Name: תסיסנית הזחל Dissection NMJ (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: למדו את שיטת הניתוח של זחלי Drosophila להכנת מפרקי שריר-עצב לצורך הדמיה ואימונוהיסטוכימיה. פרוטוקול זה מספק טכניקה סטנדרטית לחקר עצביוני ופיתוח סינפטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

לפני שתתחיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות כל צריך להיות גדל ב 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HL3.1 חיץ לנתיחה עשוי להיות מוכן מראש. קחו aliquot 50 מ&quot;ל של HL3.1 ולשמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 15 מ&quot;ל של 3.5% פורמלדהיד טרי HL3.1. שמור את זה על הקרח. </li></ol> הזחל Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים טיפת HL3.1 קר בצלחת לנתיחה. זה ימשיך את החיה מן ייבוש להמם את החיה מה שמקל לעבוד איתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים ארוכים, בחר נדודים third הזחל instar ולמקם אותו טיפה של HL3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להשתמש במלקחיים קצר לתפוס סיכה minutien. מניחים את הסיכה בין spiracles האחורי. בעלי חיים בדרך כלל מנסים לזחול ולהתרחק הסיכה מתיחה עצמו ואת מה שמקל לך מקום סיכה ישר לראשו של זחל ליד ווים הפה. למתוח את החיה החוצה לאורכו. זה יעזור לכם למקסם את כמות קיר הגוף חשוף אתה יכול להשיג במהלך החיתוך. הערה: אם תבחר להצמיד את הראש ראשונה, החיה יכולה לעטוף את גופו סביב הפין או שוט גופו קדימה ואחורה ולכן קשה סיכה. בדרך כלל אפשר נגד זה על ידי הסרת HL3.1 ולשים טיפה קר טרי מהמם החי שוב. המדען המותאם לשתי יכול גם פשוט לתפוס את החיה להחזיקו במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספריים באביב שימוש לעשות חתך אופקי קדמית פשוט להצמיד האחורי בצד הגב של הזחל. מקום אחד להב המספריים לתוך החתך ולעשות חתך אנכי לאורך קו האמצע הגב לקראת סוף מקורי של הזחל. באותו דוכן של החיה לעשות חתכים אופקיים על ימין ועל שמאל של הסיכה. הערה: את התוצאה סיים צריך להיראות אני בצד הגב של הזחל לאורך ציר rostrocaudal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את האיברים. בגין על ידי הצבת כמה טיפות נוספות של HL3.1 על הזחל. זה יאפשר האיברים לצוף אל מחוץ לגוף ומאפשר לך להסיר אותם בקלות רבה יותר. ראשית, להסיר את מערכת קנה הנשימה. שנית, יש להשתמש במלקחיים כדי לתפוס את שאר האיברים ולהסיר אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך שלב 3 שביצעת כנף שמאל כנף ימין בקיר הגוף. הצמד את שולי כדי השעון לוודא למתוח את קיר הגוף אופקית ואנכית. </li></ol> קיבוע תקן כל חיה בפורמלין 3.5% HL3.1 במשך 25 דקות. לשטוף את החיה פעמיים HL3.1 במשך 5 דקות. אחסון הסר את הסיכות ולהעביר את הזחלים כדי צינור 1.5 מ&quot;ל המכיל 1X PBS. אם אתם מתכננים התמונה NMJ באמצעות תגי פלורסנט התמזגו, אתה צריך תמונה החיות בתוך יומיים. אתה יכול לאחסן את הזחלים גזור עד שבוע אחד 4 ° C. נציג תוצאות ישנם מספר מרכיבים מרכזיים הזחל תסיסנית גזור כראוי. ראשית, יש לטפל נוספת לא לפגוע השרירים, במיוחד שרירי 4, 6 ו 7. אלו הם השרירים הכי פופולרי ללמוד אם הם פגומים להתעלמות מכין פילה ו לנתח חיה אחרת. שנית, יש לוודא כי בעל החיים הוא נמתח מקסימאלי, כך שכל השרירים NMJ ניתן להבחין.

