Name: תסיסנית הזחל NMJ אימונוהיסטוכימיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: למד טכניקת אימונוהיסטוכימיה בזחלי Drosophila לחקר פיתוח סינפסות בנוירוביולוגיה. שיטה זו מאפשרת הדמיית חלבונים במפרק הנוירו-שרירי וחקר רגולציה גנטית של תהליכי התפתחות עצבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

לפני שתתחיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים: PBT (0.1% טריטון X100 ב 1X PBS), PBTB (0.2% BSA ב PBT), ו PBTN (NGS 2% PBTB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח הזחלים תסיסנית. נא עיין תסיסנית Dissection הזחל NMJ. </li></ol> אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הזחלים כדי צינור 1.5 מ&quot;ל המכיל PBT. שטפו את הזחלים פעמיים במשך 15 דקות ב PBT. הערה: לשטוף, במקום צינור 1.5 מ&quot;ל על מערבל nutator. הסר את הנוזל עם pippetor ולהחליף אותו נוזל טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBT. שטפי ב PBTB פעמיים במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBTB. שטפי ב PBTN פעמיים במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדגירים את הנוגדן העיקרי מדולל PBTN ב temp מקום 1 שעה או ב-C º 4 לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם PBTB. הערה: לשטוף פתרון להוסיף ולהסיר במהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים במשך 15 דקות ב PBTB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי ב PBTN במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של נוגדנים משני (ו נוגדן ראשוני מצומדות אם אתה משתמש אחד) מדולל PBTN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים בנייר אלומיניום דגירה עבור 1.5 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו פעמיים עם PBTB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים במשך 15 דקות עם PBTB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך גובר. </li></ol> הרכבה הערה: הר של גליצרול אם דגימות יהיה צילמו מיד. הר זהב ב להאריך אם דגימות יאוחסן לפני הדמיה (עבור יותר משבוע) או אם דגימות חייב להיות צילמו מספר פעמים. כדי להשתמש, במקום בקבוק להאריך באמבט 65 מעלות צלזיוס מים למשך 2-3 דקות. קח aliquot של זהב להאריך ולשמור על הבלוק החום בבית 45-50 º C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים preps מוכתם ב PBT כדי זכוכית שעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים קצת גליצרול בשקופית זכוכית נקייה לעיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת בעלי חיים להחליק עיבוד באמצעות בחירת אותם זכוכית השעון על ידי בפינה באמצעות מלקחיים. ודא שהם צד לציפורן למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הראש ואת הזנב בסכין גילוח טרי בשקופית עיבוד זכוכית. Exacto סכין עם להב # 16 עובד היטב עבור זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשקופית נוספת (הרכבה שקופיות), לשים טיפה קטנה של גליצרול / להאריך ולהפיץ אותה עם מלקחיים נקיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת בעלי חיים גזור כדי להחליק את הרכבה של קצה שלהם, נזהרת שלא להפוך אותם. נסה לעלות אותם בשורות בכיוון זהה. הר 6-8 חיות לכל שקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפה להחליק לכסות על ידי הצבת יתרון לתוך גליצרול / להאריך ולאט לאט משחררים אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את השקופית עם מסמר לכה. [הערה אל התמונה עד לכה הוא יבש. זה בדרך כלל לוקח עשר דקות. לקבלת דוגמיות רכוב בזהב להאריך, לתת השקופיות יבש במשך לפחות שלוש שעות לפני איטום או הדמיה.] </li></ol>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li>
</ol>

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא חיונית לחקר הביולוגיה NMJ משום שהוא מאפשר הדמיה של NMJ. מטרה זו מושגת על ידי שימוש בנוגדנים המזהים את הממברנה העצבית (למשל, HRP), את presynapse (למשל, CSP, SYT), ו / או postsynapse (למשל, DLG). מולקולות איתות, חלבונים מבניים, או חלבונים רומן עניין גם יכול להיות מוכתם. ואז, יכול להיות גנים שעברו מוטציה או missexpressed ו IHC יכול לזהות ההפרעות של המבנה הסינפטי ו / או איתות עצבי. NMJ של <...

