Microcontact הדפסה של חלבונים עבור ביולוגיה של התא
December 5th, 2008
הדפסה Microcontact נעשה שימוש נרחב על חלבונים ומולקולות אחרות דפוס על משטחי חומר. אנו מדגימים את השלבים הבסיסיים של תהליך זה, ביול דפוסים של פיברונקטין על זכוכית.
הדפסת מיקרו מגע משמשת לדפוס חלבונים ומולקולות אחרות על משטחי חומר כדי לשחזר את המורכבות של סביבות חוץ-תאיות. כדי להתחיל בהדפסת מיקרו-מגע, נוצר מאסטר טופולוגי ולאחר מכן משתמשים בליתוגרפיה רכה כדי להטיל חותמת מהמאסטר מתוך מגן סיל. ניתן לצבוע את החותמת בחלבון ולאחר מכן להשתמש בה כדי להחתים חלבונים על משטח חדש שעליו תאים יכולים להידבק.
היי, שמי חן. אני מהמעבדה של ד"ר לאנס קמפ בהנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת קולומביה. היי, אני GT מהמחלקה להנדסת מכונות.
שלום, אני לאנס קם מהמחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת קולומביה. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור כיצד תאים מגיבים לסידורים מורכבים של חלבונים בסביבתם החוץ-תאית. זה פותח באמצע שנות ה-90 על ידי המעבדה של ג'ורג' ווייטסידס והפך לכלי בשימוש נרחב ובעל ערך.
ישנן וריאציות רבות לטכניקה זו, אך היום G and Co תדגים את תהליך הדפסת המגע הבסיסי. אז בואו נתחיל. להדפסת מיקרו מגע, עליך להכין את החלקות הכיסוי ותמיסת החלבון להטבעה מספר ימים מראש.
ראשית, טבלו את הכיסוי מחליק לתוך תמיסת הלימבו למשך 10 דקות, חימום וערבוב עד שהתמיסה צלולה. ניתן לפשט תהליך זה, כמו גם את השלבים הבאים לניקוי ואחסון, על ידי העמסת החלקות כיסוי לתוך מדפי צביעה קרמיים. לאחר מכן, יש לשטוף את החלקות הכיסוי במים נטולי יונים, לאפות את מכסה השטיפה מחליק ב-45 מעלות צלזיוס למשך שש שעות.
להכנת תמיסת החלבון יש להרכיב מחדש פיברונקטין בהתאם להוראות היצרן למלאי של מיליגרם אחד לריכוז מיליליטר. מלאים אלה מאוחסנים קפואים בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס. עם קצבאות עבודה באחסון זמני בארבע מעלות צלזיוס.
יציקת חותמות יכולה להתבצע מספר ימים לפני הניסוי. ניתן לאחסן את הבולים הללו בתבנית בצלחת מכוסה כמו צלחת תרבית רקמות. כדי להתחיל, ראשית, הסר אבק רופף מהמאסטר באמצעות זרם של אוויר מסונן דחוס או גז אינרטי.
לאחר מכן, הניחו את צד תבנית המאסטר כלפי מעלה בתחתית צלחת פלסטיק, שהיא מעט גדולה יותר מהמאסטר וצריכה להיות מצופה בנייר אלומיניום. כלי תרבית רקמות בגודל 60 או 100 מילימטר עובדים היטב למטרה זו. בצינור הצנטריפוגה של פוליסטירן 50 מיליליטר, שלב את רכיבי מגן הציל ביחס של חומר ריפוי לבסיס אלסטומר של אחד עד 10 לפי משקל.
מערבבים היטב עם מכשיר פלסטיק חד פעמי כמו קצה פיפטה. הכינו מספיק מהאלסטומר כך שיהיה לפחות 0.2 מיליליטר אלסטומר לסנטימטר מרובע של שטח המנה. צנטריפוגה את צינור 50 מיליליטר ב -300 גרם למשך חמש דקות.
כדי להסיר בועות אוויר לאחר צנטריפוגה או האלסטומר מעל המאסטר, יש להניח תחת ואקום כמו בתוך חומר ייבוש למשך 30 דקות. לאחר מכן, רפאו את האלסטומר בתנור בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות. ריפוי בטמפרטורות גבוהות יותר ולזמנים ארוכים יותר מביא לאלסטומר נוקשה יותר.
לאחר הריפוי, הניחו למאסטר להתקרר לטמפרטורת החדר. לבסוף, הפרד את גיליון הבולים מהמאסטר ולאחר מכן חתוך חותמת למידות המאסטר למגע מיקרו. הדפס סיבי nin על מכסה הזכוכית מחליק תחילה.
