ייחוס ביולוגי של נשאי ננו-תרופות: יישומים של SEM

1. הזרקת חלקיקים וקצירת איברים

1. הזרק חלקיקים לעכבר מרדים תוך ורידי כדי לאפשר פילוח פסיבי.
2. בנקודות הזמן הרצויות, כלומר, 1, 4 ו 8 שבועות, לאחר הזרקה, להמית באופן אנושי את העכברים על פי הנחיות האגודה הרפואית הווטרינרית האמריקאית (AVMA).
3. פתח את חלל הגוף והסר בניתוח את איברי העניין. מניחים את האיברים ב-10% פוספט חוצץ פורמלין במיכל פוליפרופילן עד להכנת דגימה.

2. הכנת דגימת רקמות

1. השתמש במלקחיים כדי להעביר את רקמת העכבר מהקיבוע לתחכון פוספט חוצץ (PBS). רוק המדגם במשך 30 דקות, החלפת PBS כל 10 דקות.
2. הסר את הרקמה ולייבש עם קימבפה. לאחר מכן מניחים אותו בתבנית פלסטיק המכילה תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT). יש לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
3. למחרת, להעביר את המדגם להקפאה ולהגדיר את הטמפרטורה -23 °C (70 °F).
4. סמן שקופיות עם סוג האיבר וגודל הננו-חלקיקים, והצב אותן על מדף בקריוסטט.
5. מכסים את צ'אק הקריוסטט עם OCT ומניחים את הדגימה למעלה. מנמיכים את הבוכנה מעל המדגם ומאפשרים לו להתפרק במשך 3-5 דקות.
6. הר את הצ'אק על מחזיק הדגימה וכוון אותו כך שהלהב יוכל לחתוך ישר על פני הדגימה הקפואה. קרב את הדגימה ללהב לעמידה מחוספסת. הגדר את העובי ל 30 מיקרומטר לפרוס כמה חלקים עד פרוסה לחתוך באופן שווה מיוצר.
7. עבור לפונה בסדר על ידי הפחתת עובי המקטע ל 7-8 מיקרומטר. אסוף מקטע פרוס על-ידי הקשה על שקופית זכוכית מסומנת על הפרוסה. מקם שתי שקופיות על כל שקופית ואחסן בארון תקשורת של שקופיות. אפשר להתייבש בטמפרטורת החדר.
8. לאחר יבש, לייבש את הדגימות על ידי טבילת מתלה שקופיות ב 50% אתנול במשך 3 דקות כדי להסיר OCT. לאחר מכן להעביר את המדף ל 80% אתנול במשך 3 דקות לפני הצבת המדף ביחס 1:1 של מתנול קר לאצטון במשך 10 דקות ב -20 °C (70 °F).
9. הסר את מתלה השקופיות ולנקז את הממס עודף על מגבת נייר. לאחר 20-30 דקות, מניחים את השקופיות בקופסת שקופיות ומאחסנים במקפיא בטמפרטורה של -20 °C עד להדמיה.

3. הדמיה ברזולוציה גבוהה באמצעות SEM ו- EDS

1. הכן את המדגם כמתואר ב"הדמיית SEM של דגימות ביולוגיות". לאחר מכן טען את הדגימה לתוך SEM.
2. הפעל את ה- SEM והתאם את מרחק העבודה לסביבות 5 מ"מ ואת זרם המתח והקרן המאיצה ל- 25 keV, שבדרך כלל יהיה גבוה מדי עבור מדגם ביולוגי. עם זאת, המדגם מצופה מוליכות והגנה.
3. התחל הדמיה וזום סביב 1,000-2,000X הגדלה כדי לראות את המבנים שיכילו את הננו-חלקיקים. שים לב כי ללא זיהוי פיזור אחורי (BSD) לא ניתן להבחין ביניהם מתחת לעומק מסוים.
4. הכנס את ה- BSD תחת אותם פרמטרים והזז את השלב בכיוון z לאותו מרחק עבודה כמו קודם.
5. התחל הדמיה סביב אותה הגדלה ולבדוק כי אתה יכול לראות ניגודיות גבוהה בנוכחות חלקיקים. שמור את התמונות.
6. השתמש בתצורות BSD שונות (שבהן המטענים בגלאי מתיישרים) כדי לבחור את התצורה המציגה את הניגודיות הגבוהה ביותר עבור הננו-חלקיקים.
7. התקרבות לאזור ניגודיות גבוהה המציג ננו-חלקיק או גוש של חלקיקים.
8. פתח את המצלמה^השנייה של התא והצג בעת הכנסת ה- EDS למערכת על-ידי לחיצה על לחצן החוץ בקובץ המצורף של SEM. לאחר EDS הוא קרוב אבל לא נוגע BSD או האקדח, לשחרר את הכפתור.
9. פתח את התוכנית האצטקית במחשב EDS (עדיין בתחנת עבודה) ורכוש תמונה מה- SEM. השתמש בשיטת "נקודה וירה" כדי ללחוץ על אזור צפוף מאוד בניגוד וננו-חלקיקים.
10. EDS יציג את הספקטרום של צילומי רנטגן אופייניים מאותה נקודה. חפשו פסגות בריום וטיטניום להזדהות בגרף. זה מאשר כי מה שאתה מסתכל הם אכן חלקיקים ולא כל סוג של זיהום.
11. חזור לדגימה והשתמש בתוכנת האטלס כדי למפות את גבולות האיבר בשקופית. בחר את פרוטוקול "עוגב" ליצירת תמונת פסיפס של האזור, ותן לו לפעול (פעולה זו יכולה להימשך מספר שעות לכל היותר).
12. לאחר התמונה המורכבת נוצר ותפר על ידי התוכנה, לייצא אותו כקובץ Tif.
13. פתח את קובץ Tif ב- ImageJ, תוכנת קוד פתוח, והתאם ערכי סף ניגודיות כדי להדגיש את האזורים של ניגודיות גבוהה מאוד (כלומר, הננו-חלקיקים). השתמש בפונקציות מוכללות כדי לכמת את נפח הננו-חלקיקים באמצעות גודל הפיקסלים המוגדר בפרוטוקול Organ (צריך להיות בסביבות 100 ננומטר).
14. בעוד הליך זה מתייחס רק מדגם 1 שבוע של ריאה העכבר, הליך זה חוזר על עצמו עם דגימות משבועות אחרים ואיברים אחרים כדי להרכיב גרף המציג התפלגות.
15. לאחר חישוב ההפצה הביולוגית עבור כל איבר עבור כל שבוע, גרפים biodistribution יציגו את השינויים ב- biodistribution וריכוז של חלקיקים במהלך 8 השבועות. אלה מראים את ריכוז השיא וגם מספקים מידע על כמה זמן לוקח עבור חלקיקים לנקות מן האיבר.