Name: תמונה-induced cross-linking של חלבונים ללא שינוי (PICUP) יישומית כדי פפטידים Amyloidogenic (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: חקור את שיטת PICUP לניתוח התפלגות גודל האוליגומרים בפפטידים אמילואידוגניים הקשורים במחלות נוירודגנרטיביות. השיטה משתמשת באור עז לקישור קוולנטי של דימרים ואוליגומרים לצורך חקר תכונות מבניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים AG027818 ו AG030709 מ-NIH / NIA, 2005/2E מן ל לארי Hillblom קרן, IIRG-07-58334 של איגוד האלצהיימר, 07-65798 מקליפורניה המחלקה לבריאות הציבור.

1. פפטיד הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את ~ 100-200 מיקרוגרם של הפפטיד lyophilized באמצעות microbalance ולהעביר לתוך שכותרתו, סיליקון מצופה, בעלי כושר ספיגה נמוך צינורות microfuge. כאן, אנו משתמשים רצפים האדם של Aβ40, Aβ42, קלציטונין, ואת פוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאן, אנו משתמשים פפטידים מראש שטופלו 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) כדי להשיג הומוגניות, במצטבר ללא הכנות. צעד זה הוא הכרחי משום מראש יצרו אגרגטים לגרום להצטברות מהירה של חלבונים amyloidogenic, אשר התוצאה reproducibility העניים בקרב ניסויים 5. שיטות אחרות כגון סינון ה-SEC גם יכול לשמש כדי להשיג המצרפי ללא ההכנות PICUP 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטפל פפטידים עם HFIP, טרום הקור מיכל HFIP על הקרח בתוך ברדס קטר לבוש הגנה נאותה (HFIP הוא נדיפים רעילים). קירור של בקבוק 250 מ&quot;ל מחייב בדרך כלל 10-15 דקות. הוסף HFIP מראש צונן צינורות המכיל lyophilizates פפטיד לקבל ריכוז הפפטיד נומינלית של 0.5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate הפתרונות פפטיד sonicator מים באמבט במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס בעדינות דגירה צינורות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צ&#39;יל הצינורות על הקרח (דקות 1), ולחלק את פתרונות ל 10-50-μl aliquots שכותרתו ב 0.6-מ&quot;ל נמוך צינורות בעלי כושר ספיגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר HFIP על ידי אידוי תחת זרם עדין של חנקן, או לעזוב את צינורות פתוחים בשכונה קטר בן לילה. עבור אידוי לילה, במקום צינורות פתוחים במעמד ומכסים אותם עם סדין גדול של Kimwipes כדי למנוע אבק וזיהום החלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Exsiccate HFIP הנותרים האור בריק ב lyophilizer, או concentrator צנטריפוגלי למשך 30 דקות, או exsiccator מצורף כניסת ואקום עבור 2 ח המוצר הסופי יהיה סרט פפטיד בתחתית הצינורות microfuge. אם exsiccated כראוי, צינורות יכול להיות מאוחסן אטום ב -20 או -80 ° C. במשך תקופות ממושכות (חודשים) </li></ol> 2. Solubilizing HFIP שטופלו פפטידים צילום cross-linking <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני solubilizing HFIP שטופלו פפטידים עבור cross-linking תגובות, צריך להכין את cross-linking ו ריאגנטים מרווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את persulfate אמוניום (APS, מר 228.2 g / mol) ולהכין פתרון 20 מ&quot;מ פוספט 10 mM נתרן, pH 7.4. מערבבים בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1 מ&quot;מ טריס (2,2-bipyridyl) dichlororuthenium (II) hexahydrate (RuBpy, מר 748.63 g / mol) ב 10 mM נתרן פוספט, pH 7.4. מערבבים בעזרת מערבולת לאמת התפרקות מוחלטת. הגן על הצינור מן האור באמצעות רדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח SDS-PAGE הבאים cross-linking, מגיב מרווה נוח היא 5% β-mercaptoethanol ב 2 × SDS-PAGE חיץ המדגם. לחלופין, 1 M dithiothreitol (DTT, מר 154.5 g / mol) במים deionized או חיץ מתאים יכול לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HFIP שטופלו סרטים פפטיד הם מומסים לדלל NaOH הראשון ולאחר מכן פוספט נתרן חיץ נוסף כדי לקבל ריכוז הפפטיד ~ 30 מיקרומטר. הוסף 60 mM NaOH ואחריו deionized המים לתוך הצינור המכיל את הסרט פפטיד כזה NaOH מים מהווים 10 ו - 45% מנפח הסופי, בהתאמה. גרדו את הסרט פפטיד מהקירות בתוך צינור microfuge משתמש קצה, על ידי שילוב pipetting למעלה ולמטה, ועל sonicate במשך 5 דקות בתוך sonicator מים באמבטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 45% 20 mM נתרן פוספט, pH 7.4, לערבב ידי pipetting ו צנטריפוגות ב g 16,000 עבור 10 דקות. מניחים בצד aliquots של uncross צמודות פפטידים מעורבב עם מגיב מרווה עבור פקדי שלילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את המצלמה תריס, עיכוב 1 s. בזמנים קרינה גבוהות יותר, התגובות רדיקלי נרחב עלול לגרום פירוק חלבונים. טען את תריס המצלמה. זמן הקרנה ייתכן שיהיה צורך אופטימיזציה כאשר בשיטת עם חלבון חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובה PICUP טיפוסי מבוצע בהיקף 20 תגובה μl. העברת 18 μl של הפתרון הפפטיד לתוך צינורית דקה חומה, ברור, PCR 0.2-מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתרון פפטיד, להוסיף 1 RuBpy μl ואחריו APS 1 μl ומערבבים ריאגנטים ידי pipetting (הריכוז הסופי של RuBpy ו APS בתערובת התגובה תהיה 0.05 ו - 1 מ&quot;מ, בהתאמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות למקום צינור תגובה בתוך בקבוקון 1.8 מ&quot;ל זכוכית. מניחים את הבקבוקון בתוך מפוח מצורף מול גוף המצלמה. צרף את מגן העדשה ולחץ על תריס כך המדגם הוא מוקרן עבור 1 s בתוך המפוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקרנת המדגם, מהר לקחת את הבקבוקון מן המפוח ואת הצינור PCR מתוך הבקבוקון. במהירות להרוות את התגובה על ידי הוספת 1 או 10 μl DTT מדגם μl צמצום מאגר הדפים. חזור על התגובה aliquot כל פפטיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובות התגובה כעת ניתן קפוא ב -20 ° C עבור אחסון לא יותר מ 7 ימים או שמרו על הקרח לפני הניתוח על ידי-SDS וכסף-מכתים. </li></ol> 3. SDS-PAGE ו רסיס-מכתיםשל צולבים מוצרים פפטיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שגרה SDS-PAGE ו כסף מכתים מבוצעות לדמיין צולבים פפטידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 5 μl מתערובת התגובה לכל נתיב להשיג ~ 130 pmol של הפפטיד לכל נתיב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלול כמויות דומות של uncross צמודות פפטידים להשוואה. כמו כן כוללים סולם חלבון סטנדרטי עבור אומדן ויזואלי של משקל מולקולרי של להקות פפטיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרץ את הג&#39;ל באמצעות מנגנון סטנדרטי ג&#39;ל אלקטרופורזה. אנו משתמשים SureLock XCell Mini-Cell המערכת Invitrogen ולבצע כסף מכתים לפי Invitrogen פרסום IM-1002, Novex טרום יצוקה ג&#39;ל אלקטרופורזה מדריך. </li></ol> חלק 4: תוצאות נציג (איור 1) <img src="/files/ftp_upload/old/1071_2009_1_19_13/Result no demarcation.png" alt="איור 1" /> איור 1: כסף מוכתם ג&#39;לים polyacrylamide מראה uncross צמוד (-) ו צילום צולבים (+) פוי, קלציטונין, Aβ40 ו Aβ42 SDS-PAGE ו כסף מכתים ניתוח PICUP שנוצר Aβ40 oligomers להראות בעוצמות הלהקה דומה של כ מונומר דרך tetramer, ואחריו לירידה חדה שפע oligomers גבוה 7. Uncross צמודות Aβ40 נודד עם מר בקנה אחד עם זה של מונומר 7. Aβ42 מראה חלוקה ברורה גודל oligomer. Aβ42 oligomers מהווים 2-3 קבוצות 8. הקבוצה הראשונה, מונומר דרך trimer, מציג ירידה באינטנסיביות עם סדר oligomer גוברת. בקבוצה השנייה, הפצה גאוס כמו שנצפה בין tetramer ו heptamer, עם מקסימום ב pentamer ו hexamer. הקבוצה השלישית, אשר אינו מוצג כאן, מכיל oligomers של מר ~ 30,000-60,000 דה 8. Oligomers אלה גבוהה בדרך כלל מר הם נצפו באמצעות ה-SEC, מבודדות LMW Aβ42 אך לא פפטיד שהוכן על ידי סינון או טיפול HFIP 6. Uncross צמודות Aβ42 מייצרת בעיקר שתי להקות, להקה מונומר ותזמורת רחב trimer / tetramer, המהווה artefact המושרה על ידי SDS 5,9. קלציטונין התשואות גודל oligomer הפצה חזק סוטה מירידה מעריכי מונוטוני ב מונומר את האזור באמצעות tetramer, מה שמרמז מראש קיומה של הדימרים, trimers, ו tetramers 7. השליטה פוליפפטיד, פוי, מייצר הפצה oligomer מונוטונית החל dimer דרך hexamer כזה כמויות יחסית לכאורה של oligomers ירידה אקספוננציאלית עם הגדלת המסה המולקולרית. בניסויים אחרים, oligomers גבוה גם יכול להיות 7 דמיינו. המספר המדויק ואת עוצמות היחסי של להקות oligomer עשוי להשתנות מעט בין ניסויים תלוי בריכוז החלבון בפועל, את כמות החלבון טעון על הג&#39;ל, והזמן המשמש בשלב פיתוח פרוטוקול כסף מכתים.