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. , 73-1137 (1993).</li>
<li>Feng, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

הטכניקה לנתיחה הפגינו וידאו זה יכול לשמש כדי להכין את הזחלים תסיסנית עבור מגוון רחב של טכניקות ניסוי. אם תגי חלבון פלואורסצנטי נוכחים, הזחלים יכול להיות מותקן הדמיה מיד. אחרת, immunostaining יכול להתבצע על מנת לסמן תאים סינפטי ספציפי. בנוסף, electrophysiology יכול בקלות להתבצע על הזחלים גזור כדי להעריך את התפקוד של עצבית. NMJ של תסיסנית צברה פופולריות רבה מאז מחקרים מוקדמים שהאיר המבנה הבסיסי של...

HL3 הצפת Dissection: (מ&quot;מ) 70 NaCl, KCl 5, 0.2 CaCl2, 20 MgCl2, 10 NaHCO3, 5 trehalose, 115 סוכרוז, ו 5 HEPES, pH 7.3.<br /<br /&gt; Sylgard פלייט הביתור: מערבבים בעדינות (כדי למנוע בועות) 10:01 ב מבחנה. יוצקים את התערובת לתוך צלחת פטרי (בכל גודל). אפשר SylGard לרפא לילה 37C חממה.

תסיסנית הזחל dissection nmj

Drosophila Larval NMJ Dissection

<em&gt; תסיסנית</em&gt; Neuromuscular צומת (NMJ) היא מערכת מודל הוקמה המשמשים במחקר של פיתוח הפלסטיות הסינפטית ו. השימוש הנרחב של<em&gt; תסיסנית</em&gt; מנוע מערכת נובע הנגישות הגבוהה שלו. זה יכול להיות מנותח עם רזולוציה של תא בודד. ישנם 30 שרירים לכל hemisegment אשר הסדר בתוך הקיר הגוף היקפי ידועים. סך של 35 נוירונים מנוע לצרף את השרירים האלה בדפוס כי יש איכות גבוהה. באמצעות הביולוגיה והגנטיקה המולקולרית, אפשר ליצור חיות טרנסגניות או מוטציות. לאחר מכן, אפשר ללמוד את ההשלכות על התפתחות המורפולוגיה והתפקוד של NMJ. כדי לגשת NMJ למחקר, יש צורך בזהירות לנתח כל הזחל. במאמר זה אנו מדגימים כיצד לנתח כהלכה<em&gt; תסיסנית</em&gt; הזחלים למחקר של NMJ על ידי הסרת כל האיברים הפנימיים תוך השארת הגוף קיר שלם. טכניקה זו מתאימה להכנת זחלים הדמיה, אימונוהיסטוכימיה, או electrophysiology.

פרוטוקול זה מדגים כיצד לנתח<em&gt; תסיסנית</em&gt; הזחלים לקראת אימונוהיסטוכימיה ו / או הדמיה של צומת neuromuscular.

תסיסנית הזחל Dissection NMJ

הצומת העצבי-שרירי (NMJ) של ה-Drosophila הוא מערכת מודל מבוססת המשמשת לחקר התפתחות סינפטית ופלסטיות. השימוש הנרחב...

