אליספוט אסאי: זיהוי של IFN-γ הפרשת טחול

בדיקת Immunospot מקושרת לאנזים, או ELISPOT, היא שיטה לניתוח התגובה החיסונית לפתוגן או נזק לתאים. זה מאפשר לכמת את ההפעלה של תאי חיסון שונים על ידי זיהוי חלבונים ספציפיים שהם מפרישים. לדוגמה, ELISPOT משמש בדרך כלל למדידת תגובות תאי T בעת חשיפה לאנטיגן זר על ידי זיהוי ציטוקינים מופרשים.

עבור בדיקת ELISPOT מבוססת ציטוקין, התהליך מתחיל בציפוי של מיקרו-פלטת ELISPOT בנוגדני לכידה, הספציפיים לציטוקין המטרה. לאחר ציפוי הנוגדנים, תאי T מתווספים לבארות ומגורים על ידי גורם חיצוני, כמו נוגדן נגד CD3, למשל. לאחר מכן התאים מפרישים את ציטוקין המטרה, אשר מיד משתתק על ידי נוגדן הלכידה. מכיוון שהחלבון נלכד מיד לאחר ההפרשה מתאים חיים, ללא דילול או פירוק, לבדיקה זו יש דיוק גבוה. לאחר שציטוקין המטרה משותק, מתווסף נוגדן זיהוי, שנקשר גם לציטוקין שנלכד.

ניתן להשתמש בטכניקת ELISPOT גם כדי לכמת תאי זיכרון B לאחר זיהום או חיסון על ידי ניתוח הייצור שלהם של נוגדנים ספציפיים. ב-ELISPOT מבוסס נוגדנים, נעשה שימוש באנטיגן ספציפי במקום נוגדן לשלב הלכידה, שבו האנטיגן ייקשר לצלחת, או בשלב הזיהוי, שבו האנטיגן מזהה את נוגדן המטרה לאחר הלכידה. בכל הווריאציות של התהליך, עבור תאי T או תאי B, נוגדן הזיהוי או האנטיגן הוא ביוטיניליזציה, מה שמאפשר לו להיקשר לאנזים זיהוי מצומד סטרפטווידין, כגון חזרת פרוקסידאז. לאחר מכן, עם הוספת המצע של הפרוקסידאז, AEC, נוצר משקע כהה ובלתי מסיס. משקע זה מסמן את מיקום החלבון שנלכד, וכל תא הפרשה מביא לנקודה נראית לעין, אותה ניתן לכמת באמצעות קורא ELISPOT או מיקרוסקופ. גודל הכתמים הוא הערכה יחסית של כמות החלבון המופרש מכל תא. בדיקה זו יכולה לזהות תגובות חיסוניות מתאים בודדים, אפילו בתת-אוכלוסיות קטנות יחסית של תאים מפרישים, מה שהופך אותה לשימושית לחקר תגובות חיסוניות ברמה התאית.

בסרטון זה תלמדו כיצד לבצע בדיקת ELISPOT ולאחר מכן לכמת את הכתמים המייצגים את תאי ההפרשה.

לאורך כל הניסוי, הקפידו על תנאים סטריליים על ידי עבודה במכסה המנוע הלמינרי ולבישת כפפות.

כל החישובים בפרוטוקול זה מבוססים על הנפח הדרוש לצלחת אחת של 96 בארות.

ראשית, יש לדלל את הנוגדן ללכידת ציטוקינים. לשם כך, העבירו 10 מיליליטר חיץ לצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר. לאחר מכן, השתמש בפיפטה כדי להוסיף 10 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר של נוגדן חד שבטי למאגר כדי ליצור תמיסה עם ריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר. לאחר מכן, שפכו את תמיסת נוגדני הלכידה למאגר סטרילי, ובעזרת פיפטה רב-ערוצית, הפיצו 100 מיקרוליטר לכל באר של צלחת ELISPOT של 96 בארות.

מכסים את הצלחת במכסה צלחת, אוטמים אותה למניעת אידוי ודוגרים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, חשוף את לוחית ה-ELISPOT במכסה הזרימה הלמינרית. הפוך במהירות את הצלחת על מגבונים סטריליים כדי להסיר את תמיסת נוגדני הלכידה מכל באר. לאחר מכן, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים לכל באר. שלב זה יחסום כריכה לא ספציפית במהלך הבדיקה. החזר את מכסה הצלחת למקומו ודגר באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

בזמן שהצלחת דגירה, הכינו תמיסת מיטוגן פי 2 על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של PMA ו-20 מיקרוליטר של יונומיצין ל-10 מיליליטר של מדיום תרבית תאים כדי להשיג ריכוז סופי של 15 ננוגרם למיליליטר PMA ויונומיצין מיקרו-מולרי אחד.

יש להכין מתלים סלולריים של טחול עכבר בשלב זה גם במכסה מנוע סטרילי. בעזרת מיקרוסקופ והמוציטומטר, מודדים את ריכוז התאים ומתאימים את הנפח הכולל עד להגעה לריכוז מלאי של שני מיליון תאים למיליליטר.

לאחר השלמת הדגירה, הפוך במהירות את הצלחת על מגבונים סטריליים כדי להסיר את מדיום תרבית התאים מכל באר. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר מתמיסת מלאי המתלים הסלולרית המוכנה לבארות בשורה העליונה של צלחת ELISPOT. הגדר את הניסוי בשלוש עותקים, כך שכל סוג תא שנבדק יהיה מצופה בקבוצה של שלוש עמודות מקובצות. מתחת לכך, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים רגיל לחמש השורות הבאות של הצלחת, מתחת לשורות המכילות תמיסת מלאי סלולרי.