<ol><li>Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+study+of+metastable+amyloidogenic+protein+oligomers+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).</li>
<li>Fancy, D. A., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions%3A+rapid+and+efficient+cross-linking+triggered+by+long+wavelength+light%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).</li>
<li>Kluger, R., Alagic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking+and+protein-protein+interactions%E2%80%94a+review+with+illustrative+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking and protein-protein interactions—a review with illustrative protocols.</a> Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).</li>
<li>Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-linking+chemistry+and+biology%3A+development+of+multifunctional+photoaffinity+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rec%22%5BJournal%5D)">Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes.</a> Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+protein+oligomers%E2%80%94what+you+see+is+not+always+what+you+get%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic protein oligomers—what you see is not always what you get.</a> Amyloid. 12, 88-95 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+aggregate-free%2C+low+molecular+weight+amyloid-%CE%B2+for+assembly+and+toxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-β for assembly and toxicity assays.</a> Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).</li>
<li>Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+oligomerization%3A+prenucleation+interactions+revealed+by+photo-induced+cross-linking+of+unmodified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins.</a> J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).</li>
<li>Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+%CE%B2-protein+%28A%CE%B2%29+assembly%3A+A%CE%B240+and+A%CE%B242+oligomerize+through+distinct+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).</li>
<li>Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+state+characterization+of+amyloid+%CE%B2-derived+diffusible+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Mosc%29%22%5BJournal%5D)">Solution state characterization of amyloid β-derived diffusible ligands.</a> Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).</li>
<li>Bitan, G., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+photochemical+cross-linking%E2%80%94a+new+tool+for+studies+of+metastable%2C+amyloidogenic+protein+assemblies%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid photochemical cross-linking—a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies).</a> Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).</li>
<li>Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+crosslinking+of+prion+protein+oligomers+and+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions.</a> Amyloid. 13, 67-77 (2006).</li>
<li>Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+events+of+%CE%B1-synuclein+oligomerization+revealed+by+photo-induced+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept.+Lett%22%5BJournal%5D)">The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking.</a> Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).</li>
<li>Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Peptide+oligomerization+state+using+rapid+photochemical+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking.</a> Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).</li>
</ol>

PICUP פותחה במקור כדי ללמוד קומפלקסים חלבונים יציב 2. השיטה יושמה מאוחר ללמוד כמותי של metastable החלבון עמילואיד מכלולים, כולל 10 Aβ, הפריון ומחלות הקשורים PRP Sc 11, ו - α-synuclein 12. הגורמים החשובים ביותר כי יש לקחת בחשבון בעת ​​תכנון הניסוי PICUP הם stoichiometry מגיב, זמן הקרנה, והכנת הליך הדגימה. לשעבר שני נושאים עשויים לדרוש אופטימיזציה אמפירי, ואילו הנושא השני משפיע בעיקר פרשנות של נתונים ניסיוניים. עבור חלבונים amyloidogenic בפרט, קביעה של הפצות ג...

