Name: שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: למדו שיטת דימות לטווח ארוך באמצעות מיקרוסקופיית שני פוטונים וקונפוקלית בזמן אמת בזברה דגונית. השיטה מאפשרת חיתוך אקסונים ומעקב אחרי דינמיקה עצבית בפיתוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים סמן Terasaki לייעוץ ראשוני באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים ליצור נזק לרקמות מקומיות, קתי Joubin עצה על הרכבה הדמיה זמן לשגות, לבין Sagasti ו-Portera Cailliau מעבדות לדיונים. הניסויים הראשוניים בוצעו על ידי AS כמו עמית גראס קרן במעבדות לביולוגיה ימית בוודס הול, מסצ&#39;וסטס. עבודה במעבדה Sagasti נתמך על ידי מענקים מקרן וייטהול, קרן Klingenstein, וכן פרס קרן Wellcome בורוז קריירה במדעי הביולוגיה.

חלק 1: עוברי דג הזברה הרכבה הדמיה לטווח ארוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1% נמוך פתרון להמיס agarose להטבעת. ממיסים agarose במים DI על ידי חימום במיקרוגל, aliquot לתוך צינורות קטנים חנות בתוך גוש חימום על 42 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר עוברים הדמיה ולהסיר chorions שלהם על ידי משיכתו בעדינות סיסית בנפרד עם מלקחיים. עוברים ניתן להציב לתוך פתרון 5% האצבעות PTU ב 22-24 שעות שלאחר ההפריה (hpf) כדי לדכא היווצרות של פיגמנט. זה משפר את הבהירות של הדמיה הינה חיונית לביצוע שני הפוטונים axotomies של אקסונים חושית. אם פיגמנט טבעי מותר צורה, autofluorescence מאפילה על אקסונים מיקרוסקופ שני הפוטונים. האצבעות פתרון דג הזברה מכיל 116 mM NaCl, KCl mM 2.9, 1.8 מ&quot;מ CaCl 2, HEPES 5mm, pH 7.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עוברים על ידי הוספת ~ tricaine 0.02% ל PTU האצבעות. הפוך את החיות בטוח לא מגיב למגע לפני שתמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו את החדר לטווח ארוך הדמיה על ידי יישום גריז ואקום בצד אחד של טבעת זכוכית או טפלון ולתקן אותו להחליק על כיסוי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה חד העובר לתוך הפתרון agarose 42 מעלות עם pipet זכוכית, נזהר שלא להעביר יותר את האצבעות PTU, ולאחר מכן להעביר את העובר עם טיפה אחת agarose להחליק על כיסוי מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את העובר הרצוי כמו agarose מתקשה. זכור כי הקאמרית הדמיה יהיה התהפך כשתסיים כך להחליק לכסות יהיה המשטח העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש לך במה ממונע ובמקומות תמונה מרובות בבת אחת יכול, חזור על שלבים 1.4-1.6 עבור העובר כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר agarose כדי לחזק לחלוטין, ולאחר מכן למלא את הטבעת עם 0.02% tricaine PTU האצבעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח משחה ואקום לצד השני של הטבעת (ים), ואז לכסות את הטבעת (ים) עם זכוכית שקופית. תהפכו את חדר אטום (ים) מעל. לשכות אלה יכולים לשמש עבור הדמיה על מיקרוסקופים זקוף או הפוך. </li></ol> חלק 2: שני הפוטונים axotomy באמצעות אישית בנוי שני הפוטונים מיקרוסקופ עם TI-Sapphire Chameleon לייזר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכונו הדמיה. מניחים את העובר רכוב (ים) על מחזיק שקופיות מתחת למיקרוסקופ. פוקוס על העובר אחת עם מטרה (0.8 NA) 40X מים. הפעל את הלייזר. אנחנו כבר יכולים לדמיין reproducibly ונזק GFP להביע הנוירונים באמצעות הפרמטרים הבאים. כדי להמחיש אקסונים בהספק שאינו מזיק, הגדר לייזר באורך גל של 910 ננומטר (ננומטר) וכוח של 30 milliwatts (mW המפורטים הם את כמות החשמל בבית המדגם). פתח את תוכנת הדמיה. אנו משתמשים בתוכנה ScanImage שפותחה במעבדתו של קארל סוובודה 2, 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצו להתמקד כדי לסרוק את העובר עם לייזר שני הפוטונים, אתר את האקסון ברצונך axotomize, ו ללכוד תמונה של האקסון הזה. סמן את העמדות Z הראשונה והאחרונה, לרכוש את התמונה, ולעשות השלכה המרבי של ערימות Z. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדלה 70X על ענף של האקסון ברצונך axotomize ולהפסיק סריקה. הגדלת mW על המדגם לכוח המזיקות של 180 mW, ולבצע סריקה אחת עם הלייזר. אנו עושים זאת על ידי הגדרת מספר פרוסות ת&#39;עד 1 ולחיצה על &quot;גזל&quot;. זה אמור להיות מספיק כדי לנתק את האקסון. ראה דיון על שיטות לייעל את הליך זה עבור מיקרוסקופ שלך המטרה ניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זום החוצה, ולצמצם את כוח 30 mW ולקחת תמונה. </li></ol> חלק 3: שני הפוטונים axotomy על Zeiss 510 מיקרוסקופ confocal / שני הפוטונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום רכוב עובר לבמה ולהביא אותו אל המוקד באמצעות המטרה מים 25X או מטרה מתאים אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את שני הפוטונים (910 ננומטר) ארגון (488 ננומטר) לייזרים בסביבה מרובת המסלול, כך שאפשר לעבור מאחד לשני. למרות שגם לייזרים המשמשים לאיתור GFP, פליטת שני פוטונים הוא דמיינו עם אדום, ואת פליטת לייזר עם ארגון ירוק כדי להבדיל בין השניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש לייזר ארגון לזהות האקסון לפגוע. תחת הגדרות Z לסמן את הסעיפים אופטי הראשונה והאחרונה. קחו תמונה confocal וליצור הקרנת המקסימלי של מחסנית Z. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את האזור של האקסון להיפגע ולהביא את האזור למוקד. כבה את לייזר ארגון ולהדליק לייזר שני הפוטון. סרוק את הדגימה עם שני הפוטונים בעצימות לייזר של שידור ~ 9% על מנת לוודא כי האקסון הוא עדיין בפוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;עצור&quot;, כך כלי החיתוך יהיה זמין. השתמש לחתוך כדי להתמקד על שטח של עניין. בדרך כלל אנחנו הזום ~ 70X (זום ניתן לבדוק תחת הלשונית &quot;מצב&quot;). תחת הלשונית &quot;ערוצים&quot; לשנות את העוצמה של שני הפוטונים מן השידור ~ 9% לשידור% 15-20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתק את האקסון להפעיל את &quot;מהיר XY&quot; כפתור 1 על השני ואז ללחוץ על כפתור לעצור כדי למנוע נזק מיותר. האקסון יש לראות פסולת מפוזרות אם ההליך עבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח האקסוןנפגע לחזור 488 ננומטר ארגון לייזר, לקחת תמונה אחרת confocal, וליצור הקרנת מקסימלית. </li></ol> חלק 4: הדמיה Confocal זמן לשגות על Zeiss LSM 510 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכונו הדמיה. אם אתה משתמש במה מחומם, כדי להיות בטוח להפעיל אותו לפחות 30 דקות לפני הקמת הסרט זמן לשגות שלך. מניחים את העובר רכוב (ים) על מחזיק שקופיות מתחת למיקרוסקופ. פוקוס על העובר אחד עם המטרה האוויר הרצוי. אנו משתמשים 20X, 0.5 אובייקטיבי NA. פתח Zeiss LSM 510 תוכנת הדמיה. הפעל את הלייזר מתאים להגדיר את התצורה הרצויה. נעבור עתה לתאר פרוטוקול מפורט עבור הדמיה לטווח ארוך עם תוכנת LSM Zeiss זמן רב. שיטות אלה ניתן להתאים לשימוש מיקרוסקופ שלך עם תוכנת הדמיה שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המיקום ואת התצורה של העובר הראשון שלך בחלון זמן רב. פתח את הסריקה, במה, חלונות זמן רב. הפעל סריקה מהירה על חלון הסריקה. הזז את הבמה למצב XY הרצוי. סמן את העמדות Z הראשונה והאחרונה בחלון הסריקה. לחץ להפסיק, אמצע אז, גם בחלון הסריקה. חכו הסריקה של הפרוסה באמצע Z כדי לסיים, ולאחר מכן הקש עמדה בסימן בחלון הבמה. אם אתה רק הדמיה one העובר, לחץ על הכרטיסייה &quot;בית גיל&quot; בחלון זמן רב. לחץ על &quot;החלף XYZ&quot; ואז על &quot;שמור הגדרות&quot;. מסכים כאשר ביקש להחליף את התצורה הקודמת. המשיכו לשלב 4.4. אם יש לך במה ממוכן, באפשרותך להגדיר מיקומים מרובים עוברים מספר תמונות. במקרה זה, אתה צריך לבחור את &quot;מיקומים&quot; הכרטיסייה לפני הגדרת XYZ ותצורה עבור המיקום הראשון שלך. כמו כן, הקפד כי התפריט הנפתח מתחת הכרטיסייה &quot;מיקומים&quot; הוא על מיקום 1, וכי התפריט הנפתח בחלק תצורה אומר רב loc 1, לפני שאתה לוחץ על שמירת התצורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המיקום ואת התצורה של העוברים הנותרים שלך בחלון זמן רב. אתר העובר הבא שלך, ולאחר מכן לחץ על סריקה מהירה, להזיז את הבמה למצב XY הרצוי, סימן עמדות הראשונה והאחרונה שלך Z בחלון הסריקה. לחץ להפסיק, אמצע אז, גם בחלון הסריקה. חכו הסריקה של הפרוסה באמצע Z כדי לסיים, ולאחר מכן הקש עמדה בסימן בחלון הבמה. לחץ על &quot;החלף XYZ&quot;. בדוק את התפריט הנפתח ממש מתחת ללשונית &quot;מיקומים&quot; הוא על מיקום 2, וכי התפריט הנפתח בחלק תצורה אומר loc רב 2, ואז ללחוץ על &quot;שמור הגדרות&quot;. מסכים כאשר ביקש להחליף את התצורה הקודמת. חזור על תהליך זה עבור העוברים הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת פרמטרים לרכישת התמונה בחלון Loc רב. בחר את האפשרות GR-GL בסעיף &quot;רשימה של בלוקים&quot;, ולאחר מכן להזין את מספר החזרות הרצוי של הקבוצה. זהו מספר הפעמים confocal תרכוש תמונה במיקום זה. הזן את המרווח הרצוי לחכות בסעיף פרמטרים. זהו משך הזמן מתחילת החזרה one הדמיה כדי להתחיל את החזרה הבאה. בחר &quot;ZStackXY&quot; בסעיף תצורה. הזן את שם הקובץ בסיס בחלק התחתון. לחץ על &quot;DB בחר תמונה&quot; ובחר mdb שלך. לחץ על כפתור &quot;אפשרויות&quot;. בחר בתיקיית mdb שלך להציל את הקבצים הזמניים. בדוק &quot;לשמור על התמונה הסופית פתוח&quot;, &quot;להציל את התמונה הסופית&quot;, ו &quot;באמצע הערימה z&quot;. בחר להמתין מרווח. לחץ על אישור כדי לסגור את חלון אפשרויות. לחץ על &quot;הזמן להתחיל&quot;. השאירו חלון פתוח זמן רב למשך של הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח הנתונים. כאשר זמן לשגות הדמיה סיימה, את התוכנה זמן רב ירכז את כל הקבצים הזמניים שלך לתוך קובץ סיכום עבור כל מיקום. אם אתם רוצים לעצור את הסרט לפני שהוא מלא, הקפד ללחוץ על &quot;סיום&quot; במקום &quot;עצור&quot;, כך קובץ סיכום תיווצר. קבצים זמניים וקבצי סיכום צריך להיות נשמר אוטומטית לתיקיה mdb המיועד. מתפריט התוכנה LSM, לחץ על &quot;צפה 3D&quot;, ואז &quot;הטלה&quot;. עם קובץ סיכום שלך שנבחרה בתפריט הנפתח, לחץ על &quot;החל&quot;. זה יפיק תחזיות מרבי של מחסנית Z עבור כל תמונה confocal. בתפריט התוכנה LSM, לחצו על &quot;קובץ&quot;, ולאחר מכן &quot;ייצוא&quot;. שמור את תחזיות המרבי כסדרה של קבצי tif. לאחר מכן תוכל ליצור סרט מתוך סדרה של קבצי tif באמצעות ImageJ או QuickTime Pro. אקסונים בתמונות LSM ניתן לייחס בשלושה ממדים באמצעות ניתוח התמונה בתוכנה (למשל NeuroLucida מ MicroBrightfield) כדי להפיק מידע כמותי מפורט על מורפולוגיה האקסון. </li></ol> חלק 5: תוצאות נציג ניסוי מוצלח יביא ייצוג מדויק של הדינמיקה הסלולרים של החלמה מפציעה האקסון. עוברים שלך יהיה בריא לאחר הדמיה, עם ניוון לא גלוי דופק חזק. Axotomy אמור לגרום נזק מדויק, רק ניתוק ענף מוגדר של האקסון. לא צריך להיות שום פגיעה אקסונים שמסביב מוות של תאים מינימלי. אנו מאמינים כי אנו רואים את מותו של תא אפידרמיס בודד ישירות על האתר axotomy של 50% ~ של ניסויים. אם אתה מבחין יותר נזק, אתה צריך לייעל את פרוטוקול שני הפוטונים שלך כמתואר בדיון.

