הדמיית SEM של דגימות ביולוגיות

מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, או SEM, משמש לעתים קרובות להדמיית חומרים ביולוגיים בקנה מידה ננו. מיקרוסקופים אופטיים, המשתמשים באור כדי לצלם דגימה, משמשים רבות להדמיה לא הרסנית של דגימות ביולוגיות, אולם הרזולוציה ועומק השדה שלהם מוגבלים, ולכן נעשה שימוש ב-SEM על מנת להשיג רזולוציה גבוהה יותר עד ננומטר אחד.

ב-SEM, קרן אלקטרונים ממוקדת דרך סדרה של עדשות מעבה, אשר לאחר מכן פוגעת בדגימה. כאשר הקרן פוגעת בדגימה, אלקטרונים על פני השטח מתפזרים ונמדדים על ידי הגלאי.

בסרטון זה, נדון כיצד SEM עובד, נדגים כיצד לדמות דגימה ביולוגית במעבדה, ולבסוף, נציג כמה טכניקות המשמשות להדמיית דגימות רגישות.

מיקרוסקופ אלקטרונים סורק משתמש בקרן אלקטרונים באנרגיה גבוהה, הנוצרת על ידי אקדח אלקטרונים המצויד בקתודה נימה. האלקטרונים הנוצרים נדחפים לעבר האנודה ולאחר מכן ממוקדים באמצעות עדשות מעבה לפני שהם נכנסים לעדשת האובייקט. עדשת האובייקט מכוילת כדי למקד את הקרן על הדגימה, שם היא נסרקת על פני השטח. האינטראקציות של האלקטרונים עם האטומים בדגימה משמשות לחקר הטופוגרפיה, הרכב היסודות והגבישיות של הדגימה. כאשר אלומת האלקטרונים הפוגעת פוגעת לפני השטח, היא פולטת אלקטרונים משניים ומפוזרים לאחור. אלקטרונים משניים הם אלקטרונים באנרגיה נמוכה הנפלטים מהדגימה קרוב לפני השטח ומספקים מידע טופוגרפי.

אלקטרונים מפוזרים לאחור, לעומת זאת, משתקפים בכיוון ההפוך של האלומה הפוגעת. עוצמת האינטראקציה עולה עם הגדלת המשקל האטומי, מה שמאפשר למשתמש להבחין בהבדלים בהרכב. יש צורך בשיקול מיוחד כדי לדמות דגימות ביולוגיות עם SEM, מכיוון ש-SEM משתמש בוואקום גבוה, ולכן יש לייבש תחילה דגימות ביולוגיות, שבדרך כלל יש להן תכולת מים גבוהה. זה יכול לגרום לקריסת המבנה של דגימות רגישות, במיוחד תאים. לפיכך, תאים מטופלים בחומר מקבע, שוטפים ואז מיובשים לאט על ידי שטיפה בכמויות הולכות וגדלות של אתנול.

עבור חומרים ביולוגיים קשיחים, כגון פיגום רקמת הקולגן-הידרוקסיאפטיט המשמש בהדגמה זו, הדגימה מיובשת במשך תקופה של מספר ימים בוואקום גבוה.

לבסוף, מכיוון שהדמיית SEM טיפוסית דורשת משטח מוליך, דגימות ביולוגיות מצופות לעתים קרובות בשכבה דקה של מתכת לפני ההדמיה. כעת, לאחר שדנו כיצד SEM עובד וכיצד להכין דגימה ביולוגית להדמיה, בואו נסתכל כיצד להכין ולדמות פיגום רקמת קולגן-הידרוקסיאפטיט.

ראשית, הרכיב את דגימת הביו-חומר על בדל SEM באמצעות סרט פחמן מוליך וודא שהדגימה יבשה ואין לה זיהום על פני השטח.

לאחר מכן, הנח את הדגימה המותקנת בתא של ציפוי מקרטע, שאב את התא וצפה את הדגימה למשך כ-40 שניות כדי להשיג ציפוי דק בעובי של ארבעה עד שישה ננומטר של מתכת, במקרה זה זהב, עם כיסוי הולם. לאחר הציפוי, הסר את הדגימה והשתמש בסרט מוליך כדי לחבר את הבדל לחלק העליון של הדגימה, המצופה כעת במתכת מוליכה.

לבסוף, הרכיב את הבדל על SEM stage והדק את הבורג בצד. כעת המדגם מוכן לתמונה עם SEM. ראשית, טען את השלב לתא ה- SEM ואטום את הדלת, ואז לחץ על כפתור ההעברה כדי לפתוח את המעבר מתא הטעינה לוואקום. לאחר שהדלת הפנימית פתוחה, הברג את מוט המתכת לתוך ה-stagה ודחף את הדגימה לתוך תא הוואקום, ולאחר מכן הברג את מוט המתכת ומשוך אותו במלואו לתוך תא העומס, ולאחר מכן לחץ על Store כדי לסגור את תא הוואקום.