<table><tbody><tr><td>מנורת להט Dolan-Jenner בהספק 200W</td><td>אחר</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>דגם 170-D</td><td>החום הנוצר על ידי המנורה&amp;#8211;לא ישפיע על הדגימות בתקופות אינקובציה קצרות.</td></tr><tr><td>גוף מצלמת SLR במידה 35 מ"מ</td><td>כלי</td><td>Pentax</td><td>דגם SP500</td><td>בהגדרות שלנו, אקורדיון (bellows) מחובר לגוף המצלמה כדי לספק תא נוח להקרנת הדגימה המוצבת במרחק של 10 ס"מ ממקור האור.</td></tr><tr><td>מבחנות PCR שקופות בעלות דפנות דקות</td><td>אחרים</td><td>Eppendorf</td><td>951010006 supplied by Fisher L22-003-24</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני זכוכית (1.8 מ"ל)</td><td>אחר</td><td>קימבל צ'ייס</td><td>60940A 2, מסופק על ידי Fisher 03-340-60</td><td></td></tr><tr><td>GRF</td><td>ריאגנט</td><td>Bachem</td><td>H-3695</td><td></td></tr><tr><td>HFIP</td><td>ריאגנט</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>יש להשתמש במטולת אדים.</td></tr><tr><td>א&amp;#946;40 ו-A&amp;#946;42</td><td>ריאגנט</td><td>מעבדת הביופולימרים של UCLA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קלציטונין</td><td>ריאגנט</td><td>American Peptide</td><td>22-1-10</td><td></td></tr><tr><td>טריס(2,2'-ביפירידיל)דיכלורורותניום(II) הקסההידראט</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>ערבבו במערבל וורטקס עד שהתמיסה תהיה צלולה. כסו את מבחנת ה-RuBpy בנייר אלומיניום כדי להגן על הריאגנט מאור סביבתי. יש להכין את ה-RuBpy באופן טרי בכל פעם, ויש להשתמש בו בתוך 48 שעות.</td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפיה</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>ערבבו במכשיר vortex עד שהתמיסה תהיה צלולה. יש להכין את ה-APS טרי בכל פעם, ויש להשתמש בו בתוך 48 שעות. </td></tr><tr><td>&amp;#946;מרקפטו-&amp;#8211;אתנול</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154-25 ML</td><td>ניתן להשתמש כאשר מבוצע ניתוח SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>Tricine SDS Sample Buffer (2x) של Novex</td><td>ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>LC1676</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;אני&gt;SureLock&lt;/i&gt; תא-מיני (Mini-Cell)</td><td>כלי</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>ג'לי Novex Tricine (10-20%)</td><td>אחר</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td></td></tr><tr><td>בופר הרצה Novex Tricine SDS (ריכוז 10x)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC1675</td><td></td></tr><tr><td>ערכה לצביעת כסף מהירה (Silver Express Staining Kit)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC6100</td><td></td></tr></tbody></table>

תמונה-induced cross-linking של חלבונים ללא שינוי (picup) יישומית כדי פפטידים amyloidogenic