<ol><li>Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repulsive+interactions+shape+the+morphologies+and+functional+arrangement+of+zebrafish+peripheral+sensory+arbors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors.</a> Curr Biol. 15, 804-814 (2005).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2 (13), (2003).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
<li>Sacconi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multiphoton+nanosurgery+on+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502-050502 (2007).</li>
<li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li>
<li>Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosurgery%3A+functional+regeneration+after+laser+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822-822 (2004).</li>
<li>Quinto-Su, P. A., Venugopalan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+laser+cellular+microsurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of laser cellular microsurgery.</a> Methods Cell Biol. 82, 113-151 (2007).</li>
</ol>

השתמשנו בשיטות המתוארות במדויק axotomize אקסונים חושית הפריפריה ישירות לקיים התחדשות בעובר חי דג הזברה. ארוך טווח זמן לשגות הדמיה confocal של דג הזברה יכול לשמש כדי לצפות תהליכים התפתחותיים רבים in vivo. הליך שני הפוטונים axotomy המתואר יכול להיות שונה עבור מטרות רבות ניסויים שונים. השתמשנו הנוהל הכללי אותו לכרות trigeminal כל חושי הגוף תא עצב, על ידי התקרבות על גוף התא, ולא על ענף של האקסון היקפי. כל סוג תא מזוהה עם הקרינה עלולים להינזק או דווקא ablated עם כוח ממוקד של ה...

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

דג הזברה כבר מזמן מנוצל כדי ללמוד את המנגנונים תאית ומולקולרית של פיתוח על ידי הדמיה זמן לשגות של העובר שקוף החיים. כאן אנו מתארים שיטה לעלות עוברי דג הזברה הדמיה לטווח ארוך להדגים כיצד להפוך את לכידתו של זמן לשגות תמונות באמצעות מיקרוסקופ confocal. כמו כן, אנו מתארים שיטה כדי ליצור נזק מבוקר, מדויקת ענפים בודדים של אקסונים חושית הפריפריה דג הזברה באמצעות כוח ממוקד של לייזר femtosecond רכוב על מיקרוסקופ שני הפוטונים. הפרמטרים עבור axotomy שני הפוטונים מוצלח חייב להיות מותאם לכל מיקרוסקופ. נדגים שני הפוטונים axotomy משני מיקרוסקופ אישית שני הפוטונים בנוי 510 Zeiss / confocal שני הפוטונים לתת שתי דוגמאות. נוירונים דג הזברה חושית trigeminal ניתן דמיינו ב-GFP קו מהונדס המבטא מונע על ידי האמרגן תא עצב תחושתי ספציפי 1. אנחנו צריכים להתאים את המודל הזה trigeminal דג הזברה ישירות לקיים התחדשות האקסון חושית חיים עוברי דג הזברה. עוברים מורדמים עם tricaine וממוקמים בתוך טיפת agarose כפי שהיא מחזקת. עוברים משותקת סגורים בתוך תא הדמיה מלאים phenylthiourea (PTU) האצבעות. מצאנו כי עוברי ניתן הדמיה ברציפות במשך 12-48 שעות בתאי אלה. תמונה confocal אחד הוא נתפס לאחר מכן כדי לקבוע את האתר הרצוי axotomy. האזור של עניין נמצא על מיקרוסקופ שני הפוטונים על ידי הדמיה אקסונים חושית תחת צריכת חשמל נמוכה שאינם מזיקים,. לאחר התקרבות באתר הרצוי axotomy, הכוח הוא גדל סריקה אחת של אזור מוגדר מספיק כדי לנתק את האקסון. הדמיה מרובים זמן לשגות במיקום מוגדר אז על מיקרוסקופ confocal ישירות לקיים axonal התאוששות מפציעה.

כאן אנו מתארים שיטה הרכבה עוברי דג הזברה הדמיה לטווח ארוך, שני הפוטונים הדמיה רקמות נזק טכניקות זמן לשגות הדמיה confocal.

דגי זברה שימשו במשך זמן רב לחקר המנגנונים התאיים והמולקולריים של ההתפתחות באמצעות דימוי מסוג time-lapse של העובר השקוף והחי.

