מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח על מדיה מוצק

כדי למדוד את תוחלת החיים ב-C Elgan, נוצרת אוכלוסייה מסונכרנת גיל באמצעות לאנג ביצים מתוזמן רבייתי. תולעי הרמפרודיט בוגרות פעילות מועברות לפלטות מדיום גידול נמטודות שנזרעו ב-E coli שנרצח מ-UV, מותרות להטיל ביצים במשך שש עד שמונה שעות ואז מוסרות במהלך יומיים הבאים, התולעים בוקעות מהביצים וגדלות עד לשלב הזחלים L ארבע. ארבעת התולעים מועברות לפלטות NGM חדשות המכילות אמפיצילין כדי למנוע זיהום חיידקי חי ו-FUDR למניעת רבייה ומותרות להתפתח לבוגרים.

מנקודה זו ואילך, התולעים הבוגרות נצפות כל יומיים-שלושה עד שכל התולעים מתות. בכל נקודת זמן, תולעים מתות מוסרות מהצלחת ומספר התולעים החיות והמתות נרשם. אני ג'ורג' סיטון מהמעבדה של מאט קפליין במחלקה לפתולוגיה באוניברסיטת וושינגטון.

היום נראה לכם כיצד למדוד תוחלת חיים ולראות את האלגנטיות שלנו עם הפטיטיס. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את הגנטיקה של ההזדקנות. אז בואו נתחיל.

ניסוי תוחלת חיים בסיסית דורש שני סוגי לוחות: לוחות NGM סטנדרטיים, שאין בהם תוספים, ולוחות AMP FUDR, שבהם מוסיפים גם אמפיצילין וגם פלואורו דאוקסי יורידין ל-NGM. שני סוגי הלוחות מכילים חיידקי אי קולי OP 50, אשר נהרגים לאחר מכן מחשיפה ל-UV. התחל בהכנת 10 מיליליטר של תמיסת NGM.

בכל צלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ ממיס לחלוטין את ה-NGM המוצק על ידי מיקרוגל על גבי גבוה בפולסים 32. סובבו את המדיה בין הפולסים כדי למנוע הצטברות בועות גז בלחץ, הניחו נוזלי NGM באמבט מים בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס או על הספסל כדי לאפשר למדיה להתקרר. ברגע שהמדיה התקררה ל-55 מעלות צלזיוס, ואז תוכל להחזיק בנוחות את המיכל הזכוכיתי בידיים חשופות, הוא מוכן להוספת תרופות.

וכדי לשפוך את הצלחות של צלחות עם תרופות, הוסיפו 33 מיקרוליטרים של FUDR של 150 מילימולר ו-100 מיקרוליטר של 100 מיליגרם למיליליטר. אמפיצילין לכל 100 מיליליטר NGM וסחרור לערבוב אמפיצילין משמש למניעת זיהום חיידקי זר ו-FUDR למניעת בקיעת ביצים. לכן לא יהיה צורך להעביר תולעים כל כמה ימים כדי להפריד אותן מהזחלים הגדלים.

עכשיו שפכו את המדיום ותנו לצלחות להתייבש על הספסל במשך יומיים ביום שלפני שהצלחות סיימו לייבש את תרבית נוזל הזרעים עם מושבה אחת מפס טרי של אי-קולי. חיידק OP 50 על מקדח LB. הכן לפחות 0.5 מיליליטר תרבית לכל צלחת 60 מילימטר.

הניחו את תרבית OP 50 בשייקר של 37 מעלות צלזיוס ותנו לחיידקים לגדול במהלך הלילה. למחרת תן כדור לחיידק OP 50 עם 3,500 גרם כוח צנטריפוגלי למשך 10 דקות. לפנק מספיק מהסופרנטנט כדי להחזיר את החיידקים בריכוז פי 10.

כעת החסן כל צלחת ב-100 מיקרוליטר של התרבית המרוכזת. הימנעו מלגעת בקצה הפיפטה לפני השטח של ה-NGM, שכן פגמים במשטח המדיה יאפשרו לתולעים לחפור לוחות מסתחררים עד שהחיידקים יכסו את האזור המרכזי של ה-NGM מבלי להתקרב לדפנות הפלטה, וישאירו את הלוחות להתייבש על הספסל למשך 24 שעות. לאחר התייבשות, נחשוף את פני הפלטות למינון UV חזק מספיק כדי לעצור את צמיחת החיידקים, נשתמש ב-Strata Gene UV straddle linker 2,400.

התחל בטעינת הלוחות ב-straddle linker בלי המכסים. עכשיו לחץ אנרגיה. הזן 9 9 9 9 על לוח המקשים ולחץ על התחל.

הלוחות ייחשפו ל-UV למשך כחמש דקות. לוחות עם חיידקים שנהרגו מקרינת UV יכולים להיאחסן הפוך בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך עד חודש. סעיף זה מתאר כיצד ליצור אוכלוסיית תולעים עם תאריך בקיעה משותף.

התחילו בהעברת כ-20 תולעים צעירות בוגרות לפלטת NGM טרייה ללא תרופות. השאירו את הצלחת בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך כשבוע כדי לאפשר לתולעים להתפשט ולאכול את כל המזון החיידקי בתוך שבוע. תולעים שבקעו זה עתה בשלב האדויה המעוכב בצמיחה צריכות להיראות, מועברות 20 עד 30 זחלי דהר לפלטת NGM טרייה ללא תרופות ולדגור אותן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בנוכחות מזון.