<table><tbody><tr><td>סטריאומקרוסקופ &amp;#8220;Stemi&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>מקור אור KL 1500 LCD</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>פינצטת Dumont SS</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>פינצטת Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>מיקסר נוטטור Adams&amp;#8482;</td><td>BD Biosciences</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>סכין דיוק מס' 1</td><td>X-Acto</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>להבים מס' 16</td><td>X-Acto</td><td>216</td><td></td></tr><tr><td>ריאגנט למניעת דהייה ProLong Gold Antifade</td><td>Invitrogen</td><td>36930</td><td></td></tr></tbody></table>

תסיסנית הזחל nmj אימונוהיסטוכימיה

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

<em&gt; תסיסנית</em&gt; Neuromuscular צומת (NMJ) היא מערכת מודל הוקמה המשמשים במחקר של פיתוח הפלסטיות הסינפטית ו. השימוש הנרחב של<em&gt; תסיסנית</em&gt; מנוע מערכת נובע הנגישות הגבוהה שלו. זה יכול להיות מנותח עם רזולוציה של תא בודד. ישנם 30 שרירים לכל hemisegment אשר הסדר בתוך הקיר הגוף היקפי ידועים. סך של 31 נוירונים מנוע לצרף את השרירים האלה בדפוס כי יש איכות גבוהה. באמצעות הביולוגיה והגנטיקה המולקולרית, אפשר ליצור חיות טרנסגניות או מוטציות. לאחר מכן, אפשר ללמוד את ההשלכות על התפתחות המורפולוגיה והתפקוד של NMJ. אימונוהיסטוכימיה ניתן להשתמש בתמונה בבירור את מרכיבי NMJ. במאמר זה, אנו מדגימים כיצד להשתמש מכתים נוגדנים כדי להמחיש את<em&gt; תסיסנית</em&gt; הזחל NMJ.

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע אימונוהיסטוכימיה על הזחל תסיסנית גזור.

תסיסנית הזחל NMJ אימונוהיסטוכימיה

החיבור העצבי-שרירי (NMJ) של ה-Drosophila הוא מערכת מודל מבוססת המשמשת לחקר התפתחות סינפטית ופלסטיות. השימוש הנרחב...