כדי לחתוך אקסונים באמצעות דימות דו-פוטוני In vivo, מקמיים עוברים של דגי זברה המורדמים בתוך טיפה של agarose בעוד היא מתקשה בתא ייעודי המורכב מתושבת TEFL וכיסוי זכוכית (cover slip). פלטת זכוכית מונחת על גבי התא, אשר הופך לאחר מכן למצב הפוך לפני ביצוע ה-axotomy. צלמו תמונת "לפני" של האקסון שברצונכם לחתוך בהגדלה של 40x, ולאחר מכן הגדילו ל-70x באזור שבו ברצונכם לבצע את ה-axotomy.כאשר הלייזר כבוי, הגבירו את הספק הלייזר. הפעילו את הלייזר לזמן קצר. בתמונת השאריות (after image) של האקסון, תראו שברים אקסונליים מפוזרים אם האקסוטומיה הצליחה.שלום, אני ג'ורג'יה אובריאן. שלום, אני סנדרה ריגו. ואני שונה מרטין.אנחנו מהמעבדה של Alvarez TI במחלקה לביולוגיה מולקולרית, תאית והתפתחותית באוניברסיטת קליפורניה לוס אנג'לס. היום נדגים לכם פרוצדורה לביצוע ex sodomy בדו-פוטון ודימוי קונפוקאלי בשיטת time lapse בעוברים חיים של דגי זברה. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי לחקור דגנרציה ורגנרציה של אקסונים סומטוסנסוריים פריפריאליים.בואו נתחיל. ראשית, נכין תמיסת agarose low melt בריכוז 1% לצורך הטמעה. נהמס את ה-agarose במים מזוקקים כפולה (double distilled water) על ידי חימום במיקרוגל, לפני שנחלק את התמיסה לשפופרות קטנות ונשמור אותן בבלוק חימום בטמפרטורה של 42 °C.ניתן להעביר את העוברים הראשונים לתמיסת רינגר עם 5% PTU כ-22 עד 24 שעות לאחר ההפריה כדי לעכב את היווצרות הפיגמנט, אשר מאופיין בפלואורסצנציה עצמית חזקה העלולה להסתיר את האקסונים במיקרוסקופ דו-פוטוני. לאחר מכן, נבחר את העוברים לדימוג ונסיר את המעטפת (chorion) על ידי הפרדה עדינה בעזרת פינצטה. לאחר בחירת העוברים, הם יאלחוש על ידי הוספת כ-0.02% tricaine לתמיסת הרינגר עם ה-PTU.לפני ההמשך, ודאו שהבעליים אינם מגיבים למגע. הכינו את תא הדמיה לטווח ארוך על ידי מריחת גריז ואקום על צד אחד של טבעת זכוכית או טפלון וקיבועה על לבישת זכוכית. יש להקפיד שלא להעביר כמות גדולה של PTU ringers.העבירו עובר אחד אל תמיסת ה-agro בטמפרטורה של 42 מעלות באמצעות פיפטת זכוכית. לאחר מכן, העבירו את העובר עם טיפה אחת של agros אל על זכוכית כיסוי מוכנה. לאחר ההעברה, מנחו את העובר כרצונכם בזמן שה-agros מתקשה.שימו לב כי תא הדמיה יתהפך בסיום הפעולה, כך ששקופית הנחושת תהיה השטח העליון. אם ברשותכם במה ממוטרת ואתם יכולים להדמה מספר מיקומים בו-זמנית, חזרו על שלבים אלו עבור כל עובר. המתינו עד שה-agarose יתמצב לחלוטין.לאחר מכן מלאו את הטבעת ב-0.02%tri canine PTU ringers. לבסוף, מרחו גריז ואקום בצדו השני של הטבעות. לאחר מכן כסו אותן בזכוכית תאורה.הפכו את תאי האיטום. כעת אנו מוכנים לדימות של שני עוברים בשלב ה-four ton exo tomy. כדי להכין את הדגימות לדימות, הניחו את העוברים המקובעים על תומך למשקופיות תחת המיקרוסקופ.בצעו מיקוד על עובר אחד באמצעות עדשת מים 40 x 0.8 numerical aperture. לאחר מכן, הפעילו את הלייזר. הגדירו את הלייזר לאורך גל של 910 nanometers ולהספק של 30 milliwatts.פתחו את תוכנת ההדמיה. אנו משתמשים בתוכנת סריקת תמונות שפותחה במעבדתו של Boar עבור אלמוגים. בהגדלה זו, ניתן לסרוק את השדה כדי למצוא אקסון מועמד לניתוק.ברגע שנמצא, צלם תמונה של האקסון המטרה. סמן את מיקומי ה-Z הראשוניים והאחרונים, רכוש את התמונה ובצע הקרנה מקסימלית (maximum projection) של ה-Z stacks. לאחר מכן, בצע זום של 70x על ענף האקסון שברצונך לבחון בפירוט.