Name: Mutagenesis האתר ביתי בימוי של פלסמידים שלמים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: למד מוטגנזיס אתר-ביתי בפלסמידים שלמים לביולוגיה מולקולרית. שיטה פשוטה וחסכונית להחלפת בסיסים ב-DNA באמצעות PCR ואנזים DpnI ליצירת וריאנטים של פלסמידים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עקרון השיטה: האתר מכוון mutagenesis של פלסמידים שלם הסביר זה וידאו היא שיטה mutagenesis אשר מאפשר לך לשנות את הגן היעד משובטים על ידי מחיקה החלפה, או החדרה של כמה בסיסים ישירות לתוך פלסמיד. זה עובד על ידי הגברה פלסמיד שלם, בתגובה PCR מבוססי הלא thermocycling. במהלך התגובה primers מוטגניות, נושאים את המוטציה הרצויה בצורה של חוסר התאמה של הפלסמיד המקורי, משולבים פלסמיד מסונתז החדש. לאחר הסרת של הפלסמיד המקורי מן התגובה פלסמיד מוטציה מקבל להפוך E. coli. השלבים הבאים הם לצורך הקרנה בלבד, כי יעילות מוטציה של שיטה זו הוא לא 100%. ההליך כולו לוקח שלושה ימים, אבל את החלק העיקרי אפשר לעשות בתוך יום אחד. 1.0 יום אחד: 1.1 Thermocycling התגובה: פלסמיד מקורי: אתר זה מופנה mutagenesis פרוטוקול עובד הכי טוב עם פלסמידים עד 10kb. פלסמידים גדולים יותר קצת קשה להשתנות בשיטה זו עלול לקחת קצת סבלנות והתאמת התנאים thermocycling ו / או תאים המוסמכות. יתר על פלסמיד אשר אתה עובד עם חייב להיות מבודד סכר + זן חיידקים. עבור התגובה thermocycling תצטרך 10-60 NGS של פלסמיד אתה רוצה להשתנות. Primers: לפני שאתה יכול להגדיר thermocycling התגובה שלך אתה צריך שיהיה לך primers שלך בהישג יד. אתה צריך בערך 150 ננוגרם של פריימר כל מוטגניות. זה בסדר אם אתה לוקח 1.5 μl של מניה מדוללת 1:10 100 AM. ישנם קווים מנחים פשוטים עליך לשקול בעת תכנון primers מוטגניות שלך: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Primers צריך להיות משלימים אחד את השני </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Primers צריך להיות בין 25 ל 45 נוקלאוטידים באורך </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוטציות בצורה של חוסר התאמה של הפלסמיד המקורי חייב להיות הכלול primers שני </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חוסר התאמה צריכה להיות ממוקדת פריימר ואת מוקפת לפחות 8 נוקלאוטידים בכל צד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Primers צריך GC-התוכן של 40% לפחות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Primers צריך סוף 5 הממשלה 3 ראש הממשלה עם אחד או יותר Gs או Cs </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Primers לא צריך להיות פוספורילציה, ואין להם להיות FPLC או PAGE מטוהרים, desalted רק הם צריכים להיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור חישוב אני לא צריך שום נוסחה, אבל אני על תעודת המשלוח צריך להיות גבוה מ 60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצורך ההקרנה היא מעשית להוסיף או למחוק אתר הגבלה עם מוטציה שלך. בשל ניוון של הקוד הגנטי יש הרבה אפשרויות להוספת אתר הגבלה עם המוטציה הרצויה. אתר האינטרנט של ניו אינגלנד Biolabs מספק כלי למצוא כזה אתר הגבלה המתאים. פשוט הזן רצף פריימר שלך המקודד ברצף חומצות האמינו לך רצון, באמצעות קוד העמימות עבור ה-DNA. הכלי מוצא אנזים אגיד לך אילו אתרים הגבלה ניתן הציג במקביל המוטציה הרצויה. אם אינך יכול למצוא בכל אתר אפשרי או מגבלה מעשית על ידי כך, אתה עשוי להכניס כל אתר חדשות ללא הגבלה לגבי הקוד הגנטי באתר של המוטציה. לאחר מכן אתה יכול להשתמש פלסמיד כתבנית עבור סדרה של מוטציות אשר באתר זה הגבלה יימחקו על ידי החדרה של primers מוטגניות חדש. גישה זו עשויה להיות מאוד נוח אם אתה מתכנן לעשות סדרה של מוטציות באותו אתר של הפלסמיד. </li></ul> ה-DNA פולימראז: בשיטה זו יש צורך thermostable-DNA פולימראז אשר מציג פעילות exonuclease &quot;3&#39;-5 