שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות
16 בפברואר 2009
כאן אנו מתארים שיטה הרכבה עוברי דג הזברה הדמיה לטווח ארוך, שני הפוטונים הדמיה רקמות נזק טכניקות זמן לשגות הדמיה confocal.
כדי לחתוך אקסונים באמצעות מיקום הדמיה של שני פוטונים In vivo, עוברי דג זברה מורדמים בתוך טיפת ארוס כשהוא מתקשה בתא מיוחד המורכב מכביסה TEFL והחלקת כיסוי. מנורת זכוכית מונחת על גבי החדר, אשר לאחר מכן מתהפכת לפני האוטומיה לשעבר. צלם תמונה קודמת של האקסון שברצונך לחתוך בזום של 40 x ל-70x באזור שברצונך להוציא מיז.
וכשהלייזר כבוי, הגבירו את עוצמת הלייזר. הפעל בקצרה את הלייזר. בתמונה שלאחר האקסון, תראה פסולת אקסונלית מפוזרת אם האוטומיה לשעבר הצליחה.
היי, אני ג'ורג'יה אובריאן. היי, אני סנדרה ריגו. ואני שונה מרטין.
ואנחנו מהמעבדה של אלווארז TI במחלקה לתא מולקולרי וביולוגיה התפתחותית באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס. היום נראה לך הליך לשני פוטונים לשעבר סדום והדמיה קונפוקלית בזמן-lapse בעוברי דג זברה חיים. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור ניוון והתחדשות של אקסונים סומטוסנסוריים היקפיים.
אז בואו נתחיל. כדי להתחיל, נכין פתרון אגרו נמס נמוך של 1% להטמעה. אנו ממיסים את האגרוס במים דיסטליים כפולים על ידי חימום במיקרוגל לפני השקיית אלק לצינורות קטנים ואחסון בבלוק חימום בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס.
ראשית ניתן להכניס עוברים לתמיסת צלצול PTU של 5% 22 עד 24 שעות לאחר ההפריה כדי לעכב את היווצרות הפיגמנט, שהוא בהיר, אוטו-פלואורסצנטי, ויטשטש את האקסונים במיקרוסקופ שני הפוטונים. לאחר מכן, אנו בוחרים עוברים להדמיה ומסירים את העוברים שלהם על ידי משיכתם בעדינות בעזרת מלקחיים. לאחר בחירת העוברים, הם מרדימים על ידי הוספת כ-0.02% טריקה לצלצולי ה-PTU.
לפני שתמשיך, ודא שבעלי החיים אינם מגיבים למגע. הכן את תא ההדמיה לטווח הארוך על ידי מריחת גריז ואקום על צד אחד של טבעת זכוכית או טפלון וקיבועו על החלקת כיסוי זכוכית. מקפידים לא להעביר הרבה מצלצולי ה-PTU.
העבירו עובר אחד לתמיסת האגרו של 42 מעלות בעזרת פיפטה מזכוכית. לאחר מכן העבירו את העובר עם טיפה אחת של אגרוס על פתק כיסוי מוכן. לאחר ההעברה, מקם את העובר כרצונך בזמן שהאגרוס מתקשה.
זכור שתא ההדמיה יתהפך כשתסיים, כך שהחלקת הנחושת תהיה המשטח העליון. אם יש לך שלב ממונע ואתה יכול לדמות מספר מיקומים בו זמנית, חזור על שלבים אלה עבור כל עובר. אפשר לורדים האגרו להתמצק לחלוטין.
לאחר מכן מלאו את הטבעת בצלצולי PTU של 0.02%tri כלבים. לבסוף, מרחו גריז ואקום על הצד השני של הטבעות. ואז מכסים אותם באור זכוכית.
הפוך את תאי האיטום. עכשיו אנחנו מוכנים לשתי הדמיית אקסו טומי של ארבעה טון. כדי להתכונן להדמיה, הנח את העוברים המותקנים על מחזיק שקופיות מתחת למיקרוסקופ.
התמקדו בעובר אחד עם יעד מים של צמצם מספרי של 40 x 0.8. ואז הפעל את הלייזר. הגדר את הלייזר לאורך גל של 910 ננומטר והספק של 30 מילי-וואט.