העלו את ההספק ל-180 milliwatts והגדירו את מספר פרוסות ה-Z לאחת. התחילו סריקה בודדת באמצעות הלייזר על ידי לחיצה על grab. פעולה זו אמורה להספיק כדי לחתוך את האקסון, עם זאת, יש לבצע אופטימיזציה של הליך זה עבור המיקרוסקופ שלכם והמטרה הניסויית.לבסוף, בצעו זום-אאוט. הפחיתו את ההספק ל-30 milliwatts וצלמו תמונה של האקסון שניתק acabado. אם במעבדה שלכם אין מיקרוסקופ דו-פוטוני שנבנה בהתאמה אישית, ניתן להשתמש גם במיקרוסקופ הקונפוקאלי הדו-פוטוני Zes five 10 כדי לנתק אקסונים.נתחיל בהנחת העובר המורכב על הבמה והבאתו למיקוד באמצעות עדשת מים 25 x. לאחר מכן, הדליקו את לייזר ה-two photon ואת לייזר ה-Argonne בהגדרה של רב-ערוצית (multi-track), כך שניתן יהיה לעבור מאחד לשני. למרות ששני הלייזרים משמשים לזיהוי GFP, פליטת ה-two photon מוצגת בצבע אדום ופליטת לייזר ה-Argonne מוצגת בצבע ירוק.על מנת להבדיל ביניהם, השתמש בלייזר של Argonne כדי לזהות אקסון שניתן לבחון תחת הגדרות Z. סמן את החתכים האופטיים הראשונים והאחרונים. צלם תמונה קונפוקלית וצור השלכה מקסימלית (maximum projection) של ה-Zack.כבה את לייזר הארגון והפעל את סריקת לייזר הפוטונים הכפולים בעוצמה של כ-9% transmission. כדי לוודא שהאקסון עדיין במיקוד, לחץ על כפתור העצירה (stop) כדי שיהיה ניתן להשתמש בכלי החיתוך (crop). השתמש בכלי החיתוך כדי להגדיל את אזור העניין.בדרך כלל אנו מזומזמים לכ-70 x. בחרו את אזור האקסון שיועבר לפגיעה והביאו אזור זה לפוקוס. ניתן לבדוק את רמת הזום תחת לשונית המצב (mode).בשלב הבא, תחת לשונית הערוצים (channels), שנו את עוצמת הפוטונים הכפולים (two photon) משידור של כ-9% ל-15% עד 30% שידור. כדי להפעיל את ההגדרות החדשות, לחצו על כפתור fast XY ולאחר מכן לחצו במהירות על stop. כדי למנוע נזק מופרז, האקסון צריך להיראות כשברים מפוזרים אם הפרוצדורה הצליחה.לבסוף, כדי לוודא שהאקסון אכן נפגע, חזרו ללייזר ה-Argonne ב-488 nanometer. צלמו תמונת קונפוקלית נוספת וצרו השלכה מקסימלית (maximum projection) של הצירים. כעת, לאחר שהדגמנו שתי דרכים לניתוק אקסונים באמצעות מיקרוסקופיית לייזר דו-פוטונית, נבחן דימות קונפוקלי של התחדשות בשיטת TimeLapse באמצעות ה-Zeiss LSM 510.להכנת דימוי במרווחי זמן (time lapse), ודאו שהבמה המחוממת דלוקה לפחות 30 דקות לפני הגדרת סרט ה-time-lapse. הניחו את העוברים המקובעים על תומך למשטחות תחת המיקרוסקופ. התמקדו בעובר אחד באמצעות עדשת האוויר הרצויה.אנו משתמשים בעדשה אובייקטיבית בעלת מפתח מספרי של 20 x 0.5, פותחים את תוכנת ההדמיה Zeiss LSM five ולאחר מכן מדליקים את הלייזרים המתאימים ומגדירים את התצורה הרצויה. פתחו את שלב הסריקה ואת חלונות ה-multi-time. אם ברשותכם תוכנת multi-time, הגדירו את המיקום והתצורה של העובר הראשון בחלון ה-multi-time.הפעלו את הסריקה המהירה (fast scan) בחלון הסריקה, ולאחר מכן העבירו את הבמה למיקום XY הרצוי. סמנו את מיקומי Z הראשונים והאחרונים בחלון הסריקה. לחצו על עצירה (stop) ולאחר מכן על אמצע (mid) גם כן בחלון הסריקה, והמתינו לסיום הסריקה של פרוס Z האמצעית.לאחר מכן לחצו על mark position בחלון הבמה. אם אתם מדמיינים עובר אחד בלבד, לחצו על לשונית single location בחלון multi-time. לחצו על replace X, y, Z. לאחר מכן לחצו על save configuration.אשרו כאשר תתבקשו לדרוס את התצורה הקודמת. כעת תוכלו להגדיר את הפרמטרים לרכישת תמונות בחלון ה-multi lo. אם ברשותכם במה מכנית, תוכלו להגדיר מספר מיקומים לצילום של מספר עוברים.