עכשיו בואו נדמיין את הדגימה באמצעות SEM.

ראשית, הזיזו את השלב באמצעות הבקר ונווטו את הדגימה לתוך שדה הראייה, ואז הזיזו את הדגימה אנכית עד שמרחק העבודה יהיה חמישה עד 10 מילימטרים. הפעל את אלומת האלקטרונים ובחר את הגלאי לאלקטרונים משניים, הגדר את האלומה לחמישה קילו-אלקטרון וולט בתחילה, ולאחר מכן הגדל עד 20 עד 30 קילו-אלקטרון וולט לפי הצורך. אם התמונה אינה ברורה, סובב את כפתורי המיקוד, הבהירות והניגודיות עד להופעת תמונה ברורה.

השתמש בניווט הבמה ובכיווני X ו-Y כדי לאתר נקודה חדשה בדגימה, ולאחר מכן הגדל את ההגדלה עד שהתכונות הרצויות נראות לעין. התאם את המיקוד, הניגודיות והבהירות לפי הצורך כדי לשפר את איכות התמונה. ייתכן שיהיה עליך להפחית את מהירות הסריקה ולהפעיל את ממוצע הקווים כדי לקבל תמונה טובה יותר, ולאחר מכן לשמור את התמונה.

תמונות ה-SEM חושפות מבנה תלת מימדי ונקבובי מאוד עם מאפיינים סיביים קטנים מ-25 מיקרון. יהיה קשה לדמיין את התכונות הללו באמצעות מיקרוסקופיה אופטית, מכיוון שלמיקרוסקופיה אופטית יש עומק שדה נמוך בהרבה.

ישנם אתגרים רבים הקשורים להדמיה של מבנים ביולוגיים עם SEM, כולל קריסת מבנה או נזק מאלומת האלקטרונים באנרגיה גבוהה. בואו נסתכל כעת כיצד מיושמת טכניקת ה-SEM הכללית על סוגים אלה של דגימות רגישות. יש לטפל במבנים ביולוגיים עדינים, כמו רקמות צמחים צעירות אלה, או כאלה עם תכולת מים גבוהה, בתהליך קיבוע לפני ההדמיה.

מריסטמים פרחוניים אלה טופלו מיד בתמיסת קיבוע פורמלין/חומצה אצטית שהוכנה טרייה. הרקמה הקבועה נותחה באתנול, הונחה במיכל רשת ויובשה באמצעות סדרת אתנול של 70%, 80%, 90% ו-100% אתנול. לבסוף, רקמות הצמח יובשו באמצעות מייבש נקודה קריטית, הורכבו וצופו בציפוי מתכת דק.

לאחר הדמיית SEM ברור כי המבנים הלא מטופלים נפגעו קשות בתהליך הייבוש והראו התמוטטות ניכרת במבנה, ואילו אלה שתוקנו שמרו על המבנה המקורי שלהם. לחלופין, ניתן לדמות תאים ודגימות אחרות עם תכולת מים גבוהה באמצעות SEM סביבתי, או ESEM. ESEM משתמשת באלומת אלקטרונים באנרגיה גבוהה שנסרקת רסטר על הדגימה, כמו ב-SEM קונבנציונלי, עם זאת, היא מאפשרת הדמיה של דגימות רטובות או לא מצופות על ידי שמירה על סביבה גזית בתוך החדר.

זה נעשה על ידי הפרדת תא הוואקום הגבוה המכיל את אקדח האלקטרונים מתא הדגימה באמצעות שני פתחים. אלומת האלקטרונים אכן סובלת מהפסדים משמעותיים עקב פיזור על ידי מולקולות גז, אך בדרך כלל היא אנרגיה גבוהה מספיק להדמיה. כאן, תאים גודלו על שבב סיליקון, תפקדו עם נקודות קוונטיות ותוקנו באמצעות פרוטוקול קיבוע גלוטרלדהיד. התאים צולמו במים ומראים את המבנה הלא מכווץ של התא עם נקודות קוונטיות בודדות הנראות על פני התא.

זה עתה צפיתם במבוא של JoVE להדמיה של ביו-חומרים באמצעות SEM. כעת עליך להבין כיצד SEM עובד, כיצד מכינים ומדמים דגימות ביולוגיות, כמו גם כמה יישומים של הטכניקה למבנים רגישים.

תודה שצפית!