Name: Microcontact הדפסה של חלבונים עבור ביולוגיה של התא (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: למדו הדפסת מיקרו-קונטקט ליצירת דפוסי חלבונים על משטחים זכוכיתיים באמצעות סיל-גארד ופיברונקטין. שיטה זו מאפשרת חקר התנהגות תאים בסביבות מורכבות המחקות מטריצות חוץ-תאיות טבעיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. ההכנה של פתרונות וחומרים פעולות אלה צריכות להתבצע מספר ימים מראש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכוכית coverslips. Coverslips נוקו על ידי טבילה למשך 10 דקות לתוך תמיסה של חומר ניקוי 7x Linbro: מים, מעורבות בבית 1: 3 יחס ומחוממת, עם ערבוב, עד ברור. Coverslips היו שטופים נרחב עם מים deionized, אפויים אז במשך 6 שעות על 450 מעלות צלזיוס. טוען coverslips לתוך מתלים מכתים קרמיקה (ראה ריאגנטים) פשוט התהליך הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבון פתרון ביול. מחדש פיברונקטין ההנחיות ליצרנים פתרון המניות של ריכוז מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​1. </li></ol> 2. מבצע בולים מן האדון טופולוגי צעדים אלה יכולים להתבצע מספר ימים מראש. חנות בולים דפוס-up בצלחת מכוסה, כגון צלחת בתרבית רקמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת אבק משוחרר מן האדון באמצעות זרם של דחוס, אוויר מסונן או גז אינרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום, מאסטר בצד בדוגמת למעלה, בחלק התחתון של צלחת פלסטיק פשוט גדול יותר לשלוט. 60 - או 100 מ&quot;מ תרבות מנות רקמה מתאימים היטב למטרה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור 50 מ&quot;ל פוליסטירן צנטריפוגות, לשלב את רכיבי Sylgard ביחס של סוכן ריפוי: בסיס אלסטומר של 1: 10 לפי משקל. מערבבים היטב בעזרת מכשיר פלסטיק, כגון טפטפת הפנויה. הכן לפחות 0.2 מ&quot;ל של אלסטומר לסנטימטר מרובע של שטח צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שפופרת 50 מ&quot;ל ב G 300 דקות 5 להסיר בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את אלסטומר על המאסטר, אז מקום ייבוש, תחת ואקום, במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cure אלסטומר בתנור על 65 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות. אשפרה בטמפרטורות גבוהות ועל פי התוצאות כבר אלסטומר נוקשה. בואו להתקרר לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את גיליון הבולים מן האדון. </li></ol> 3. Microcontact הדפסה של פיברונקטין על זכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור חותמת אחת. בולים מדידה 4 מ&quot;מ x 4 מ&quot;מ עד 1 ס&quot;מ X 1 ס&quot;מ באזור ו 1-2 מ&quot;מ עובי הם הקלה ביותר להתחיל עם. מניחים בצד עד דפוס בשקופית זכוכית או צלחת פלסטיק קטנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום בול שואב פלזמה, תהליך, תחת ואקום, למשך 30 שניות. מדעי Harrick מנקה פלזמה (ראה ציוד), נקבע על הגדרת הגבוהה ביותר הפלט יציג את פני השטח PDMS הידרופילי. כבר פעמים לגרום פיצוח של אלסטומר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הפתרון פיברונקטין עם מים deionized לריכוז הטבעה של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום טיפה קטנה (10-50 μl) של הטבעה פתרון הבול. זה יתפשט על פני השטח הידרופילי. הוסף רק פתרון מספיק כי ירידה מכסה את החותמת, אבל לא לדרוס את הקצוות. בואו לספוג חלבון חותמת במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות ® Kimwipe או נייר אחר רקמות נקייה, הפתיל את רוב הפתרון חלבון מן הבול, בלי לגעת באזור בדוגמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש הפתרון שנותר חותמת תחת זרם של גז נקי, יבש, אדיש, ​​כגון חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פינצטה, להסיר את חותמת משקופית הזכוכית, להפוך, ומקום במגע עם coverslip הזכוכית לנקות (את פני השטח להיות בדוגמת). מניחים משקל על גבי לקדם קשר טוב. משקל סגולי המספק את דפוסים הטובה ביותר תלויה בגודל בול דפוס; להתחיל עם משקל 5 גרם, ולהתאים בין stampings. השאירו חותם על קשר עם השטח עבור 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לפרק את הערימה, חותמת נפרדת coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוקף לשטוף את coverslip בדוגמת ב-PBS, ואחריו מים deionized, להסיר חלבון שאינו adsorbed אל פני השטח. Coverslip יבש תחת זרם חנקן. </li></ol> נציג תוצאות הדפסה Microcontact הוא תהליך רב עוצמה עבור דפוסים מולקולות על משטחים. תהליך זה יש את היכולת ליצור תכונות עם ממדים החל עשרות מיקרומטר עד מאות ננומטרים; באיור. 1A, את הלוגו בצד שמאל נמצאים כל 200 מיקרומטר גובה, בעוד כתמים ירוקים מאויר באיור. 1B הם 1 מיקרומטר בקוטר במרווחים של 4 במרווחים מיקרומטר, נמדד מרכז אל מרכז. איור. 1B גם ממחיש מאפיין עוצמה של הדפסה microcontact, כלומר שזה תהליך כתוסף. מספר סיבובים של הדפסה microcontact יכול להיות מיושם על פני אחד כדי ליצור multicomponent מערכות 3. <img src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_3/Figure_a.jpg" alt="תרשים" /><img src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_4/FIGURE_B.jpg" alt="איור ב &#39;" />