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides

הרכבה של חלבונים amyloidogenic לתוך oligomers רעילים הינה אירוע מכונן בפתוגנזה של מחלות misfolding חלבון, כולל אלצהיימר, פרקינסון, ומחלות של הנטינגטון, תורשתיות טרשת לרוחב amyotrophic, וסוכרת מסוג 2. בשל אופי metastable של מכלולים אלה חלבון, קשה להעריך את גודל oligomer שלהם הפצה כמותית תוך שימוש בשיטות קלאסיות, כגון אלקטרופורזה, כרומטוגרפיה, הקרינה, או פיזור אור דינאמי. Oligomers של חלבונים amyloidogenic קיימים תערובות metastable, שבו oligomers לנתק לתוך מונומרים ולשייך לתוך מכלולים גדולים בו זמנית. PICUP מייצב אוכלוסיות oligomer על ידי cross-linking וכאשר בשילוב עם שיטות חלוקה, כגון אלקטרופורזה dodecyl נתרן סולפט ג&#39;ל polyacrylamide (SDS-PAGE) או גודל הרחקת כרומטוגרפיה (SEC), PICUP מספק תמונות קוולנטיים של הפצות גודל oligomer שהיה קיים לפני צלב -linking. לפיכך, PICUP מאפשרת הדמיה ניתוח כמותי של אוכלוסיות חלבון metastable וניתן להשתמש בו כדי לפקח על הרכבה לפענח את יחסי הגומלין בין השינויים ברצף oligomerization<sup&gt; 1</sup&gt;. באופן מכני, PICUP כרוך צילום חמצון של רו<sup&gt; 2 +</sup&gt; בתוך קומפלקס (bipyridyl) טריס (II) Ru (RuBpy) כדי Ru<sup&gt; 3 +</sup&gt; על ידי הקרנה עם האור הנראה בנוכחות acceptor אלקטרון. רו<sup&gt; 3 +</sup&gt; הוא מחמצן חזק אחד אלקטרונים מסוגלים הפשטה אלקטרון מולקולת חלבון שכנות, יצירת חלבון קיצוני<sup&gt; 1,2</sup&gt;. הרדיקלים אינם יציבים, מאוד-reactive המינים ולכן נעלמים במהירות באמצעות מגוון רחב של תגובות הפנים ו מולקולאריים. רדיקלי יכול לנצל את האנרגיה הגבוהה של אלקטרון מזווג להגיב עם מונומר נוסף חלבון להרכיב dimeric הרדיקלי, אשר לאחר מכן מאבד אטום מימן צורות יציבה, קוולנטית צמודות דימר. Dimer עשויה להגיב אז עוד יותר באמצעות מנגנון דומה עם מונומרים או הדימרים השני כדי ליצור מסדר גבוה oligomers. יתרונות יחסיים PICUP אחרים צילום או כימי cross-linking שיטות<sup&gt; 3,4</sup&gt; כוללים חשיפה קצר (≤ 1 ים) אור שאינו הרסני גלוי, אין צורך<i&gt; מראש פקטו</i&gt; שינוי של רצף מקומיים, באורך אפס קוולנטיים cross-linking. בנוסף, מאפשר PICUP cross-linking של חלבונים בתוך ה-pH רחב טווחי טמפרטורה, כולל פרמטרים פיזיולוגיים. הנה, אנחנו מדגימים יישום PICUP אל cross-linking של שלושה חלבונים amyloidogenic 40 - ו 42-β-שאריות החלבון עמילואיד וריאנטים (Aβ40 ו Aβ42), ו קלציטונין, לבין חלבון שליטה, הורמון גדילה גורם משחרר (פוי).

תמונה-Induced cross-linking של חלבונים ללא שינוי (PICUP) מאפשר אפיון של התפלגות גודל oligomer תערובות חלבון metastable. אנו מדגימים יישום PICUP שלושה פפטידים נציג amyloidogenic 40 - ו 42-שאריות צורות של עמילואיד β-חלבון, קלציטונין ו פפטיד לשלוט הורמון גדילה גורם משחרר.

תמונה-induced cross-linking של חלבונים ללא שינוי (PICUP) יישומית כדי פפטידים Amyloidogenic

הרכבתן של חלבונים עמילואידוגניים לאוליגומרים רעילים היא אירוע מכריע בפתוגנזה של מחלות של קיפול חלבונים שגוי, כולל מחלת אלצהיימר, ...