הליך זה מתחיל בהנחת זחל בשלב גוזל שלישי (third instar) על לוח נתיחה. נעצים ממוקמים בקצוות האחורי והקדמי של הזחל. נעשה שימוש במספריים כדי לחתוך את הזחל ולפתוח אותו, ובפינצטה כדי להוציא את האיברים הפנימיים.לבסוף, ארבעה סיכות נוספות מונחות בכל פינה של דופן הגוף של הזחל כדי להחזיקו מתוח במהלך הקיבוע. שלום, אני ג'ונתן ברנט מהמעבדה של בריאן מקייב במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה של התא באוניברסיטת קולומביה, המכללה לרופאים ומנתחים. היום נדגים לכם את ההליך לניתוח זחל דרוזופיליה ו-MJ.אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי לחקור את ההתפתחות הסינפטית של הצומת העצבית-שרירית. לכן, בואו נתחיל. בזחלי דרוזופילה, ישנם 30 שרירים לכל חצי-סגמנט, שסידורם בתוך דופן הגוף ההיקפית ידוע.סך הכל 35 נוירונים מוטוריים מעצבבים שרירים אלו בתבנית סטריאוטיפית מאוד. כדי לגשת לסינפסה עצבית-שרירית (NMJ), יש לבצע דיסקציה זהירה של כל זחל באמצעות טכניקת דיסקציה מתאימה. ניתן להשתמש ב-NMJ לצורך דימות, אימונוהיסטוכימיה או אלקטרופיזיולוגיה.התחל את הפרוצדורה על ידי הנחת טיפה של HL 3.1 buffer על פלטת דיסקציה. ה-buffer מוכן מראש ומקורר על קרח. בחר בזהירות פגית בשלב ה-wandering third end star מהצד של המבחנה באמצעות פינצטה גדולה מפלדת אל חלד (SS).התנועה מעידה על כך שהזחלים טרם נכנסו לשלב הגלגול. הניחו את הזחל כשהצד הגבי up בטיפת הבופר על פלטת הניתוח. הבופר הקר יאלחש את הזחל וישמור אותו ללא תנועה. בעזרת פינצטה, החדירו סיכת מנצ'ין (mnuchin pin) בין הכדוריות האחוריות, ולאחר מכן החדירו סיכה שנייה קרוב לוויי הפה הכהים, כך שהזחל יהיה מתוח ומוכן לפריסה.באמצעות מספרי קפיץ, בצעו חתך אופקי קטן לכיוון הקצה האחורי של הזחלים. הכניסו להב אחד של המספריים לתוך החתך ובצעו חתך לאורכו לכיוון הקצה הקדמי של הזחל. לאחר מכן, בצעו חתכים אופקיים בקצה הקדמי של הזחלים, משמאל ומימין לסיכה.כדי להסיר איברים כגון מערכת העיכול, הוסיפו מספר טיפות של HL 3.1 buffer לבעל החיים; מערכת העיכול ואיברים אחרים יצופו למעלה אל תוך התמיסה וניתן יהיה להסיራם מהגוף באמצעות פינצטה. כמו כן, הסירו את מערכת השוואכים יחד עם האיברים האחרים. כעת חשפו את שרירי הגוף הפנימיים על ידי קיבוע לאחור של השליחות שנוצרו מהחתכים.הקפידו למתוח את דפנות הגוף בפתיחה אופקית ואנכית בעת קיבוע השוליים. הסירו שאריות של איברים ושטפו פעם אחת.בעקבות הוספת תמיסת HL 3.1 טרייה, הזחלים מוכנים כעת לקיבוע באמצעות פורמאלדהיד שהוכן טרי ודולל ל-3.5% ב-XPBS אחד; טבלו את הזחלים ומסביבם את חומר הקיבוע באופן מלא והמתינו 25 דקות. עם סיום תקופת הקיבוע, שטפו את הזחלים פעמיים בתמיסת HL 3.1 למשך שלוש דקות. הסירו בזהירות את הסיכות, והעבירו את הזחלים למבחנות 1.5 ml המכילות XPBS אחד במידת הצורך.ניתן לאחסן את הזחלים עד למשך יומיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לקבלת תוצאות מיטביות, יש להשתמש בזחלים המדוקרים באופן מיידי. ישנם מספר מרכיבים מרכזיים לזחל דרוזופילה שדוקר כראוי.ראשית, יש להיזהר לא לפגוע בשרירים, ובמיוחד בשרירים שש, שבע וארבע. שנית, יש למתוח את בעל החיים כראוי. אחרת, ייתכן שהחיבור העצבי-שרירי לא יהיה נגיש או ניתן להבחנה.כאן ניתן לראות זחל שנותח כראוי. ה-NMJ נראה בבירור והמערכת מוכנה כעת לניסויים. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לנתח זחל בקרבת הוושט כדי לחקור את המצמד העצבי-שרירי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להשאיר את השרירים שלמים. אם השרירים ייפגעו, לא יהיו מגעים עצביים-שריריים (neuromuscular junctions) שניתן לחקור. זהו התהליך.תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

במאמר זה אנו מדגימים כיצד לנתח את מערכת העצבים המרכזית של הזחלים third תסיסנית instar.