ויוצר קצוות בוטה. אנחנו תמיד להשתמש רקומביננטי Pfu-פולימראז מ Fermentas. אם יש לך בעיות עם הצעדים הגברה אתה יכול לנסות פולימראז באיכות גבוהה יותר, אך לרוב המטרות Pfu רגיל יהיה מספיק. השלם את התגובה עם חיץ dNTPs פולימראז, ומים. 1.2 התנאים Thermocycling Thermocycler יש להגדיר באופן הבא. השלב הראשוני denaturation חוזר מוגדר 30sec על 95 ° C. הטמפרטורה חישול של primers לא חייב להיות מחושב עם נוסחאות מסובכות. אנחנו בדרך כלל להגדיר את הטמפרטורה חישול עד 55 ° C ו הזמן חישול דקה אחת. עבור primers של 25 עד 30 נוקלאוטידים אשר תשתמש בעיקר, זה עובד עבורנו 95% מהזמן. בכל אופן אם זה לא אמור לעבוד, פשוט לנסות שינוי הטמפרטורה חישול בין 50 - ו 60 ° C. הטמפרטורה התארכות תלוי פולימראז אתה משתמש. בהפגנה זו אנו משתמשים Pfu-פולימראז מ Fermentas, הקוראת התארכות בטמפרטורה של 72 ° C. התארכות הזמן משתנה בהתאם לגודל של הפלסמיד. אנחנו תמיד לחשב 1 דקות לכל קילו, ולהוסיף דקה אחת נוספת כיהזמן. לדוגמה, עבור פלסמיד 9kb היינו בוחרים 10min כמו התארכות זמן. 18 מחזורים מספיקים כדי ליצור מוטציה מספיק פלסמיד לשימוש נוסף. שמירה על מספר מחזורי נמוך, גם חוסך לך זמן. <img src="/files/ftp_upload/1135/figure1.png" alt="איור 1" width="600" height="287" /> 1.3 Gelcheck לאחר התגובה Thermocycling הגברה מוצלח צריך להיבדק על ידי ביצוע אלקטרופורזה. מיד לאחר הרכיבה הסתיימה, עומס 5 μl התגובה על ג&#39;ל 1% agarose טה. אם הגברה היה מוצלח, אתה צריך לראות להקה מובהק. עם זאת, אם ה-DNA מסונתז החדש אינו נראה לעין בבירור על הג&#39;ל, אתה יכול לנסות לזרז את התגובה שלם ולהשתמש בו עבור שינוי בשלב הבא. בשבילנו זה עבד לעתים רחוקות אבל זה שווה לתת צ&#39;אנס. הדבר הטוב ביותר לעשות אם התגובה אינה עובדת היא להתאים את הטמפרטורה חישול. 1.4 DpnI העיכול: לפני הטרנספורמציה הפלסמיד המקורי ששימש כתבנית יש להסיר מן התגובה למנוע רקע חזק. הדבר נעשה על ידי עיכול הגבלה עם DpnI. זה endonuclease הגבלה חתכים מפוגל רק פלסמיד. ההכרה שלה ואת האתר מגבלה הוא GATC רצף ואילו חייב להיות מפוגל. כאשר לעכל עם DpnI רק פלסמיד unmutated המקורי שהיה מבודד סכר + זן מקבל לחתוך, פלסמיד מוטציה מסונתז החדש אשר אינו מפוגל אינו מושפע DpnI. כל שעליך לעשות הוא להוסיף 1-2 μl של DpnI לתגובה ו דגירה זה לפחות שעה אחת ב 37 מעלות. בעת שימוש מהיר לעכל DpnI זמן הדגירה יכול להיות ירד ל כ 15 דקות. איכות DpnI שלך ואת תקופת הדגירה של עיכול הגבלה זו קובעת כיצד חזק מאוד הרקע שלך עם הפלסמיד unmutated יהיה. 1.5 טרנספורמציה: לאחר עיכול DpnI פלסמיד הוא מוכן לשינוי לתוך E. המוסמכת coli תאים. כל שעליך לעשות הוא להוסיף 5 μl מן התגובה העיכול DpnI לתוך התאים מוסמכת לבצע את השינוי בהתאם להמלצות במעבדה שלך. במקרה שלנו אנו משתמשים בהליך הלם חום דוגרים על ידי תערובת חיידקים פלסמיד על קרח למשך 30 דקות ולאחר מכן הלם החום אותו 42 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות. לאחר הוספת 200 μl-SOC פתרון, החיידקים מודגרת, רועד במרץ, בשעה 37 ° C עבור 1 ח אחרי שעה 1 החיידקים הם מצופה על בחירת המדיה אגר. 2.0 יום שני 2.1 הקרנת שיבוטים חלק 1: בחירה של שיבוטים בגלל יעילות מוטציה אינה 100% אתה צריך מסך מוטנטים שלך. אנו עושים זאת על ידי עיכול הגבלה שבו אנו לבדוק קיומו או אי קיומו של האתר מגבלה אשר הוספנו או נמחק באמצעות שילוב פריימר. לשם כך אנחנו בדרך כלל לבחור כשמונה מושבות ולגדל אותם במשך הלילה להכנת הפלסמיד למחרת. 3.0 שלושה ימים 3.1 הקרנת שיבוטים חלק 2: הגבלת העיכול עם האנזים סמן ביום השלישי אתה מבצע הכנה מיני ועיכול הגבלה לאחר מכן האנזים עם הסמן שלך. על הג&#39;ל אותך אז ניתן לראות בו את אחד השיבוטים שלך נושאים את המוטציה הרצויה ואלו לא. שיטת ההקרנה באמצעות עיכול הגבלה עובד טוב מאוד. עם זאת, עליך לוודא מוטציה מוצלחת שלך על ידי רצף.