פתח את תוכנת ההדמיה. אנו משתמשים בתוכנת סריקת תמונות שפותחה באלמוגים עבור מעבדת חזיר הבר. בעוצמה זו, ניתן לסרוק את השדה בחיפוש אחר אקסון מועמד שייחתך.
לאחר שנמצא, צלם תמונה של אקסון המטרה. סמן את מיקום ה-Z הראשון והאחרון, רכוש את התמונה ובצע הקרנה מקסימלית של ערימות ה-Z. לאחר מכן, התקרב פי 70 על ענף האקסון שברצונך לפרט
.הגדל את ההספק ל -180 מיליוואט והגדר את מספר פרוסות ה- Z לאחת. התחל סריקה בודדת עם לייזר על ידי לחיצה על אחיזה. זה אמור להספיק כדי לנתק את האקסון, אולם יש צורך לייעל את ההליך הזה עבור המיקרוסקופ ומטרת הניסוי שלך.
לבסוף, התרחק. הפחת את ההספק ל-30 מילי-וואט וצלם תמונה של האקסון החדש שלנו. אם סקופ שני פוטונים שנבנה בהתאמה אישית אינו זמין במעבדה שלך, ניתן להשתמש במיקרוסקופ Zes five 10 קונפוקלי שני פוטונים גם כדי לנתק אקסונים.
אנו מתחילים בהנחת העובר המורכב על הבמה והבאתו לפוקוס באמצעות יעד של 25 x מים. לאחר מכן, הפעל את שני הפוטונים בלייזרים של ארגון בהגדרה מרובת מסלולים כך שניתן יהיה לעבור מאחד לשני. למרות ששני הלייזרים משמשים לגילוי GFP, פליטת שני הפוטונים מודגמת באדום ופליטת לייזר ארגון בירוק.
על מנת להבדיל בין השניים, השתמש בלייזר ארגון כדי לזהות אקסון שיחזיק מעמד תחת הגדרות Z. סמן את החלקים האופטיים הראשונים והאחרונים. צלם תמונה קונפוקלית וצור הקרנה מקסימלית של הזאק.
כבה את לייזר הארגון והפעל את סריקת לייזר שני הפוטונים בעוצמה של כ-9% שידור. כדי לוודא שהאקסון עדיין ממוקד, לחץ על לחצן העצירה כדי שכלי החיתוך יהיה זמין. השתמש בחיתוך כדי להגדיל את אזור העניין.
בדרך כלל אנו מתקרבים ל-70 x בערך. בחרו את האזור של האקסון שייפגע והביאו את האזור הזה למיקוד. ניתן לבדוק את הזום תחת לשונית המצב.
לאחר מכן, תחת לשונית הערוצים, שנה את עוצמת שני הפוטונים מכ-9%שידור ל-15 עד 30%שידור. כדי להפעיל את ההגדרות החדשות, לחץ על כפתור ה-XY המהיר ולאחר מכן לחץ על עצור במהירות לאחר מכן. כדי למנוע נזק עודף, יש לראות את האקסון כפסולת מפוזרת אם ההליך עבד.
לבסוף, כדי לוודא שהאקסון אכן ניזוק, חזור ללייזר ארגון 4 88 ננומטר. קח תמונה קונפוקלית נוספת וצור הקרנה מקסימלית של הזקס. כעת, לאחר שהראינו לך שתי דרכים לנתק אקסונים באמצעות מיקרוסקופ לייזר של שני פוטונים, נבחן הדמיית TimeLapse קונפוקלית של התחדשות באמצעות zes LSM five 10.
כדי להכין הדמיית זמן-lapse, הקפד להפעיל את הבמה המחוממת שלך לפחות 30 דקות לפני הגדרת סרט ה-time-lapse שלך. הנח את העוברים המותקנים על מחזיק שקופיות מתחת למיקרוסקופ. התמקדו בעובר אחד עם מטרת האוויר הרצויה.
אנו משתמשים בצמצם מספרי של 20 x 0.5 Objective, פותחים את תוכנת ההדמיה Zeiss LSM five 10 ולאחר מכן מפעילים את הלייזרים המתאימים ומגדירים את התצורה הרצויה. פתח את שלב הסריקה ואת החלונות הרב-זמניים. אם יש לך תוכנה רב-זמנית, הגדר את המיקום והתצורה של העובר הראשון שלך בחלון הרב-זמנים.