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע צביעה אימונוהיסטוכימית על פסיקוסטים מנותקים של זחלי gsof כדי להמחיש חלבונים המעורבים בהתפתחות סינפטיות. לאורך הפרוצדורה נעשה שימוש במבחנה של 1.7 ml עבור דגירה של נוגדנים ראשוניים ומשניים, וכן עבור שלבי השטיפה. לאחר מכן, הזחלים מועברים לשקופית עיבוד שבה הם נגזמים באמצעות סכין Exacto לצורך התבוננות, והדגימות מועברות לטיפה של ריאגנט למניעת דהייה (anti-fading reagent).על גשריות הרכבה, זכוכית כיסוי נחתמת לבסוף לגשרית באמצעות לק ציפורניים. שלום, אני ג'ונתן ברנט מהמעבדה של בריאן מקייד במחלקה לפיזיולוגיה וביופיזיקה תאית בקולג' לרפואה של אוניברסיטת קולומביה. אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי לחקור את הוויסות הגנטי של היווצרות סינפסות במעבר העצבי-שרירי ובצומת רנדון מתפתח.אם כן, בואו נתחיל. לפני ביצוע אימונוהיסטוכימיה בפסולת זחלילי gsof n MJ, יש לבצע תחילה דיסקציה נאותה של הזחלילים. כדי ללמוד פרוצדורה זו, צפו במאמר הווידאו הנלווה שכותרתו Drosophila Larva N MJ Dissection.כדי להתחיל את הפרוצדורה, הכינו שלושה תמיסות טריות. ראשית, הכינו תמיסת PBT על ידי הוספת דטרגנט ל-PBS שהוכן טרי. שנית, קחו אליקוט של bovine serum albumin והוסיפו אותו לתמיסת PBT.כדי להכין PBTB, קחו serum של עז רגיל במיסב (aqua normal goat serum) והוסיפו אותו לתמיסת PB TB כדי להכין תמיסת PBTN. לאחר הכנת התמיסות הללו, העבירו את הזחליים למבחנה של 1.5 mil המכילה 1 mil של PBT. זהו השטיפה הראשונה.כל שטיפה כוללת החלפה של התמיסה שבה טבולות הזחלים ולאחר מכן דגירה של הזחלים במיקסר סיבוב (mutator mixer) במהירות נמוכה. אין להעביר את הזחלים מצנצנת לצנצנת, שכן פעולה זו תפגע בהם. שטיפה ראשונה זו נמשכת 15 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר 15 דקות של ערבוב, החליפו את ה-PBT ב-PBT טרי באמצעות פיפטה ושטפו את הלרוה (larvae) למשך 15 דקות נוספות. בעת החלפת תמיסות השטיפה, היזהרו תמיד שלא לפגוע בלרוה. עם סיום השטיפות ב-PBT, שטפו את הלרוה ב-PBTB למשך 30 דקות.חזור על שטיפה זו עם תמיסה טרייה למשך 30 דקות נוספות. עם סיום השטיפה ב-PBTB, השטיפה הושלמה. שטוף פעמיים עם PBTN למשך 15 דקות לכל שטיפה.במהלך שלב השטיפה השני, ניתן לדלל את הנוגדן הראשוני ב-PBTN בריכוז העבודה הרצוי. לאחר השטיפה, יש להדגיר את הזחלים בתערובת נוגדנים זו למשך שעה אחת עם ערבוב עדין בטמפרטורת החדר או למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. עם סיום ההדגירה, יש לשאוב את תמיסת הנוגדן הראשוני ולשטוף במהירות את הזחלים עם PBTB מספר פעמים כדי להסיר שאריות נוגדנים.כדי להכין את הזחלים לדגירה הבאה עם נוגדנים, שטפו אותם פעם אחת ב-PBTB למשך 15 דקות ושטפו פעמיים ב-PBTN למשך 30 דקות. דללו את הנוגדן המשני ב-PBTN בריכוז העבודה הרצוי והד기로 את הזחלים בתערובת זו למשך שעה וחצי. בטמפרטורת החדר, הקפידו לכסות את הזחלים כדי למנוע חשיפה לאור ולמזער הבהרה של floor four.לאחר שעה וחצי, הסר את תמיסת הנוגדן המשני ושטוף את הלרוות מספר פעמים נוספות ב-PBTB. כעת, שטוף את הלרוות ב-PBTV למשך 15 דקות, פעמיים. את כל שלבי השטיפה והאחסון הנותרים של הלרוות יש לבצע בחשיפה מינימלית לאור, לכן הקפד להשאיר אותן מכוסות.העבירו את הזחלים מהמבחנה בנפח 1.5 מ"ל אל PBT בתוך שקף עיבוד זכוכית. הזחלים מוכנים כעת להרכבה; כדי להרכיב את הזחלים הצבועים, השתמשו בתמיסת זהב מוארכת בחמם מים בטמפרטורה של 65 degrees Celsius למשך שתיים עד שלוש דקות. לאחר מכן, קחו Eloqua והניחו אותה על בלוק חימום המוגדר ל-50 degrees Celsius.מרחו מעט PB TB על שקופית עיבוד. העבירו את הלרואות אל ה-PB tb. סובבו את הלרואות כך שהם פונות כלפי מטה בצד הקוטיקולה באמצעות סכין Exacto עם להב מספר 16, וגזרו את הראשים והזנבות מהלרואות.ניתן להשתמש גם בתער לשלב זה. כעת הכינו את שקף ההרכבה על ידי הנחת 40 µL של gold prolonged מהמנה המחוממת על שקף נקי, ופזרו זאת מסביב בעזרת פינצטה נקייה. השתמשו בפינצטה.העבירו בזהירות שישה עד שמונה מהזחלים שהוכנו משקף העיבוד לשקף הקיבוע. נסו לשמור עליהם באותה אוריינטציה ולהשאיר את צדי הקוטיקולה פונים כלפי מטה לצורך קיבוע הזחלים. הניחו כיסוי זכוכית מעל התמיסה המוארכת.הניחו זאת על קצה אחד בפריפריה של הבריכה המוארכת והנחיתו בזהירות את מכסית הזכוכית כדי לכסות את הדגימות. אטמו את קצוות מכסית הזכוכית לשקופית באמצעות לק ציפורים עבה וזול בצבע המועדף עליכם. הניחו לשקופית להתייבש למשך שלוש שעות לפחות.אם הדגימות יוצגו בדימיג'ינג פעם אחת בלבד ומיד לאחר ההכנה, ניתן להחליף את תמיסת הזהב הממושכת בגליצרול. במקרה זה, זמן הייבוש של לק הציפורים והגליצרול הוא כ-10 דקות בלבד, בניגוד לשלוש שעות בכל פרוטוקול צביעה. המטרה היא לקבל אות ספציפי גבוה בשילוב עם רקע נמוך.דבר זה מושג באמצעות שימוש בנוגדנים באיכות גבוהה וביצוע יסודי של שלבי החסימה והשטיפה. תמונות אלה מציגות סינפסות של סוג פרא (wild type) וכן סינפסות מזן של זבוב המבטא קולטן BMP מסוג 2 מוטג, הידוע כמעטנט wishful thinking או witch. קרום הנוירון נצבע בכחול באמצעות נוגדן נגד horse radish peroxidase.שלפוחיות סינפטיות המוצגות באדום נצבעו עם נוגדן אנטי-סינפטי. הפוסט-סינפסה המוצגת בירוק נצבעו עם נוגדן נגד discs large. תוצאות אלו הראו כי מוטציה של קולטן BMP מסוג 2 גורמת לפנוטיפ של תת-צמיחה סינפטית.מוטציה זו הייתה מכרעת בביסוס ה-BMPs כאותים רטרוגרדיים המווסתים את מספר הבוטונים (butons) של הסיומות הסינפטיות. הרגע הראינו לכם כיצד לבצע אימונוהיסטוכימיה בחיבור עצבי-שרירי של גחון בzחלק מהוושט של זחלי. בעת ביצוע הליך זה.חשוב לבצע את הפרוצדורה בתזמון נכון כדי להבטיח שחזוריות מקסימלית ורקע נמוך. זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