סבורים כי האוליגומרים הממיסים של חלבונים יוצרי עמילואיד, בשל תכונותיהם הציטוטוקסיות, עומדים בבסיס הפתופיזיולוגיה של מחלות נוירודגנרטיביות. אוליגומרים אלו נוצרים ומתפרקים באופן רציף כאשר הם נמצאים בתמיסה. עובדה זו מקשה על מחקרים מבניים שהם קריטיים לפיתוח מולקולות מעכבות כדי לעקוף בעיה זו.נעשה שימוש בקשירה צולבת המושרה על ידי אור של חלבונים לא שעברו שינוי או של "פיקאפ" (pickup). שיטה זו כוללת חשיפה של פפטידים גנו-עמילואידיים, מפוזרים ומומסים, לסוכני קשירה צולבת, ופעימה של שנייה אחת של אור בעוצמה גבוהה כדי לקשור באופן קוולנטי דימרים ואולגרמרים. ניתן לאחר מכן לנתח את התפלגות הגדלים של האולגרמרים באמצעות טכניקות ביוכימיות סטנדרטיות.שלום, אני פאר רחמי מהמעבדה של בטן במחלקה לנוירוֹלוגיה באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס. אני אל מיי מהמעבדה של בין. היום נראה לכם פרוצדורה לקשירה צולבת בהשראת אור של חלבונים ללא שינוי.אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי להפיק אוליגומרים מיוצבים של חלבון amyloid beta וללמוד את השינויים המבניים בהפצה הגבוהה של האוליגומרים. נוהל זה פורסם במקור על ידי Fancy ו-Coate לצורך חקר קומפלקסים חלבוניים יציבים. השיטה יושמה מאוחר יותר על ידי Battan ואחרים למחקר כמותי של מקבצי חלבוני amyloid במצב מטא-יציב, כולל beta pram ו-alpha sycle.בואו נתחיל. כדי להתחיל את הפרוטוקול, מוסיפים hexafluoroisopropanol או HFIP, שהקורה מראש על קרח, לתוך מבחנה בעלת ציפוי סיליקון בעלת ספיגה נמוכה המכילה 1 עד 200 µg של פפטיד ליפיליזד, כך שהריכוז הסופי יהיה כ-0.5.ריכוז מילימולרי של HFIP מונע מאמילואידוגנים של פפטידים להתרקב וישפר את עקביות התוצאות. כעת, בצע סוניקציה לשפחור הפפטיד למשך חמש דקות, בטמפרטורת החדר.עם סיום הסוניקציה, ערבבו בעדינות את המבחנות במערבל וורטקס (vortex) והשאירו אותן לדגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות, קררו את הפפטידים על קרח למשך דקה אחת. כעת ניתן לחלק את הפפטידים המקוררים לאליקוואות של 10 עד 50 µL במבחנות בעלות ספיגה נמוכה בעובי 0.6 mil.בשלב הבא, הניחו את המבחנות במנדף כאשר הפקקים פתוחים. כדי לאפשר ל-HFIP להתאדות במהלך הלילה, עטפו את מעמד המבחנות בנייר סופג (Kim wipes) למניעת שקיעת אבק לתוך המבחנות. לאחר שמרבית ה-HFIP התאדה, יש להסיר כל שארית של HFIP על ידי הנחת המבחנות ב-ex תחת ואקום למשך שעתיים.התוצר הסופי הוא שכבה דקה של קרום פפטיד בתוך המבחנות. ניתן לאחסן מבחנות אלו למשך חודשים בטמפרטורה של 20- או 80- מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בשלבי ההמסה והקישור הצולב הפוטו-כימי, ממיסים תחילה את קרום הפפטיד בתמיסה מדוללת של נתרן הידרוקסיד.לאחר הוספת הסודיום הידרוקסיד, מים דאיוניים ולאחר מכן בופר פוספט, התמיס הסופי צריך להכיל 45% בופר פוספט, 45% מים ו-10% תמיסת סודיום הידרוקסיד. אם נותר קרום חלבוני על דופן המבחנה, גרדו אותו לתוך התמיסה. בעזרת טיפ של פיפט, בצעו פיפטינג (שאיבה ושחרור) למעלה ולמטה, ולאחר מכן יש להעביר את הפפטידים התלוים בסוניקציה באמבט אולטרסוני Sonica למשך דקה אחת עד שתיים.