הפעל סריקה מהירה בחלון הסריקה, ולאחר מכן העבר את ה-stagה למצב ה-XY הרצוי. סמן את מיקום Z הראשון והאחרון בחלון הסריקה. לחץ על עצור ולאחר מכן על אמצע גם בחלון הסריקה, המתן לסיום הסריקה של פרוסת ה-Z האמצעית.
לאחר מכן לחץ על מיקום סימון ב-stagחלון. אם אתה מדמה רק עובר אחד, לחץ על לשונית המיקום היחיד בחלון הרב-זמנים. לחץ על החלף X, y, Z.לאחר מכן לחץ על שמור תצורה.
מסכים כאשר תתבקש לעקוף את התצורה הקודמת. עכשיו אתה יכול להגדיר את הפרמטרים לרכישת תמונות בחלון הרב-לו. אם יש לך שלב ממוכן, אתה יכול להגדיר מספר מיקומים כדי לדמות עוברים מרובים.
במקרה זה, עליך לבחור את הכרטיסיה מיקומים מרובים לפני הגדרת ה- X, Y, Z והתצורה עבור המיקום הראשון שלך. כמו כן, ודא שהתפריט הנפתח ממש מתחת לכרטיסיית המיקומים המרובים נמצא במיקום אחד ושהתפריט הנפתח בקטע התצורה אומר multi lo one. לפני שתלחץ על תצורת השמירה, הגדר את המיקום והתצורה של העוברים הנותרים שלך בחלון הרב-זמנים.
אתר את העובר הבא שלך לחץ על סריקה מהירה, ולאחר מכן הזז את ה-stage למיקום ה-XY הרצוי וסמן את מיקום ה-Z הראשון והאחרון שלך בחלון הסריקה. לחץ על עצור. ואז באמצע גם בחלון הסריקה, המתן לסיום הסריקה של פרוסת Z האמצעית.
לאחר מכן לחץ על מיקום סימון בחלון הבמה, לחץ על החלף X, Y, Z.בדוק שהתפריט הנפתח ממש מתחת לכרטיסיית המיקומים המרובים נמצא במיקום שתיים ושהתפריט הנפתח בקטע התצורה אומר ריבוי אונות שתיים. לאחר מכן לחץ על שמור תצורה. הסכים. כאשר תתבקשו להחליף את התצורה הקודמת, חזרו על תהליך זה עבור העוברים הנותרים.
הגדר את הפרמטרים לרכישת תמונות בחלון multi lo. בחר באפשרות GR GL ברשימת הבלוקים. לאחר מכן הזן את מספר החזרות הקבוצתי הרצוי.
זהו מספר הפעמים שהקונפוקל ירכוש תמונה בכל מקום. הזן את מרווח המשקל הרצוי בקטע הפרמטרים. זהו משך הזמן מתחילת חזרה אחת לתחילת ההדמיה הבאה.
בחר Zack XY בקטע התצורה. הזן את שם קובץ הבסיס שלך בחלק התחתון. לחץ על בחר תמונה db ובחר את מסד הנתונים שלך.
לחץ על כפתור האפשרויות ולאחר מכן בחר את תיקיית ה-MDB שלך כדי לשמור גם קבצים זמניים. סמן את השאר את התמונה הסופית פתוחה. שמור את התמונה הסופית, אמצע הזאק ובחר מרווח משקל.
לחץ על אישור כדי לסגור את חלון האפשרויות ולאחר מכן לחץ על שעת התחלה. השאר את החלון הרב-זמני פתוח למשך ההדמיה. עכשיו הגיע הזמן לנתח את הנתונים שלך.
כאשר הדמיית ה-Time-lapse הסתיימה. התוכנה הרב-פעמית תאסוף את כל הקבצים הזמניים שלך לקובץ סיכום עבור כל מיקום. אם ברצונך להפסיק את הסרט לפני השלמתו, הקפד להקיש על סיום במקום על עצור כדי שייווצר קובץ סיכום.