גזרו חותמת בודדת חותמות בגודל ארבעה מילימטר על ארבעה מילימטר עד סנטימטר אחד על סנטימטר אחד בשטח ועובי של מילימטר עד שני מילימטר הם הקלים ביותר להתחלה. הנח את תבנית החותמת עם הצד כלפי מעלה על מגלשת זכוכית או צלחת פלסטיק קטנה. לאחר מכן, הניחו את החותמת בשואב פלזמה ועבדו תחת ואקום למשך 30 שניות.
מנקה פלזמה מדעי של הריק המוגדר בהגדרת התפוקה הגבוהה ביותר שלו יהפוך את משטח ה-PDMS להידרופילי. אם זה מוגדר לזמנים ארוכים יותר, זה יגרום לפיצוח האלסטומר. מדללים את תמיסת הסיבים נין עם PBS לריכוז הטבעה של 50 מיקרוגרם למיליליטר.
לאחר שהתמיסה מוכנה, הניחו טיפה קטנה של כ-10 עד 50 מיקרוליטר מתמיסת ההטבעה על החותמת. התמיסה תתפשט על פני השטח ההידרופילי. הוסף רק מספיק פתרונות כך שהטיפה תכסה את החותמת, אך לא תעבור על הקצוות.
תנו לחלבון להיספג לחותמת למשך חמש דקות. לאחר מכן, השתמש במגבון קים או בממחטת נייר נקייה אחרת כדי לנדף את רוב תמיסת החלבון מהחותמת מבלי לגעת באזור המעוצב. יבש את התמיסה שנותרה מהחותמת מתחת לזרם של גז אינרטי נקי ויבש כמו חנקן.
לאחר הייבוש, השתמש בפינצטה כדי להסיר את ה-stamp ממגלשת הזכוכית הפוכה והנח את ה-stamp במגע עם מכסה הזכוכית הנקי. החלק את המשטח לעיצוב. הניחו משקולת על גבי החותמת כדי לקדם מגע טוב.
המשקל הסגולי המספק את הדפוס הטוב ביותר תלוי בגודל החותמת ובדפוס. התחל במשקל של חמישה גרם והתאם בין הטבעות. השאירו את החותמת במגע עם המשטח למשך דקה.
לאחר שתסיים, פרק בזהירות את הערימה והפריד את החותמת מהכיסוי החלק במרץ. שטפו את החלקת הכיסוי המעוצבת ב-PBS ואחריה מים נטולי יונים כדי להסיר חלבון שאינו נספג לפני השטח לייבש את החלקת הכיסוי מתחת לזרם חנקן. הדפסת מיקרו מגע היא תהליך רב עוצמה ליצירת דפוסים של מולקולות על משטחים.
בדוגמה זו, אנו דפוסים עם תווית פלואורסצנטית של פיברונקטין בתבנית של לוגו בית הספר שלנו. גובהו של כל לוגו הוא 200 מיקרומטר. היבט רב עוצמה של תהליך זה הוא שניתן לשלב מספר סבבים של הדפסת מיקרו-מגע על משטח אחד, כמו בדוגמה זו של שני נוגדנים שונים המונחים על משטח אחד.
במקרה זה, הכתמים הירוקים הם בקוטר של מיקרומטר אחד ומרווחים במרווחים של ארבעה מיקרומטר. אנו משתמשים במשטחים האלה כדי לחקור כיצד תאים משלבים רמזים מרובים של הסביבה החוץ-תאית. בסרט זה, תאי T נאיביים יושבים על מערך של כתמים המכילים נוגדנים לקולטני פני התא.
תאים מאתרים ומקיימים אינטראקציה עם תכונות אלה, מערכים לא סדירים המארגנים את עצמם. תהליך הדפסת המיקרו-מגע הוא פשוט מבחינה רעיונית וחזק מאוד, לאחר שיושם על דפוס מגוון רחב של מולקולות על מגוון מצעים. עם זאת, תהליך זה נותר סוג של אמנות.
הגיאומטריה הספציפית של התבנית שתיווצר, החלבון שיש לעצב משקל מיושם ותנאי הטבעה של ציפוי משפיעים כולם על איכות ההטבעה. אנו מדגימים את דפוס הפיברונקטין על הזכוכית כנקודת התחלה אמינה ללימוד טכניקות אלה. זה עתה הראינו לך את היסודות של החתמת מיקרו מגע בעת ביצוע הליך זה.