<ol><li>Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuikChange+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Strategies%22%5BJournal%5D)">QuikChange site-directed mutagenesis.</a> Strategies. 9, 3-4 (1996).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

Mutagenesis האתר מכוון הוא mutagenesis, שיטה אשר מספק דרך מהירה מוטציות הגן נישא על ידי פלסמיד. תגובה כולו יכול להיעשות ביום אחד בלבד. באמצעות שיטה זו, היא תצטרך רק זוג primers חינם נושאת את המוטציות הרצוי והגהה פולימראז כגון פולימראז-Pfu. הפלסמיד מסונתז החדש ניתן להפריד את הפלסמיד ההורים על ידי לעכל את התגובה עם DpnI האנזים הגבלה. אנזים זה מעכל רק את ה-DNA מפוגל. לכן רק פלסמיד מסונתז החדש ניתן להפוך. במדריך זה אנו הפגינו ביצוע mutagenesis האתר מכוון באמצעות ערכת mutagenesis תוצרת...

<table><tbody><tr><td>Pfu polymerase (רקומביננטי או טבעי)</td><td>Fermentas</td><td>EP0571 or EP0501</td><td></td></tr><tr><td>תערובת dNTP 10 mM</td><td>Fermentas</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DpnI או DpnI Fast digest</td><td>Fermentas</td><td>ER1701</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>מנוקחים (desalted)</td></tr></tbody></table>

mutagenesis האתר ביתי בימוי של פלסמידים שלמים

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Mutagenesis האתר בבימויו של פלסמידים כולה היא דרך פשוטה ליצור וריאציות שונות במקצת של הפלסמיד המקורי. באמצעות שיטה זו הגן היעד משובטים ניתן לשנות על ידי מחיקה החלפה, או החדרה של כמה בסיסים ישירות לתוך פלסמיד. זה עובד פשוט על ידי הגברה פלסמיד שלם, בתגובה PCR מבוססי הלא thermocycling. במהלך התגובה primers מוטגניות, נושאים את המוטציה הרצויה, משולבים פלסמיד מסונתז החדש. זה וידאו של מורה לנו להראות דרך יעילה קל עלות להציג החלפות בסיס לתוך פלסמיד. פרוטוקול עובדת עם חומרים כימיים סטנדרטיים אינה תלויה ערכות מסחריות, אשר לעתים קרובות הן יקרות מאוד. יישום פרוטוקול זה יכול להפחית את העלות הכוללת של כתגובה שמינית ממה שזה עולה באמצעות כמה ערכות מסחריות. בסרטון הזה אנחנו גם להגיב על השלבים הקריטיים בתהליך ולתת הוראות מפורטות כיצד לתכנן את primers מוטגניות.

