility complex (MHC).

זיהוי תאי T נדירים ספציפיים לאנטיגן מריאות עכבר באמצעות פפטיד:טטרמרים מורכבים עיקריים של היסטותאימות

למד לזהות ולבודד תאי T עכבריים המפרישים IL-17 באמצעות מערכת ניתוח ציטוקינים ברמת התא הבודד. שיטה זו משפרת דיוק בחקר תגובות חיסוניות ומחלות אוטואימוניות.

זיהוי ובידוד של Viable IL-17-מפריש תאים עכבר T

גלה סרטונים נוספים