<ol><li>Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276, 1425-1425 (1997).</li>
<li>Kumar, A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+Gold+Having+Micrometer+to+Centimeter+Dimensions+can+be+Formed+Through+a+Combination+of+Stamping+with+an+Elastomeric+Stamp+and+an+Alkanethiol+%22Ink%22+Followed+by+Chemical+Etching%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching.</a> Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).</li>
<li>St. John, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+Glial+Cell+Attachment+to+Microcontact-printed+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces.</a> Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).</li>
<li>Kam, L., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+to+protein-micropatterned-supported+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).</li>
<li>Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+Hybrid+Surfaces+of+Proteins+and+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers.</a> Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).</li>
<li>Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+costimulatory+ligands+enhances+CD4%2B+T+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).</li>
<li>Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+presentation+of+L1+and+N-cadherin+in+multicomponent%2C+microscale+patterns+differentially+direct+neuron+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי בריאות להצהיר עליהם.

תהליך ההדפסה microcontact היא פשוטה מבחינה מושגית חזקים מאוד, לאחר הוחל על דפוסים מגוון רחב של מולקולות על מגוון מצעים. עם זאת, תהליך זה נשאר משהו של האמנות. הגיאומטריה מסוים של דפוס להיווצר, חלבון להיות בדוגמת, משקל מוחל, ציפוי / הטבעה כל התנאים להשפיע על איכות הטבעה. לדוגמה, גם משקל קטן, ליישם תכונות גדולות, לעתים קרובות תוצאות פערים דפוס כפי שניתן לראות בלוגו הימנית העליונה של איור. 1A. לעומת זאת, משקל רב מדי יגרום נפול וקריסה של הבול, וכתוצאה מכך בתצהיר מכוון של חלבון באזורים בין בדוגמת features.A...

<table><tbody><tr><td>מנקה פלזמה (Plasma Cleaner)</td><td></td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>דסיקטור (Desiccator)</td><td></td><td>Nalge Nunc international</td><td>5315-0150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>10010-072</td><td></td></tr><tr><td>ערכה לסימון חלבונים</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>מתקן לצביעה</td><td>ריאגנט</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי (Coverslips)</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-12</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>ריאגנט</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 Sil Elast Kit</td><td></td></tr><tr><td>סריג עקיפה</td><td>ריאגנט</td><td>Edmund Scientific</td><td>3040267</td><td></td></tr></tbody></table>

microcontact הדפסה של חלבונים עבור ביולוגיה של התא

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

היכולת חלבונים דפוס ביומולקולות אחרים על גבי מצעים חשוב לתפוס את המורכבות של הסביבה המרחבית תאיים. פיתוח והדפסה microcontact ידי קבוצת Whitesides (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/"&gt; Http://gmwgroup.harvard.edu/</a&gt;) באמצע 1990 revolutionalized בשדה זה על ידי ביצוע המיקרואלקטרוניקה / טכניקות microfabrication נגיש מעבדות מתמקדת במדעי החיים. יישום ראשוני של שיטה זו בשימוש polydimethylsiloxane (PDMS) בולים ליצור דפוסים של כימיקלים פונקציונליות על משטחים חומר<sup&gt; 1</sup&gt;. מאז, מגוון של גישות חדשניות פותחו מולקולות דפוס אחרים, לרבות חלבונים<sup&gt; 2</sup&gt;. וידאו זה מדגים את התהליך הבסיסי של יצירת בולים PDMS, ומשתמשת בהם כדי חלבונים דפוס, כמו צעדים אלה קשה לבטא במדויק במילים. אנו מתמקדים דפוסים תאי מטריקס החלבון פיברונקטין על coverslips זכוכית כדוגמה ספציפית של דפוסים. מרכיב חשוב בתהליך ההדפסה microcontact הוא אמן טופולוגי, שממנו בולים נוצקו; האזורים הרים והוריד של המאסטר משתקפים אל הבול ולהגדיר את הדפוס הסופי. בדרך כלל, מאסטר מורכב סיליקון ופל מצופה photoresist ואז בדוגמת ידי photolithography, כפי שנעשה כאן. יצירה של אדונים המכיל דפוס מסוים דורש ציוד מיוחד, והוא ניגש הטוב בהתייעצות עם מרכז ייצור או מתקן. עם זאת, כמעט כל מצע עם טופולוגיה יכול לשמש אמן, כגון gratings עקיפה פלסטיק (ראו למשל ריאגנטים אחד), האדונים מקרית כזה לספק זמינים, דפוסי פשוטה. פרוטוקול זה מתחיל בנקודה שיש מאסטר ביד.