Mutagenesis האתר בבימויו של פלסמידים כולה היא דרך פשוטה ליצור וריאציות שונות במקצת של הפלסמיד המקורי. כאן אנו מדגימים דרך יעילה קל עלות להציג החלפות בסיס לתוך ריאגנטים באמצעות פלסמיד רגיל.

Mutagenesis האתר ביתי בימוי של פלסמידים שלמים

מוטגנזה מכוונת לאתר של פלסמידים שלמים היא דרך פשוטה ליצור וריאציות השונות מעט מפלסמיד מקורי. בשיטה זו, הפלסמיד המשובט...

שלום. שמי מארק בלו. אני סטודנט לתואר מתקדמים בביולוגיה מאוניברסיטת מאינס בגרמניה. היום, אני וחברי קאג'ו נרצה להדגים לכם כיצד לבצע נוירוגנזה מוכוונת-אתר בשיטה ביתית.השיטה פותחה במקור על ידי Ethal ועובדה על ידי רבים אחרים. לכן, כאשר מחפשים באינטרנט כיום, ניתן למצוא פרוטוקולים שונים רבים הנבדלים זה מזה בנקודות משמעותיות יותר או פחות. היום, נרצה להראות לכם דרך פשוטה וחסכונית שעובדת עבורנו היטב.אם כן, נתחיל. עבור ניסוי זה, דרוש DNA polymerase בעל יכולת proofreading ויציבות תרמית. אנו משתמשים תמיד ב-PFU polymerase מבית Fermentas. Logically.אתם זקוקים גם לבאפר פולימראז, תערובת DNTP ומים. בנוסף, אתם זקוקים לאנזים ההגבלה DpnI, תאי e coli כשירים, צלחת אגר, מרק תרבית חיידקים ומספר קיסמי שיניים. החלק החשוני והקריטי ביותר בשיטה זו הוא תכנון הפריימרים המוטגניים.ישנם מספר קווים מנחים פשוטים שיש לקחת בחשבון בעת תכנון זוג הפריימרים. הפריימרים צריכים להיות משלימים זה לזה ואורכם צריך להיות בין 25 ל-45 נוקלאוטידים. המוטציות מוכנסות בצורה של אי-התאמות (mismatches) ביחס לפלסמיד המקורי.האי-התאמות חייבות להופיע בשני הפריימרים ויש למקם אותן במרכז הפריימר, כאשר משני צדדיהן נמצאים לפחות שמונה נוקלאוטידים. הפריימרים צריכים להכיל תכולת GC של לפחות 40% ולהכיל G ו-C אחד או יותר בקצוות ה-5' וה-3' שלהם. לפני השימו

homemade-site-directed-mutagenesis-of-whole-plasmids

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו להדגים פרוטוקול פשוט ליצור ספריה מוטציה אקראית על רצף יעד נתון. אנו מראים כיצד שיטה זו, אשר מבוצעת in vivo של Escherichia coli, יכול להיות יחד עם בחירות פונקציונלי להתפתח פעילות אנזימטית חדשה.

בחירת הפרוטוקולים mutagenesis ו פונקציונאלי אבולוציה מכוונת של חלבונים א coli</em

מקור: Tomás, J. M., et al. יצירת מוטציות אפס כדי להבהיר את תפקידם של גליקוזילטרנספראזות חיידקיות בתנועתיות חיידקים. J. Vis. Exp. (2022).סרטון זה מדגים את ההגברה התלויה ביוזם של פלסמיד מתאבד ב - E. coli. הפלסמיד, הנושא גן עמידות לאנטיביוטיקה, משתכפל רק בנוכחות חלבון יוזם המקודד על ידי המארח. לאחר אלקטרופורציה ודגירה במדיום התאוששות, התערובת מצופה על אגר המכיל אנטיביוטיקה. חיידקים עם פלסמיד שורדים, מכיוון שהחלבון היוזם שלו מאפשר ביטוי של הגן העמיד לאנטיביוטיקה של הפלסמיד.