Dissection של מערכת העצבים המרכזית הזחל ב תסיסנית melanogaster

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע אימונוהיסטוכימיה על הזחל תסיסנית גזור.

תסיסנית הזחל NMJ אימונוהיסטוכימיה

הזחלים תסיסנית melanogaster לספק מערכת מודל אידיאלי לחקור את המנגנונים של תחבורה axonal בתוך העצבים סגמנטלי הזחל. באמצעות הליך זה, 3 rd הזחלים instar נושאת מוטציות שונות ניתן להשוות את הזחלים סוג בר.

ויזואליזציה של עצבים המגזרי הזחל ב 3 Rd Instar תסיסנית הכנות הזחל

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה הרדמה והדמיה של...

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

בתיקון אתר הקלטות מהדקות משמשות לאפיון אלקטרו של הנוירונים במעגלים ללא פגע. בדרוזופילה הגנטית מודל התיקון Clamping קשה בגלל מערכת העצבים המרכזיים היא קטנה ומוקף בנדן איתן. מאמר זה מתאר את ההליך כדי להסיר את הנדן ונקי נוירונים להקלטות מהדקות תיקון לאחר מכן.

הכנה<em&gt; דרוזופילה</em&gt; נוירונים מרכזיים עבור<em&gt; באתר</em&gt; התיקון clamping

בסרטון זה, סיבי עצב של זחלי דרוזופילה שקועים בצבע FM, אשר נקשר לשומנים בקרום התא. מיקרואלקטרודת יניקה ופולסים חשמליים מעוררים את תהליך האנדוציטוזה, ומשלבים את צבע FM בשלפוחיות אנדוציטיות שזה עתה נוצרו. שיטה זו, אשר מדמיינת שלבים presynaptic של neurotransmission, שימושי לחקר תפקוד סינפטי ושחרור נוירוטרנסמיטר.

העמסה ופריקה של צבע FM בתיווך מיקרואלקטרודה בתאי עצב של זחלי דרוזופילה

מורפולוגיה, גודל ומיקומם של אברונים תוך-תאיים נשמרים אבולוציונית ונראה כי הם משפיעים ישירות על תפקודם. הבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תהליכים אלה הפכה למטרה חשובה של הביולוגיה המודרנית. כאן אנו מראים כיצד ניתן להקל על מחקרים אלה על ידי יישום טכניקות כמותיות.

למה כימות Matters: אפיון פנוטיפים בבית<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחל Neuromuscular צומת

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה ונגישה באופן נרחב לפגוע עצבים סגמנטליים בזחלים תסיסנית לדמיין לכמת neurodegeneration של נוירונים המנוע בצומת neuromuscular (NMJ) של הזחלים instar השלישי.

פשוט Neuronal מכני מתודולוגיה פגיעה ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; נוירון מוטון ניוון

אנו מתארים טכניקת ניתוח המשמרת את הארכיטקטורה של הצומת הנוירו-שרירי ומאפשרת מחקר אימונוציטוכימי מפורט של נוירונים מוטוריים ברגלו הבוגרת של דרוסופילה .

ניתוח ואימונוהיסטוכימיה של הרגל הבוגרת של דרוסופילה לזיהוי שינויים בצומת הנוירו-שרירי עבור נוירון מוטורי מזוהה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לדמיין את רשתות microtubule בצמתים neuromuscular ותאי שריר. בשילוב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה של Drosophila melanogaster, פרוטוקול זה מקל מאוד על בדיקות גנטיות וניתוח דינמיקה של מיקרוטובולים עבור תפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים.

שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים

למדו את שיטת הניתוח של זחלי Drosophila להכנת מפרקי שריר-עצב לצורך הדמיה ואימונוהיסטוכימיה. פרוטוקול זה מספק טכניקה סטנדרטית לחקר עצביוני ופיתוח סינפטי.

תסיסנית הזחל Dissection NMJ

גלה סרטונים נוספים