הדפסה Microcontact נעשה שימוש נרחב על חלבונים ומולקולות אחרות דפוס על משטחי חומר. אנו מדגימים את השלבים הבסיסיים של תהליך זה, ביול דפוסים של פיברונקטין על זכוכית.

Microcontact הדפסה של חלבונים עבור ביולוגיה של התא

היכולת ליצור דפוסים של חלבונים וביומולקולות אחרות על תשתיות היא חשובה לשחזור המורכבות המרחבית של הסביבה החוץ-תאית. ...

הדפסת מגע מיקרוסקופית (Micro contact printing) משמשת ליצירת תבניות של חלבונים ומולקולות אחרות על פני השטח של חומרים, וזאת כדי לשחזר את המורכבות של סביבות חוץ-תאיות. כדי להתחיל בהדפסת מגע מיקרוסקופית, יוצרים תבנית טופולוגית (topological master) ולאחר מכן משתמשים בליתוגרפיה רכה כדי ליצוק חותמת מהתבנית באמצעות Syl guard. ניתן לצפות את החותמת בחלבון ולאחר מכן להשתמש בה כדי להטביע חלבונים על פני שטח חדשים שעליהם תוכלי התאים להיצמד.שלום, שמי צ'ן. אני מהמעבדה של ד"ר Lance Camp בהנדסה ביו-במדית באוניברסיטת קולומביה. שלום, אני GT מהמחלקה להנדסת מכונות.שלום, אני לאנס קם מהמחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת קולומביה. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור כיצד תאים מגיבים למערכים מורכבים של חלבונים בסביבתם החוץ-תאית. שיטה זו פותחה באמצע שנות ה-90 במעבדה של ג'ורג' וייצסיידס והפכה לכלי בעל ערך ונפוץ מאוד.קיימות וריאציות רבות לטכניקה זו, אך היום G and Co U ידגימו את התהליך הבסיסי של הדפסה במיקרו-מגע (micro contact printing). אז בואו נתחיל. עבור הדפסה במיקרו-מגע, עליכם להכין את לוחות הכיסוי ואת תמיסת החלבון להחתמה מספר ימים מראש.ראשית, טבול את לוחות כיסוי הזכוכית בתמיסת הלימבו למשך 10 דקות תוך חימום וערבוב עד שהתמיסה תהיה שקופה. תהליך זה, כמו גם השלבים הבאים לניקוי ולאחסון, יכולים להיות מופש

microcontact-printing-of-proteins-for-cell-biology

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מראה ניסויים עם ניתוח בדיעבד של חלבונים אינטראקציות על ידי שימוש במיקרו בדוגמת משטחים. הגישה מציעה את האפשרות לזהות אינטראקציות חלבון בתאים חיים, והוא משלב יכולות התפוקה גבוהה עם אפשרות לחלץ מידע כמותי.

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

עצמית התאספו monolayers (Sams) נוצר זמן alkane thiols על שרשרת זהב לספק מוגדרים היטב מצעים ליצירת דפוסי חלבון תא הכליאה. הדפסה Microcontact של hexadecanethiol באמצעות חותמת (PDMS) polydimethylsiloxane ואחריו למלא את משבצות עם גליקול, הסתיים alkane תיאול מונומר מייצר דפוס שבו חלבונים בתאים לספוג רק לאזור hexadecanethiol חותמת.

יצירת דו מימדי מצעים Patterned עבור החזקת חלבון ו-Cell

תיאור של שיטות להמיר HP DeskJet 500 המדפסת לתוך bioprinter. המדפסת מסוגלת עיבוד תאים חיים, מה שגורם הנקבוביות חולפים על הממברנה. נקבוביות אלה יכול להיות מנוצל לשלב מולקולות קטנות, כולל ניאון G-אקטין, לתוך תאים מודפסים.

