תסיסנית הזחל Dissection NMJ

הליך זה מתחיל בהנחת זחל בשלב גוזל שלישי (third instar) על לוח נתיחה. נעצים ממוקמים בקצוות האחורי והקדמי של הזחל. נעשה שימוש במספריים כדי לחתוך את הזחל ולפתוח אותו, ובפינצטה כדי להוציא את האיברים הפנימיים.

לבסוף, ארבעה סיכות נוספות מונחות בכל פינה של דופן הגוף של הזחל כדי להחזיקו מתוח במהלך הקיבוע. שלום, אני ג'ונתן ברנט מהמעבדה של בריאן מקייב במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה של התא באוניברסיטת קולומביה, המכללה לרופאים ומנתחים. היום נדגים לכם את ההליך לניתוח זחל דרוזופיליה ו-MJ.

אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי לחקור את ההתפתחות הסינפטית של הצומת העצבית-שרירית. לכן, בואו נתחיל. בזחלי דרוזופילה, ישנם 30 שרירים לכל חצי-סגמנט, שסידורם בתוך דופן הגוף ההיקפית ידוע.

סך הכל 35 נוירונים מוטוריים מעצבבים שרירים אלו בתבנית סטריאוטיפית מאוד. כדי לגשת לסינפסה עצבית-שרירית (NMJ), יש לבצע דיסקציה זהירה של כל זחל באמצעות טכניקת דיסקציה מתאימה. ניתן להשתמש ב-NMJ לצורך דימות, אימונוהיסטוכימיה או אלקטרופיזיולוגיה.

התחל את הפרוצדורה על ידי הנחת טיפה של HL 3.1 buffer על פלטת דיסקציה. ה-buffer מוכן מראש ומקורר על קרח. בחר בזהירות פגית בשלב ה-wandering third end star מהצד של המבחנה באמצעות פינצטה גדולה מפלדת אל חלד (SS).

התנועה מעידה על כך שהזחלים טרם נכנסו לשלב הגלגול. הניחו את הזחל כשהצד הגבי up בטיפת הבופר על פלטת הניתוח. הבופר הקר יאלחש את הזחל וישמור אותו ללא תנועה. בעזרת פינצטה, החדירו סיכת מנצ'ין (mnuchin pin) בין הכדוריות האחוריות, ולאחר מכן החדירו סיכה שנייה קרוב לוויי הפה הכהים, כך שהזחל יהיה מתוח ומוכן לפריסה.

באמצעות מספרי קפיץ, בצעו חתך אופקי קטן לכיוון הקצה האחורי של הזחלים. הכניסו להב אחד של המספריים לתוך החתך ובצעו חתך לאורכו לכיוון הקצה הקדמי של הזחל. לאחר מכן, בצעו חתכים אופקיים בקצה הקדמי של הזחלים, משמאל ומימין לסיכה.

כדי להסיר איברים כגון מערכת העיכול, הוסיפו מספר טיפות של HL 3.1 buffer לבעל החיים; מערכת העיכול ואיברים אחרים יצופו למעלה אל תוך התמיסה וניתן יהיה להסיራם מהגוף באמצעות פינצטה. כמו כן, הסירו את מערכת השוואכים יחד עם האיברים האחרים. כעת חשפו את שרירי הגוף הפנימיים על ידי קיבוע לאחור של השליחות שנוצרו מהחתכים.

הקפידו למתוח את דפנות הגוף בפתיחה אופקית ואנכית בעת קיבוע השוליים. הסירו שאריות של איברים ושטפו פעם אחת.

בעקבות הוספת תמיסת HL 3.1 טרייה, הזחלים מוכנים כעת לקיבוע באמצעות פורמאלדהיד שהוכן טרי ודולל ל-3.5% ב-XPBS אחד; טבלו את הזחלים ומסביבם את חומר הקיבוע באופן מלא והמתינו 25 דקות. עם סיום תקופת הקיבוע, שטפו את הזחלים פעמיים בתמיסת HL 3.1 למשך שלוש דקות. הסירו בזהירות את הסיכות, והעבירו את הזחלים למבחנות 1.5 ml המכילות XPBS אחד במידת הצורך.

ניתן לאחסן את הזחלים עד למשך יומיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לקבלת תוצאות מיטביות, יש להשתמש בזחלים המדוקרים באופן מיידי. ישנם מספר מרכיבים מרכזיים לזחל דרוזופילה שדוקר כראוי.

ראשית, יש להיזהר לא לפגוע בשרירים, ובמיוחד בשרירים שש, שבע וארבע. שנית, יש למתוח את בעל החיים כראוי. אחרת, ייתכן שהחיבור העצבי-שרירי לא יהיה נגיש או ניתן להבחנה.

כאן ניתן לראות זחל שנותח כראוי. ה-NMJ נראה בבירור והמערכת מוכנה כעת לניסויים. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לנתח זחל בקרבת הוושט כדי לחקור את המצמד העצבי-שרירי.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להשאיר את השרירים שלמים. אם השרירים ייפגעו, לא יהיו מגעים עצביים-שריריים (neuromuscular junctions) שניתן לחקור. זהו התהליך.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.