תסיסנית הזחל Dissection NMJ

הליך זה מתחיל בהנחת זחל בשלב השלת השלישי על פלטת נתיחה. סיכות ממוקמות בקצוות האחורי והקדמי של הזחל. נעזרים במספריים כדי לחתוך את הזחל ולפתוח אותו, ובפינצטה להסרת האיברים הפנימיים.

לבסוף, ארבעה סיכות נוספות מונחות בכל פינה של דופן גוף הזחליל כדי להחזיקו מתוח במהלך הקיבוע. שלום, אני ג'ונתן ברנט מהמעבדה של בריאן מקייב במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה מולקולרית באוניברסיטת קולומביה, המכללה לרופאים ומנתחים. היום נראה לכם את הפרוצדורה לניתוח זחליל דרוזופילה ו-MJ.

אנו משתמשים בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור את התפתחות הסינפסות בצומת העצבי-שרירי. אז בואו נתחיל. בזחלי דרוזופילה, קיימים 30 שרירים לכל חצי-סגמנט (hemi segment), שסידורם בתוך דופן הגוף ההיקפית ידוע.

סך הכל 35 נוירונים מוטוריים מעצבבים שרירים אלו בתבנית סטריאוטיפית מאוד. כדי לגשת למסוף העצבי-שרירי (neuromuscular junction או NMJ), יש לבצע דיסקציה זהירה של כל זחל באמצעות כלי דיסקציה מתאימים. ניתן להשתמש ב-NMJ לצורך דימוי, אימונוהיסטוכימיה או אלקטרופיזיולוגיה.

התחילו את הפרוצדורה על ידי הנחת טיפה של HL 3.1 buffer על לוח ניתוח. הבופר מוכן מראש ומקורר על קרח. בחרו בזהירות פיתוחים (larvae) שלב שלישי בשלב נדידה מצד הבקבוק באמצעות פינצטה גדולה מפלדת אל חלד (SS).

התנועה מעידה על כך שהזחל טרם נכנס לשלב הבובנאות. הניחו את הזחל כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה בתוך טיפת התמיכה (buffer) על לוח הדיסקציה. התמיכה הקרה תרדימ את הזחל ותשמור אותו ללא תנועה. בעזרת פינצטה, מקמו סיכת מיקרונין בין הכדוריות האחוריות, ולאחר מכן מקמו סיכה שנייה קרוב לוותרי הפה הכהים, כך שהזחל יהיה מתוח ומוכן לפריסה.

בעזרת מספרי קפיץ, בצעו חתך אופקי קטן לכיוון הקצה האחורי של הזחלים. הכניסו להב אחת של המספריים לתוך החתך ובצעו חתך לאורכו לכיוון הקצה הקדמי של הזחל. לאחר מכן, בצעו חתכים אופקיים בקצה הקדמי של הזחלים, משמאל ומימין לסיכה.

כדי להסיר איברים כגון מערכת העיכול, הוסיפו מספר טיפות של HL 3.1 buffer לבעל החיים; מערכת העיכול ואיברים אחרים יצופו למעלה אל תוך התמיסה וניתן יהיה להסירם מהגוף באמצעות פינצטה. כמו כן, הסירו את מערכת הקשירה (tracheal system) יחד עם שאר האיברים. כעת חשפו את שרירי הגוף הפנימיים על ידי קיבוע לאחור של השוליים שנוצרו מהחתכים.

יש לוודא שמתיחות דפנות הגוף מתבצעת הן באופן אופקי והן באופן אנכי בעת קיבוע השוליים. הסר כל שאריות של איברים ושטוף פעם אחת.

בעקבות הוספת תמיסת HL 3.1 רעננה, הזחל מוכן כעת לקיבוע באמצעות פורמלדהיד שהוכן טרי ודולל ל-3.5% ב-one XPBS. טבול את הזחלים והמקבע באופן מלא והמתן 25 דקות. עם סיום תקופת הקיבוע, שטוף את הזחלים פעמיים בתמיסת HL 3.1 למשך שלוש דקות. הסר בזהירות את הסיכות והעבר את הזחלים לאنبובות של 1.5 mil המכילות one XPBS במידת הצורך.

ניתן לשמור את הזחלים למשך עד יומיים בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. לקבלת תוצאות אופטימליות, יש להשתמש בזחלים המפוצעים באופן מיידי. קיימים מספר רכיבים מרכזיים בזחל דרוזופילה שפוצע כהלכה.

ראשית, יש להיזהר לא לפגוע בשרירים, ובמיוחד בשרירים שש, שבע וארבע. שנית, יש למתוח את בעל החיים כראוי. אחרת, ייתכן שהחיבור העצבי-שרירי לא יהיה נגיש או ניתן להבחנה.

כאן ניתן לראות זחלי שחולקו כראוי. ה-NMJ נראה בבירור והמערכת מוכנה כעת לניסויים. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע דיסקציה לזחל בוווריד הוושט כדי לחקור את המפגש העצבי-שרירי.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב להוביל את השרירים כשהם שלמים. אם השרירים ייפגעו, לא יהיו מ سراגים עצביים-שריריים שניתן יהיה לחקור. זהו כל התהליך.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.