במקרה זה, יש לבחור בלשונית המיקומים המרובים (multiple locations) לפני הגדרת ערכי ה-X, Y, Z והקונפיגורציה עבור המיקום הראשון. כמו כן, ודאו כי התפריט הנפתח שנמצא מיד מתחת ללשונית המיקומים המרובים מכוון למיקום אחד (location one), וכי התפריט הנפתח בסעיף הקונפיגורציה מציין מיקום רב אחד (multi lo one). לפני הלחיצה על שמירת קונפיגורציה (save configuration), הגדירו את המיקום והקונפיגורציה של שאר העוברים בחלון הרב-זמני (multi-time window).אתרו את סריקת המהיר (fast scan) הבאה של לחיצת העובר, לאחר מכן העבירו את הבמה למיקום XY הרצוי וסמנו את מיקומי Z הראשון והאחרון בחלון הסריקה. לחצו על stop. לאחר מכן לחצו על mid גם כן בחלון הסריקה, והמתינו לסיום הסריקה של פרוסת Z האמצעית.לאחר מכן לחצו על mark position. בחלון הבמה (stage), לחצו על replace X, Y, Z. ודאו שהתפריט הנפתח ממש מתחת ללשונית multiple locations מכוון ל-location two ושהתפריט הנפתח בסעיף ה-configuration מציין multi lobe two. לאחר מכן לחצו על save configuration. אשרו. כאשר תתבקשו לדרוס את התצורה הקודמת, חזרו על תהליך זה עבור שאר העוברים.הגדירו את הפרמטרים לרכישת תמונות בחלון multi lo. בחרו באפשרות GR GL מרשימת block section. לאחר מכן, הזינו את מספר חזרות הקבוצה הרצוי.זהו מספר הפעמים שבהם המיקרוסקופ הקונפוקאלי ירכוש תמונה בכל מיקום. הזן את מרווח ההמתנה הרצוי בסעיף הפרמטרים. זהו פרק הזמן שחל מההתחלה של חזרת דימוי אחת ועד להתחלה של הבאה.בחר ב-Zack XY בסעיף התצורה (configuration). הזן את שם קובץ הבסיס שלך בסעיף התחתון. לחץ על select image db ובחר את מסד הנתונים שלך.לחצו על כפתור האפשרויות, ולאחר מכן בחרו את תיקיית ה-MDB שלכם לשמירת קבצים זמניים. סמנו את האפשרות להשאיר את התמונה הסופית פתוחה. שמרו את התמונה הסופית, מרכז ה-Zack ובחרו את מרווח המשקל.לחצו על אישור כדי לסגור את חלון האפשרויות, ולאחר מכן לחצו על זמן ההתחלה (start time). השאירו את חלון מספר הזמנים פתוח למשך כל תקופת הדמיה. כעת הגיע הזמן לנתח את הנתונים שלכם.עם סיום הדמיון בשיטת time-lapse, תוכנת ה-multi-time תרכז את כל הקבצים הזמניים שלך לקובץ סיכום עבור כל מיקום. אם ברצונך להפסיק את סרטון הווידאו לפני השלמתו, הקפד ללחוץ על finish במקום על stop כדי שייווצר קובץ סיכום.קבצי הזמניים וקבצי הסיכום אמורים להישמר באופן אוטומטי בתיקיית ה-MDB הייעודית. להלן דוגמה מייצגת של סרט confocal בשיטת time lapse העוקב אחר ex otomy ב-54 שעות לאחר ההפריה. הפריים הראשון מציג מבט גבי של האקסון לפני ה-ex otomy, כאשר חץ צהוב מצביע על אתר ה-ex otomy בנקודת הזמן הבאה.סרט ה-Lapse מתחיל בתוך שעה לאחר ה-ex otomy ונמשך 12 שעות. סט (stack) קונפוקלי אחד נאסף מדי 20 דקות. סרט קונפוקלי זה מוקלט באמצעות אותם פרמטרים ב-78 שעות לאחר ההפריה.הפריים הראשון מציג מבט צידי של האקסון לפני ה-ex sodomy, כאשר חץ צהוב מצביע על אתר ה-ex sodomy. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לייצר נזק רקמתי מדויק ולהדגים עוברים חיים של zebrafish באמצעות two photon sodomy ודימויי confocal של time-lapse. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב למטב את עוצמת ההספק המשמשת ל-two photon laser ex sodomy כדי למנוע נזק עודף.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוי שלכם.