לאחר מכן, בצע דילול סדרתי על ידי פיפטינג של 100 מיקרוליטר של מתלה התא מהשורה העליונה לשורה שמתחת, תוך פיפטינג עדין של התמיסה למעלה ולמטה כדי לפזר את התאים באופן שווה. חזור על תהליך זה עבור השורות הנותרות, העבר 100 מיקרוליטר מהשורה הקודמת לשורה למטה בכל שלב, והמשיך עד לדילול סדרתי של השורה החמישית. השאירו את השורה השישית עם מדיום תרבית תאים בלבד, כדי לשמש כבקרה. כדי לעורר את התאים בבארות הניסוי של הצלחת, הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת המיטוגן המוכנה למתלים התאיים בכל באר שורות אחת עד חמש. הקפידו להשאיר את השורה השישית, שתשמש כבקרה, ללא גירוי. החזירו את המכסה למקומו ודגרו על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 24 עד 48 שעות.

הכן את הנוגדן המדולל לזיהוי אנטי-ציטוקין. ראשית, הכינו 50 מיליליטר של מדלל בדיקה על ידי הוספת 5 מיליליטר של 10% סרום בקר עוברי ל-45 מיליליטר PBS. לאחר מכן, יש לדלל את הנוגדן המגלה לריכוז של 2 מיקרוגרם למיליליטר בדילול בדיקה. כמו כן, הכינו 20 עד 25 מיליליטר של מאגר כביסה בשלב זה, על ידי ערבוב 0.05% Tween-20 ו-PBS.

לאחר השלמת הדגירה, פתחו את מכסה הצלחת והפכו אותה במהירות כדי להסיר את כל הנוזלים מהבארות. שטפו את הצלחת על ידי הוספת כ-200 מיקרוליטר של מאגר כביסה לכל באר. הוצא את הנוזל הזה על ידי היפוך מהיר והטלת הצלחת מעל כיור. חזור על תהליך זה ארבע פעמים נוספות בסך הכל חמש כביסות. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת נוגדני הזיהוי המדוללת לכל באר, החזר את המכסה ודגירה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. לאחר הדגירה, הוצא את תמיסת נוגדני הזיהוי מבארות הצלחת על ידי היפוך והצלחת מעל הכיור.

כמו קודם, שטפו את הצלחת חמש פעמים עם מאגר כביסה, והוציאו את הנוזל בין כל שטיפה. לאחר הכביסה הסופית מכינים את תמיסת הסטרפטווידין-חזרת פרוקסידאז על ידי דילול לפי הוראות היצרן. לאחר מכן, כשבארות הצלחת ריקות, הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת סטרפטווידין מדוללת - חזרת פרוקסידאז לכל באר. מניחים את המכסה בחזרה על הצלחת ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.

לאחר הדגירה, לא יותר מ-15 דקות לפני השימוש, הפעל תמיסת מצע AEC שהוכנה מראש. השליכו את תכולת הבארות ושטפו את הצלחת חמש פעמים עם מאגר כביסה, כמו קודם. לאחר מכן, הוסף מיד 100 מיקרוליטר של תמיסת מצע AEC מוכנה לכל באר. השאירו את הצלחת בטמפרטורת החדר להתפתחות למשך כ-10 עד 20 דקות, תוך ניטור התפתחות הנקודה. כתמים אלה יופיעו כעיגולים קטנים וכהים על פני הבארות. לאחר מכן, עצור את התגובה על ידי שטיפת הצלחת במים והטלתה על הכיור. כתם את הצלחת על מגבות נייר והניח לייבוש באוויר למשך הלילה או עד לייבוש מלא. הסרת מגש הפלסטיק מתחת לצלחת תקל על הייבוש. לאחר הייבוש, הכתמים מוכנים לספירה בעזרת קורא צלחות אוטומטי.

כאן נעשה שימוש בקורא CTL ImmunoSpot, אך ניתן להתאים פרוטוקול זה לכל קורא. לאחר מכן, פתח את תוכנית CTL ולחץ על ספירת סריקה. לחץ על הוצא כדי שהמגש יימשך מהמכונה. לאחר מכן, הסר את מתאם הפלסטיק ויישר את שורה A על לוחית ה-ELISPOT והמתאם. בחר שם קובץ ומיקום עבור הקובץ לשמירה וטען את הלוחית והמתאם על המגש. לחץ על טען בתוכנה וסגור את הדלת בצד המכונה. לאחר מכן, לחץ על התחל לאחר הספירה. ודא שהקובץ נשמר ולאחר מכן פתח את תוכנת בקרת האיכות QC כדי לנתח את הנתונים ולספור את מספר הכתמים. ייצא נתונים אלה כקובץ Excel. לאחר השלמת הניתוח, לחץ על הוצא כדי לאחזר את הצלחת.

בניסוי זה, תאים מעכברים מסוג בר ועכברים נושאי גידול צופו ונותחו עבור גמא IFN. שימו לב שמספר הכתמים יורד עם ירידה בריכוז התאים. בדרך כלל, נתוני ELISPOT מוצגים כמספר ספירת הנקודות למספר התאים המצופים. בדוגמה זו, מספר הכתמים הוצג בגרף עמודות, כאשר כל ריכוז תאי בהתאמה רשום על ציר ה-x. שימו לב שמספר הכתמים מציין את מספר התאים הפעילים לכל מספר כולל של תאים באוכלוסייה נתונה.