יש לשמור את הקבצים הזמניים וקבצי הסיכום באופן אוטומטי בתיקיית ה- MDB המיועדת. הנה דוגמה מייצגת לסרט קונפוקלי בהילוך מהיר לאחר אוטומיה לשעבר 54 שעות לאחר ההפריה. המסגרת הראשונה מציגה מבט גבי של האקסון לפני אוטומיה לשעבר עם חץ צהוב המצביע על אתר האוטומיה לשעבר בפעם הבאה.
סרט Lapse מתחיל תוך שעה לאחר אוטומיה לשעבר ונמשך 12 שעות. ערימה קונפוקלית אחת נאספה כל 20 דקות. סרטון קונפוקלי זה מוקלט באמצעות אותם פרמטרים 78 שעות לאחר ההפריה.
המסגרת הראשונה מציגה מבט רוחבי של האקסון לפני מעשה סדום לשעבר עם חץ צהוב המצביע על אתר מעשה הסדום לשעבר. זה עתה הראינו לך כיצד ליצור נזק מדויק לרקמות ולדמיין עוברי דג זברה חיים באמצעות מעשה סדום של שני פוטונים והדמיה קונפוקלית בזמן-lapse. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לייעל את כמות הכוח המשמשת לשני פוטונים לייזר אקס סדום כדי למנוע גרימת נזק עודף.
אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה עם הניסוי שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לקיבוע של עוברי דג הזברא (zebrafish) לצורך דימות לטווח ארוך, כולל דימות דו-פוטוני וטכניקות לגרימת נזק לרקמות. הטכניקה מאפשרת דימות קונפוקאלי בשיטת time-lapse של אקסונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצב
- טכניקות דימוי
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- דגי זברה הם אורגניזם מודל לחקר התפתחות נוירונלית.
- דימות לטווח ארוך הוא חיוני לצפייה בתהליכים דינמיים בעובריים חיים.
- דימות דו-פוטוני מאפשר דימות של רקמות עמוקות עם נזק מינימלי.
- הבנת התנהגות האקסונים חיונית למחקר במדעי המוח.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה לדימות של עוברי זבברוני (zebrafish).
- סיוע בחקר הדינמיקה של אקסונים לאורך זמן.
- מתן אפשרות לביצוע טכניקות של פגיעה ברקמות לצורך מניפולציה ניסויית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קיבוע עוברי zebrafish בתא ייעודי.
- שימוש בדימות דו-פוטוני להדמיית אקסונים.
- ביצוע טכניקות של פגיעה ברקמה כדי לחקור את התגובה האקסונלית.
- צילום תמונות קונפוקליות בשיטת time-lapse לצורך ניתוח.
תוצאות עיקריות
- דימוג מוצלח של אקסונים בעוברים חיים של דג הזברה.
- תצפית על שאריות אקסוניות לאחר כריתה מעידה על מניפולציה מוצלחת של הרקמה.
- הוכחת ההיתכנות של טכניקות דימוג לטווח ארוך.
- אספקת תובנות לגבי התנהגות אקסונית במהלך ההתפתחות.
מסקנות
- השיטה מאפשרת דימוי ארוך טווח יעיל של עוברי דגי zebrafish.
- דימוי בשיטת שני פוטונים הוא כלי בעל ערך לחקר דינמיקה נוירונלית.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על טכניקה זו כדי לחקור היבטים שונים של נוירוביולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת גרימה מדויקת וניתנת לשחזור של נזק לרקמה בעוברים חיים של דג הזברה למטרת חקר התחדשות אקסונית, ובכך היא תומכת בתיקוף מטרות בתהליך גילוי תרופות למדעי העצבים. באמצעות שילוב של אקסוטומיה (axotomy) בשיטת שני פוטונים עם דימוג קונפוקאלי לאורכי, השיטה מספקת מדדים כמותיים ודינמיים של מנגנוני תיקון עצביים. גישה זו מפחיתה את הסיכון בהשערות מכניסטיות על ידי קישור התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות להתאוששות תפקודית של האקסון במערכת הרלוונטית למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי מתן אפשרות לניתוק מבוקר של אקסונים להערכת השפעות של גנים או תרכובות על התחדשות.
- ערך תפעולי: מספק מודל נגף סטנדרטי להערכה עקבית של מסלולי תיקון אקסונליים.