drosophila-larval-nmj-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מדגים כיצד...

תסיסנית הזחל Dissection NMJ

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה הרדמה והדמיה של...

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

Arborization הנוירונים הדנדריטים חושית...

ניתוח מורפולוגי של תסיסנית הזחל היקפיים Neuron דנדריטים חושי האקסונים באמצעות פסיפסים גנטי

תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

כדי להבין כיצד צורות תאים מורכבים, כגון דנדריטים עצביים, מושגות במהלך הפיתוח, חשוב להיות מסוגל הארגון במדויק microtubule assay. כאן אנו מתארים את שיטת תיוג חזקים immunohistological לבחון ארגון microtubule הדנדריטים של נוירון דנדריטים arborization חושית, קנה הנשימה, שריר,...

תיוג Immunohistological של microtubules ב דנדריטים Neuron חושי, Tracheae, והשרירים של תסיסנית גוף Larva הכותל

צומת נוירומוסקולרי דרוזופילה (NMJ) משמש כמודל לחקר המורפולוגיה והתפקוד של סינפסות. סרטון זה מתאר תכונות חשובות שהחוקרים מכמתים כדי לאפיין את NMJ. הפרוטוקול לדוגמה מדגים תוכנה המסוגלת לבצע את הכימות באופן אוטומטי.

דרוזופילה כימות צומת נוירומוסקולרי (NMJ): שיטה להערכת מורפולוגיה ותפקוד סינפטיים

פרוטוקול זה מדגים כיצד סמיכות קשירת Assay יכול לשמש כדי לזהות באינטראקציות חלבון-חלבון אתרו בצומת העצבית-שרירית זחל תסיסנית. בעזרת טכניקה זו, שאו טאי גדול והו-לי דיסקים מוצגים בצורה מורכבת באזור postsynaptic, עמותה זוהתה בעבר באמצעות שיתוף immunoprecipitation.

זיהוי של באתר מכלולי חלבון-חלבון ב דרוזופילה הזחל Neuromuscular צומת שימוש סמיכות קשירת Assay

מורפולוגיה, גודל ומיקומם של אברונים תוך-תאיים נשמרים אבולוציונית ונראה כי הם משפיעים ישירות על תפקודם. הבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תהליכים אלה הפכה למטרה חשובה של הביולוגיה המודרנית. כאן אנו מראים כיצד ניתן להקל על מחקרים אלה על ידי יישום טכניקות כמותיות.

למה כימות Matters: אפיון פנוטיפים בבית<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחל Neuromuscular צומת

דוח זה מספק הליך הכנת מדגם חדש להדמיית צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה . שיטה זו יעילה יותר במניעת סלסול הדגימות בהשוואה לשיטה המסורתית והיא שימושית במיוחד עבור Drosophila neuromuscular junction ultrastructural analysis.

אופטימיזציה של תהליך הכנת הדגימה להעברת מיקרוסקופ אלקטרונים של צמתים עצביים-שריריים בזחלי דרוזופילה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי לדמיין את רשתות microtubule בצמתים neuromuscular ותאי שריר. בשילוב עם הכלים הגנטיים רבי העוצמה של Drosophila melanogaster, פרוטוקול זה מקל מאוד על בדיקות גנטיות וניתוח דינמיקה של מיקרוטובולים עבור תפקידם של חלבוני ויסות רשת מיקרוטובולים במערכת העצבים.

שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים

למד טכניקת אימונוהיסטוכימיה בזחלי Drosophila לחקר פיתוח סינפסות בנוירוביולוגיה. שיטה זו מאפשרת הדמיית חלבונים במפרק הנוירו-שרירי וחקר רגולציה גנטית של תהליכי התפתחות עצבית.

תסיסנית הזחל NMJ אימונוהיסטוכימיה

גלה סרטונים נוספים