לאחר הסוניקציה, הוסף את תמיסת הפוספט וערבב על ידי פיפטינג (שאיבה והוצאה חוזרת). לאחר מכן, סבב את המבחנה בצנטריפוגה במהירות של 16,000 G למשך 10 דקות. בזמן שהצנטריפוגה פועלת, הכן את המצלמה לשלבי הצילום עבור קישור צלב (cross linking).יש להגדיר את השהיית התריס של המצלמה לשנייה אחת ולטעון את התריס. לאחר סיום הסבוב של המבחנות בצנטריפוגה, יש להכין אליקוטים של 18 µL של תמיסת הפפטיד במבחנות PCR שקופות בנפח 0.2 mil. אליקוטים אלו ישמשו לצילוב פוטו-כימי (photo crosslinking).הקפידו להפריש כמות מסוימת של תמיסת הפפטיד לשימוש כביקורת שלילית רגע לפני הצלבת הקשרים. הוסיפו מיקרוליטר אחד של ammonium per sulfate ומיקרוליטר אחד של ruthenium. כעת, הכניסו במהירות את המבחנה לתוך בקבוק זכוכית של 1.8 M והניחו את הבקבוק בתוך המגוף המחובר לחלקו הקדמי של גוף המצלמה.סגרו את המצלמה עם מגן העדשה ולחצו על ההדק. הדגימה מקרינה כעת למשך שנייה אחת. בזמני הקרנה ממושכים יותר, תגובות רדיקליות נרחבות גורמות לפירוק חלבונים.לאחר ההקרנה, הוציאו במהירות את מבחנת ה-PCR בעלת עובי דופן של 0.2 mil והוסיפו 10 µL של באפר לדגימות ג'ל שהוכן מראש ומכיל Beta mercaptoethanol. ניתן לאחסן את הפפטידים מקושרים למשך עד שבעה ימים בטמפרטורה של 20°C-. לפני ביצוע SDS page, הפרקציה וצביעת כסף.כדי לבחון את הפפטידים המקושרים (cross-linked), ניתן להשתמש ב-SDS page שגרתי ובצביעת כסף. בהערכת הנפחים, טעינה של 5 µL מתערובת התגובה אמורה להניב כ-130 pmol של פפטיד. מומלץ להשתמש במערכת Xcel Sherlock mini cell מבית in Vitrogen עבור electrophoresis של ג'ל ולביצוע צביעת כסף. בהתאם לפרסום של in Vitrogen, מספר IM 1 0 0 2, המדריך ל-electrophoresis של ג'ל precast מסוג no NOx, נתחו את ג'ל ה-SDS page לאחר צביעת כסף; הפוליפפטיד של ביקורת ללא קישור, GRF, רץ בעיקר כמונומר.GRF מקושר יוצר התפלגות ליגנד רציפה החל מדימר ועד הקסמר, כך שעוצמת הפס היחסית הנראית של האוליגומרים פוחתת באופן מעריכי עם עלייה במסה המולקולרית. קלציטונין לא מקושר רץ בעיקר כמונומר וחלקו כדימר. קלציטונין מקושר מניב התפלגות גודל ליגנד שסוטה באופן משמעותי מירידה מעריכית מונוטונית באזור זה.מונומר עד טטראמר, המרמזים על קיומם המוקדם של דימרים, טרימרים וטטראמרים שאינם מקושרים. Beta 40 רץ רק כמונומר, בעוד ש-pickup הפיק Beta 40. כל הליגנדים מראים עצימויות פס דומה בקירוב מהמונומר ועד הטטראמר, ולאחריהן ירידה בשפע של כל הליגנדים הגבוהים יותר.ללא קשירה צולבת. Beta 42 מייצר בעיקר שני פסים, פס מונומר ופס טרימר. פס הטרימר הוא ארטיפקט שנוצר על ידי קשירה צולבת של SDS.ב-Beta 42 נראה התפלגות גודל אולמרים מובחנת המורכבת משתי קבוצות. הקבוצה הראשונה, ממערך מנומר עד טרימר, מראה עמידה בעוצמה עם עליית סדר האולמר. בקבוצה השנייה, נצפתה התפלגות דמוית גבעה בין Teer ל-Hep Tor, כאשר המקסימום נמצא ב-Pentamer וב-Hexamer.הראינו לכם כיצד לבצע קישור צולב (cross-linking) לחלבון באמצעות pika לפי פרוצדורה זו. חשוב לזכור כאשר משתמשים בחלבון עמילואידוגני, יש לוודא שהתכשירים נקיים מאגרגטים כדי לקבל תוצאות הניתנות לשחזור. התנאים המוצגים כאן ובניסויים אלו ניתנים לשינוי ניסיוני בהתאם לליטים הרלוונטיים. וזהו זה.תודה לצפייה ובהצלחה בשימוש בניסוי האיסוף.