- ערך ניבוי: תומך בוודאות לגבי המטרה באמצעות ויזואליזציה ישירה של התאוששות תלוית-מינון או תלוית-זמן בנוירונים תחושתיים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מייצר מדדים כמותיים של שרירי Axon ושל רגנרציה לצורך סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) של תרכובות נוירו-פרוטקטיביות או נוירו-רסטורטיביות.
- שחזוריות: מאפשר דימיון לאורך זמן (longitudinal imaging) למשך 12-48 שעות, מה שתומך בבדיקות time-lapse חסונות לניתוח קינטי של התיקון.
- قابליות להרחבה (Scalability): תואם להרכבה של מספר עוברים וללכידה קונפוקלית אוטומטית לצורך בדיקת תנאים במקביל.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה פגיעה באקסונים תחושתיים פריפריאליים, רלוונטית לכאב נוירופתי ולהתוויות של ניוון עצבי.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין מודולציה של מטרה גנטית לתוצאות פנוטיפיות של התחדשות אקסונים במערכת של חסרי חוליות.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהירה האם המטרות משפיעות על תוכניות גדילה פנימיות לעומת רמזי הדרכה חיצוניים במהלך ההחלמה.
שילוב זרימת עבודה ותהליכי עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בזרימות עבודה השולטות משלב הגילוי המוקדם ועד לשלבים הפרה-קליניים, ומאפשרת בדיקת היפותזות, יצירת מערכי בדיקה (assays) והשגת תובנות מכניסטיות עבור תוכניות המכוונות למערכת העצבים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבירור מסלולים ביולוגיים על ידי בידוד משתנים של התחדשות אקסונים לאחר פגיעה מדויקת שנגרמה על ידי פוטונים כפולים.
- סריקה: מספק מדדים סטנדרטיים וכמותיים של פרגמנטציה של אקסונים וצמיחה מחדש להערכת ספריות של תרכובות.
- אנליטיקה: מספק את נוכחותו/הי অনুপস্থিতו של פסולת אקסונלית וקינטיקה של התחדשות כנקודות סיום אובייקטיביות להשוואת תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין התערבויות מולקולריות לבין התאוששות תפקודית של אקסונים במערכת עצבים של חולייתים בשלבי התפתחות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה של דימות ונגע הניתנת לשימוש חוזר לצורך תיקוף חוזר של מטרות במספר פרויקטים של נוירוביולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית במחקרי התחדשות אקסונים באמצעות מעקב ישיר ובניראה אחר הפגיעה וההחלמה.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור באמצעות קיבוע עוברי סטנדרטי, כיול עוצמת לייזר ופרמטרים של צילום Time-lapse קונפוקאלי.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי קישור של מודולציה של מטרה לתוצאות התחדשות פנוטיפיות בשלב מוקדם של הגילוי.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תעדוף מטרות מותאם סיכון בהתבסס על השפעות מוכחות על קינטיקה של תיקון אקסונלי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בדגי zebrafish, בטיחות בלייזר דו-פוטוני ובמיקרוסקופיה קונפוקלית.
- תלוי בגישה למערכות לייזר פמטו-שנייה ניתנות לכיוונון ולמיקרוסקופים הפוכים עם יכולת Z-stack.
- מצריך סטנדרטיזציה של הספק הלייזר ומשך החשיפה בין מעבדות כדי להבטיח יעילות עקבית של האקסוטומיה.
- כולל אופטימיזציה של תנאי ההרדמה והקיבוע כדי לשמור על חיוניות העוברים במהלך דימות ממושך.
- מוגבל לענפי אקסונים שטחיים הנגישים באמצעות חדירה דו-פוטונית; מסלולים עמוקים יותר עשויים לדרוש מודלים חלופיים של פגיעה.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:47
Introduction
1:28
Mounting Zebrafish Embryos for Long-Term Imaging
3:25
Two-photon axotomy using a custom built two-photon microscope with a Chameleon Ti-Sapphire laser
4:42
Two-photon axotomy on Zeiss 510 confocal/ two-photon microscope
10:56
Outcome and Results
6:52
Confocal time-lapse imaging on Zeiss LSM 510
11:44
Conclusion