זכור תמיד לעקוב אחר אמצעי הזהירות של המעבדה. אז זהו. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מדגים את תהליך ההדפסה במיקרו-מגע, טכניקה המשמשת לדפוס חלבונים על משטחים. השיטה מאפשרת שחזור של סביבות חוץ-תאיות מורכבות על ידי חותמת חלבונים כמו פיברונקטין על זכוכית.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- הנדסה ביו-רפואית
- מדעי החומרים
- ביולוגיה תאית
רקע
- הדפסה במיקרו-מגע היא טכניקה נפוצה בדפוס על משטחים.
- היא מאפשרת מיקום מדויק של ביו-מולקולות על מצעים שונים.
- שיטה זו חיונית לחקר התנהגות התאים בסביבות מבוקרות.
- פיברונקטין הוא חלבון מרכזי המעורב בהדבקת התאים.
מטרת המחקר
- להמחיש את השלבים הבסיסיים הכרוכים בהדפסה במיקרו-מגע.
- להדגים את היישום של טכניקה זו ביצירת משטחים להדבקת תאים.
- לספק מדריך חזותי לחוקרים המתעניינים בדפוס על משטחים.
שיטות ששימשו
- יצירת מופת טופולוגי לחותם.
- שימוש בליתוגרפיה רכה ליציקת חותם מ-Syl guard.
- ציפוי החותם בפיברונקטין.
- חותמת החותם המצופה על משטח זכוכית.
תוצאות עיקריות
- חותמת מוצלחת של דפוסי פיברונקטין על זכוכית.
- הדגמה של הדבקת תאים על המשטחים המדוגשים.
- אימות של טכניקת ההדפסה במיקרו-מגע.
- יישומים פוטנציאליים בהנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית.
מסקנות
- הדפסה במיקרו-מגע היא שיטה יעילה לדפוס על משטחים.
- שיטה זו יכולה לשמש ליצירת סביבות שמחקות מטריצות חוץ-תאיות טבעיות.
- מחקר נוסף יכול להרחיב את יישומייה בתחומי הביו-רפואה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Microcontact printing enables precise spatial control of extracellular matrix proteins, supporting mechanistic de-risking in target validation by defining how cells respond to defined protein patterns. This capability enhances predictive confidence in early discovery by allowing systematic interrogation of microenvironmental cues that influence cell signaling and phenotype. The method provides a scalable, reproducible platform for assay development in phenotypic screening and translational biomarker discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by defining how specific extracellular matrix patterns modulate cell adhesion and signaling pathways.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized protein patterning that reduces variability in cell-based functional assays.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by linking microenvironmental inputs to cellular responses, improving target confidence in mechanistically complex disease areas.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological substrates with spatially defined protein patterns for reliable compound screening in phenotypic assays.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled stamping parameters, enabling consistent readouts across experiments.
- Scalability: Supports platform reuse and multiplexing, allowing multiple protein patterns to be overlaid on a single surface for integrated cue analysis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by patterning native extracellular matrix proteins like fibronectin to model physiological cell-adhesion contexts.
- Mechanistic De-risking: Connects discovery-stage microenvironmental manipulation to preclinical validation by enabling controlled study of cell integration of multiple biochemical cues.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying how defined protein patterns influence cell self-organization and receptor engagement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to assay-ready substrate preparation for screening and phenotypic analysis, supporting iterative refinement of target mechanisms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise spatial presentation of proteins to study cell response to extracellular complexity.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible substrates with quantitative protein patterning, enabling reliable evaluation of compound effects on cell adhesion and signaling.
- Analytics: Generates spatially resolved, quantifiable readouts such as feature size, spacing, and protein density that support comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of physiologically relevant proteins like fibronectin to model extracellular matrix engagement in disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability for generating standardized microenvironments across projects, reducing redundant optimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in how extracellular matrix organization influences cell behavior.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability in protein patterning for consistent experimental outcomes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk by enabling early microenvironmental de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement decisions by linking microenvironmental inputs to functional cellular outputs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in soft lithography, protein handling, and surface chemistry for reliable stamp fabrication and stamping.
- Depends on access to master fabrication tools (e.g., photolithography) or alternative topology sources such as plastic diffraction gratings.
- Necessitates cross-team standardization of stamping parameters including protein concentration, stamping time, and contact force to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when transferring patterns across different substrate materials and protein types.
- Limited by the manual nature of stamp alignment and patterning quality sensitivity to master geometry, protein choice, and environmental conditions.