יצירת חולף קרום התא הנקבוביות באמצעות מדפסת הזרקת דיו רגילה

שיטה להרכבה של שיפועים ודבק מסיסים בתא מיקרוסקופי למחקרי נדידת תאי חיים מתוארת. הסביבה המהונדסת משלבת משטחי antifouling ופסי דבק עם שיפועי פתרון ולכן מאפשרת אחת כדי לקבוע את החשיבות היחסית של רמזי הדרכה.

יצירת Gradients הדבק והמסיס לנדידת תאי דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

טכנולוגיית הדפסה מיקרופלואידית תלת מימדית זו מדפיסה מערכי תאים על משטחים שקועים.  אנו מתארים כיצד מערכי תאים מועברים באופן מיקרופלואידי, בתאי זרימה תלת מימדיים על משטחים שקועים.  על ידי הדפסה על משטחים שקועים, יוצרו מיקרו-מערכי תאים המאפשרים סינון תרופות והערכת ציטוטוקסיות במספר רב של תחומים.

הדפסה השקועה של תאים על גבי משטח שונה באמצעות זרימת Microspotter רציפה

למצעי תרבית תאים המתפקדים עם דפוסים בקנה מידה מיקרו של ליגנדים ביולוגיים יש תועלת עצומה בתחום הנדסת הרקמות. כאן, אנו מדגימים את הייצור הרב-תכליתי והאוטומטי של מצעי תרבית רקמות עם מברשות פולי (אתילן גליקול) מרובות ומיקרו-דפוסיות המציגות כימיה אורתוגונלית המאפשרת קיבוע מדויק מרחבית וספציפי לאתר של ליגנדים ביולוגיים.

בודה מצעים מורכבים תרבות באמצעות רובוטית microcontact הדפסה (R-μCP) והתמר נוקלאופילית סדרתית

דוח זה מתאר טכניקה פשוטה וקלה לביצוע, תוך שימוש בוואקום בלחץ נמוך, למילוי תעלות מיקרופלואידיות בתאים ומצעים למחקר ביולוגי.

שיטה צדדית של חלבוני דפוסי תאים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מסך חלבון חוץ-תאי מיקרו-מערכים זיהוי הקולטן הרומן-ליגנד אינטראקציות תפוקה גבוהה. אנו גם מתארים שיטה כדי לשפר זיהוי של אינטראקציות חלבון ארעי באמצעות קומפלקסים של חלבונים-microbead.

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

המטרה הכללית שלנו היא להבין כיצד תאים התחושה מסחטות רמזים כי להוביל צמיחה סיבי מכוון. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה של adsorption מולקולרית המושרה אור של חלבונים, משמש כדי לייצר מיקרו דפוסים מוגדרים של מטריקס רכיבים מטריצות על מנת ללמוד אירועים ספציפיים השולטים אקסון הצמיחה ואת מציאת.

המושרה באור Adsorption מולקולרית של חלבונים באמצעות מערכת פרימו עבור מיקרו הפנינג כדי ללמוד התגובות לתא מטריצות חלבונים מטריקס

אנו מתארים שיפורים בשיטה סטנדרטית למדידת כוחות המתיחה התאית, המבוססת על הדפסה מיקרו-קונטרקטית עם שלב דפוס תת-קרקעי יחיד של מערכי נקודות של חלבוני מטריצה חוץ-תאית על הידרוג'לים רכים. שיטה זו מאפשרת ייצור פשוט ועקבי יותר של דפוסי איים, החיוניים לשליטה בצורת צביר התאים.

יצירת תבניות למיקרוסקופיית מתיחה מיקרופטרן

באופן מסורתי, תרבית תאים מבוצעת על מצעים מישוריים המחקים בצורה גרועה את הסביבה הטבעית של תאים in vivo. כאן אנו מתארים שיטה לייצור מצעי תרביות תאים עם גיאומטריות מעוגלות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית וחלבונים חוץ-תאיים מיקרו-פטרייתיים, המאפשרת חקירה שיטתית של חישה תאית של רמזים חוץ-תאיים אלה.

יצירת מיקרו-סביבה תאית רב-תכליתית על-ידי UV-Photopatterning של מצעי תרביות תאים תלת-ממדיים

למדו הדפסת מיקרו-קונטקט ליצירת דפוסי חלבונים על משטחים זכוכיתיים באמצעות סיל-גארד ופיברונקטין. שיטה זו מאפשרת חקר התנהגות תאים בסביבות מורכבות המחקות מטריצות חוץ-תאיות טבעיות.

Microcontact הדפסה של חלבונים עבור ביולוגיה של התא

גלה סרטונים נוספים