two-photon-axotomy-time-lapse-confocal-imaging-live-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת שליטה של ​​פוטונים בעלי אנרגיה נמוכה עם חדירה עמוקה אופטי phototoxicity מופחת. אנו מתארים את השימוש בטכנולוגיה זו עבור תיוג תא חי עוברי דג הזברה. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות לזירוז, תמונה של אור תגובה מולקולות שונות.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

בסרטון הזה, טכניקות הדמיה ססגוניות זמן לשגות confocal ו אבלציה תא ממוקד מסופקים. זמן לשגות הדמיה משמש כדי לפקח על התנהגותם של תאים מסוגים שונים של...

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

הסרטון הנוכחי מדגים שיטה אשר מנצל שילוב של electroporation ו מיקרוסקופיה confocal לבצע הדמיה לחיות על הפרט ובתאים עצבית forebrain דג הזברה מתפתח.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

סרטון זה מתאר את השיטה לפצוע אקסונים בעוברים של דגי זברה באמצעות שתי אקסוטומיות לייזר פוטונים וצפייה בהתאוששות אקסונלית מפציעה.

אקסוטומיה של לייזר דו-פוטון: שיטה לפצוע אקסונים בעוברים של דגי זברה ולצפות בהתאוששות אקסונלית

מקור: Williams, A. L., et al. הדמיית זמן-lapse מרובת פוטונים כדי להמחיש התפתחות בזמן אמת: הדמיה של תאי פסגה עצבית נודדים בעוברי דג זברה. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מציג פרוטוקול הדמיה מרובה פוטונים כדי לדמיין את הנדידה של תאי פסגה עצבית בעובר דג זברה בזמן אמת ברזולוציה גבוהה.

הדמיה של נדידת תאי פסגה עצבית בעובר דג זברה באמצעות הדמיית זמן-lapse מרובת פוטונים

confocal הדמיה זמן לשגות היא טכניקה רבת עוצמה שימושית לאפיון התפתחות עוברית. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה ולאפיין המורפוגנזה craniofacial בסוג פראי, כמו גם PDGFRA, smad5, וSMO עוברים שעברו מוטציה.

ניתוח Craniofacial המורפוגנזה בדג הזברה שימוש 4D מיקרוסקופיה confocal

מיטוזה היא קריטית לכל אורגניזם חי ופגמים מובילים לעתים קרובות לסרטן ולהפרעות התפתחותיות. באמצעות פרוטוקול הדמיה זה ודגי הזברה כמערכת מודל, חוקרים יכולים לדמיין מיטוזה באורגניזם בעל חוליות חי ואת שלל הפגמים המתעוררים כאשר תהליכים מיטוטיים פגומים.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

שילוב של טכניקות אופטי מתקדם של סריקת מיקרוסקופ עם זמן עירור קרינה פלואורסצנטית פוטון מרובה אורך גל לייזר בוצע כדי ללכוד דימות ברזולוציה גבוהה, תלת מימדי, בזמן אמת של הרכס העצבי הגירה ב Tg (sox10:EGFP) ו- Tg (foxd3:GFP) דג זברה עוברי.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

פרוטוקול זה מתאר גישה לתיוג תותוג טומוטו והדמיה רב ממדית של התפתחות עיניים מוקדמות של דגי זברה. אנו מתארים תיוג, הטמעה והדמיה בארבעה ממדים (4D) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר, ושיקולים למיטוב רכישת ערכות נתונים לניתוח מנגנונים של מורפוגנזה של אופטית.

הדמיה תלת מימדית של מורפוגנזה של גביע זברה אופטי

אנו מדגימים שיטה המנצלת סריקה מהירה של מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לבצע הדמיה חיה של תאי מיקרוגליה בטקטום האופטי המתפתח של דגי זברה, המאפשר ניתוח של הדינמיקה של תאים אלה in vivo.

הדמיה חיה ואפיון דינמיקה של תאי מיקרוגליה בעובר דג הזברה

למדו שיטת דימות לטווח ארוך באמצעות מיקרוסקופיית שני פוטונים וקונפוקלית בזמן אמת בזברה דגונית. השיטה מאפשרת חיתוך אקסונים ומעקב אחרי דינמיקה עצבית בפיתוח.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

גלה סרטונים נוספים