photo-induced-cross-linking-unmodified-proteins-picup-applied-to

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Aptamers הם ribo-/deoxyribo-oligonucleotides קצר נבחר על...

מבחר Aptamers עבור חלבון β עמילואיד, הסוכן סיבתי של מחלת אלצהיימר

חלבונים יכולים לאמץ מבנה מקורי או להתקפל בצורה לא נכונה לעמילואיד בלתי מסיס. תנאים המעדיפים את מסלול הקיפול הלא נכון מובילים להיווצרות סוגים שונים של סיבי עמילואיד. השיטות המתוארות כאן מאפשרות המרה מהירה של חלבונים מקומיים לעמילואיד במבחנה.

דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם<em&gt; במבחנה</em

בעוד התחבורה של חלבונים בתא שטח נלמדת בקלות יחסית, לדמיין את הסחר של חלבונים תאיים הוא הרבה יותר קשה. כאן, אנו משתמשים בשילוב מבני GFP photoactivatable ולהפגין שיטה לעקוב במדויק את החלבון המוצא לעמילואיד מהמערכה גולג'י לתאים למטה זרם ועיקבו אחרי שחרורה.

הדמיה הסחר תאיים של APP עם GFP Photoactivatable

העמילואיד-β (Aβ) -injected במודל חיה מאפשרת לממשל של כמות לבין מינים מוגדרים של שברי Aβ ומפחית הבדלים אינדיבידואליים בתוך כל קבוצת לימוד. פרוטוקול זה מתאר את intracerebroventricular (ICV) הזרקה של Aβ ללא מכשירים stereotactic, המאפשרת הפקה של ליקויים התנהגותיים אלצהיימר דמויי בעכברים נורמליים.

הזרקת intracerebroventricular של פפטידים עמילואיד-β בעכברים נורמליים כדי לגרום בחריפות גירעונות אלצהיימר דמוי קוגניטיבית

בזאת אנו מדווחים על פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי התשואות בטא עמילואיד טוהר גבוהה 42 (Aβ42) ו עמילואיד בטא 40 (Aβ40) פפטידים, מסוגל היווצרות oligomer. בטא עמילואיד הוא פפטיד צבירה נוטה, הידרופובי מאוד מעורב מחלת אלצהיימר. אופי amyloidogenic של הפפטיד עושה הטיהור שלה אתגר.

פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי תשואות גבוהות טוהר עמילואיד בטא 42 ו עמילואיד בטא 40 פפטידים, מסוגל גיבוש oligomer

התצהיר עמילואיד מהווה סימן היכר של מחלות שונות, פוגעת באיברים שונים רבים. מאמר זה מתאר את היישום של זריחה oligothiophene מצומדת זורח מכתים בשילוב עם טכניקות במיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית. שיטה זו מכתימים מייצגת כלי רב עוצמה עבור זיהוי וחקירה של אגרגטים חלבון ב setups קליניים ומדעיים.

הדמיה עמילואיד ברקמות מוכתם Oligothiophenes מצומדת זורח על ידי היפרספקטרליות קונאפוקלית מיקרוסקופ והדמיה שלמים קרינה פלואורסצנטית

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין oligomers Aβ פפטיד סינתטי במבחנה וכן להעריך כמויות יחסיות של אוליגומר Aβ על ידי נקודה סופג ניתוח.

הכנה A11-חיוביות β-עמילואיד אוליגומר והערכה באמצעות נקודה סופג ניתוח

פרוטוקול לסינתזה של 1, 2-dithiolane ששינה פפטיד ואפיון המבנים סופרא מולקולרית הנובע פפטיד הרכבה עצמית.

סינתזה ואפיון של 1, 2-Dithiolane ששינה פפטידים וההספק עצמית

מאמר זה מתאר כיצד ניתן ליישם מיקרוסקופ דו-פוטוני רגיש לקיטוב כדי לאפיין את הארגון המקומי בתוך מבני-על-עמילואיד-ספרוליטים נטולי תוויות. הוא גם מתאר כיצד להכין ולמדוד את הדגימה, להרכיב את ההתקנה הנדרשת, ולנתח את הנתונים כדי לקבל מידע על הארגון המקומי של סיבי עמילואיד.

מיקרוסקופ שני פוטונים רגיש לקיטוב לאפיון מבני עמילואיד ללא תוויות

כאן, אנו מציגים שיטה שיטתית המתארת את ההרכבה העצמית הכמעט הפיכה של אגרגטים זהב 20 ננומטר מצופים עמילואיד בטא 1-40 (Aβ 1-40). הרשת הכמעט הפיכה התלויה בגודל ננו בין פפטידים הייתה בקורלציה עם חומצות אמינו ספציפיות או חלקים של מונומר Aβ 1-40.

אפיון הרכבה עצמית הפיכה תלויה ב-pH של קולואידים זהב מצופים עמילואיד בטא 1-40

חקור את שיטת PICUP לניתוח התפלגות גודל האוליגומרים בפפטידים אמילואידוגניים הקשורים במחלות נוירודגנרטיביות. השיטה משתמשת באור עז לקישור קוולנטי של דימרים ואוליגומרים לצורך חקר תכונות מבניות.

תמונה-induced cross-linking של חלבונים ללא שינוי (PICUP) יישומית כדי פפטידים Amyloidogenic

גלה סרטונים נוספים