הגברה של פלסמיד מתאבד במארח חיידקים

מקור: Lea-Smith, D. J., et al. יצירת מוטציות מסומנות וחסרות סמן במינים ציאנובקטריאליים מודלים. J. Vis. Exp. (2016)הסרטון מדגים שיטה ליצירת מוטציות המסומנות באנטיביוטיקה בציאנובקטריה. הפרוטוקול מתחיל בתרבית ציאנובקטריה, ואחריו צנטריפוגה ושלבי שטיפה המשמרים את פני השטח. לאחר מכן מוצג פלסמיד הנושא גן עמידות לאנטיביוטיקה המוקף ברצפים הומולוגיים. במהלך הדגירה, הפלסמיד מופנם באמצעות פילי ומחליף את גן המטרה באמצעות רקומבינציה הומולוגית. בחירת אנטיביוטיקה וריסוק משמשים לבידוד וטיהור הזן המוטנטי.

יצירת מוטציות המסומנות באנטיביוטיקה בציאנובקטריה באמצעות רקומבינציה הומולוגית

אנו מציגים פרוטוקול עבור ההערכה התפקודית של ספריות mutagenesis רווי אתר יחיד המקיפות של חלבוני ניצול רצף תפוקה גבוהה. חשוב לציין, גישה זו משתמשת זוגות פריימר מאונכים לבצע ריבוב בניית רצף ספרייה. תוצאות נציג באמצעות TEM-1 β-lactamase שנבחר במינון רלוונטי קליני של אמפיצילין מסופקות.

פרוטוקול והערכה תפקודית של ספריות mutagenesis רווית Whole-חלבון ניצול רצף תפוקה גבוהה

הרחבת הקוד הגנטי מהווה כלי רב עוצמה כדי ללמוד מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, כולל חלבון acetylation. כאן אנחנו מדגימים פרוטוקול נתיישב לנצל בטכניקה זו ליצירת homogeneously acetylated חלבונים באתרים ספציפיים בתאים Escherichia coli .

פרוטוקול נתיישב לייצר חלבונים Site-Specifically Acetylated Escherichia Coli

מאמר זה מתאר מתודולוגיה מפורט אקראי מוטגנזה מכוונת של גנים היעד בביקוע שמרים. כדוגמה, אנחנו יעד rpt4 +, שמקודד של יחידת משנה של פרוטאוזום 19, וכן מסך מוטציות ביציבותה הטרוכרומטין.

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

מוטגנזה היא טכניקה המשמשת להציג מוטציות ספציפיות חומצה deoxyribonucleic (DNA). פרוטוקול זה מתאר איך לעשות מוטגנזה בצעד 2, 3-צעד תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) המבוסס על הגישה, אשר חלים על כל מקטע DNA עניין.

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

ניתן לפתח את הגבלת הגבלות עם ספציפיות רצף חדש מאנזימים המספרים על רצף מנוון באופן חלקי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט כי השתמשנו בהצלחה כדי לשנות את הספציפיות הרצף של האנזים NlaIV. מרכיבי המפתח של הפרוטוקול הם ממדר החוץ של התגובה שעתוק/תרגום ומבחר של משתנים עם משתני רצף חדש.

האבולוציה בבימויו של הגבלת מגבלות על הגבלה עם ספציפיות יותר מחמירות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר כלים חדשים למבחני קשירת SPR כדי לבחון קשירת CV-N ל-HA, גליקופרוטאין S, גליקנים היברידיים קשורים ואוליגוסכרידים עתירי מנוז. SPR משמש לקביעתK D לקשירת CV-N דימרי או מונומרי לגליקנים אלה.

הנדסת חומרים אנטי-ויראליים באמצעות תהודה פלסמונית על פני השטח

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפחתת שינויים ב-DNA בבקטריופאג'ים באמצעות האנזים NgTET, המאפשר מוטגנזה יעילה וללא צלקות של CRISPR-Cas. שיטה זו מאפשרת הנדסה גנטית של פאג'ים ליישומים בביוטכנולוגיה וטיפול בפאג'ים.

מוטגנזה מדויקת של פאג'ים עם מערכות CRISPR-Cas בסיוע NgTET

למד מוטגנזיס אתר-ביתי בפלסמידים שלמים לביולוגיה מולקולרית. שיטה פשוטה וחסכונית להחלפת בסיסים ב-DNA באמצעות PCR ואנזים DpnI ליצירת וריאנטים של פלסמידים.

Mutagenesis האתר ביתי בימוי של פלסמידים שלמים

גלה סרטונים נוספים