זחלי המתקן יהפכו לבוגרים פעילים רבייתית תוך יומיים ויישארו פעילים רבייתית למספר ימים לאחר מכן. כעת העבירו 10 עד 15 מהמבוגרים הפעילים רבייתית לפלטת NGM טרייה ללא תרופות. צלחת זו נקראת 'הטלת ביצים מתוזמנת או לוח TEL'.

השאירו את צלחת ה-TEL בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס כדי שהתולעים יוכלו להטיל ביצים. החיות שיבקעו מהביצים הללו יהיו בעלי החיים הניסיוניים ותוחלת חייהם לאחר שש שעות. בדוק את צלחת ה-TEL בשביל ביצים.

אם עדיין אין מספיק ביצים, השאירו את צלחת ה-TEL בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך עד 24 שעות בסך הכל. בודקים מדי פעם ביציות. כאשר הוטלו מספיק ביצים, יש להסיר את הבוגרים מלוח ה-TEL.

ניסוי תוחלת חיים טיפוסי ידרוש בין 30 ל-90 ביצים לכל קבוצת ניסוי, אך ניתן לייצר כמה מאות ביצים על פלטת TEL אחת. כ-150 ביצים יוטלו על ידי 10 עד 15 בוגרים פעילים רבייתית בתוך שש עד שמונה שעות. בהשוואה בין קבוצות ניסוי, ניתן להשיג מובהקות סטטיסטית עבור הבדלים גדולים בתוחלת חיים עם רק 30 בעלי חיים.

יש להשתמש ביותר בעלי חיים להבחנה בין הבדלים צנועים יותר. עכשיו מניחים את צלחת ה-TEL ללא הבוגרים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עד שהביצים יבקעו והתולעים יתפתחו לשלב הזחל L ארבעה. בדרך כלל לוקח יומיים לאלגנטיות מסוג C פראי, אך לזנים עם פנוטיפים איטיים יכול לקחת יותר זמן.

סעיף זה מתאר כיצד לעקוב אחרי חיי אוכלוסייה מסונכרנת גיל. ראשית, העבר את זחל L ארבע מלוח ה-TEL לפלטות AMP FUDR היושבות. לכל זן או מצב שנבדק, נהוג להקים שתיים עד שלוש פלטות עם 25 עד 30 תולעים בכל צלחת.

דגרו את פלטות ה-AMP FUDR בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. ואז להעריך ויזואלית את התולעים, המדיה והעברת התולעים ללוחות AMP FUDR טריים. אם התולעים אכלו את רוב המזון החיידקי, זה בדרך כלל יקרה פעם או פעמיים בשבוע.

בתחילת הניסוי, אם יש מספר משמעותי של זחלים, זה בדרך כלל מצביע על כך שהתולעים הועברו ללוחות ה-AMP FUDR כבוגרים צעירים במקום כ-L 4. צעירים יכולים להטיל ביצים לפני שה-FUDR נכנס להשפעה, ולעיתים זחלים בורחים מהשפעות ה-FUDR וגדלים לבוגרים. הזחלים הללו יבלבלו את הניסוי במצב כזה, יעבירו את התולעים הבוגרות לצלחות טריות ויזרקו את הלוחות הישנים המכילים את הזחלים.

יש גם להעביר תולעים לצלחות טריות אם נצפים חיידקים חיים גדלים. באופן כללי, השילוב של AMP והרג UV יבטיח שלא יזהם חיידקים חיים בניסוי, אך לעיתים זה קורה. בנוסף, העבר את התולעים.

אם נצפית צמיחת פטריות על המדיה. אם תופסים את הפטרייה מוקדם מספיק, ניתן לחתוך את הפטרייה באמצעות קצה פיפטה או מרית. כאשר הוא גדל לקוטר של כמה מילימטרים, בדרך כלל קל יותר להעביר את התולעים ללוח חדש.

מדורגים את כל התולעים לתוחלת החיים כל יומיים-שלושה. שימוש בכוונת דיסקציה. קבע אם כל תולעת חיה או מתה.

הקישו בעדינות על הצלחת. התולעת חיה אם היא זזה בתגובה לנקישות. אם התולעת לא מגיבה להקשה על הצלחת, התקרב לאזור הראש, טפח בעדינות על ראש התולעת עם פיק העברת פלטינה.

תסמן את התולעת כמתה. אם היא לא מגיבה על ידי הזזת ראשה, הסר את התולעת המתה מהצלחת. לאחר בדיקת כל התולעים, רשמו את התאריך ואת מספר התולעים החיות והמתות.

תולעים שמוחזקות על מדיה מוצקה לעיתים בורחות ממשטח הלוח על ידי חפירה או זחילה במעלה הקיר. תולעים שבורחות מושמטות לחלוטין מהמחקר. בסיום, החזירו את הצלחות לדוגמת 20 מעלות צלזיוס.

חכה עוד יומיים-שלושה ואז בדוק שוב את הלוחות. המשיכו במשטר הזה עד שכל התולעת תמות. מספר התולעים שמתו בכל יום בדרך כלל מתהפך כדי לחשב את היחס של התולעים החיות בכל יום, ונתונים אלו מוצגים גרפית כעקומת הישרדות עם היום שבו נחשב מועד הטלת הביצים בזמן.

יום אפס. תוחלת החיים החציונית הטיפוסית של N 2. הזן מסוג Sea Elgan Wild שנשמר על חיידקי הרג UV בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס הוא כ-25 ימים כפי שנמדד מביצה.

הראינו לכם איך למדוד תוחלת חיים ולראות אלגנטיות. ניתן לשנות את ההליך הבסיסי הזה כדי לבדוק מגוון תנאים סביבתיים, כולל הגבלת תזונה והפרעות RNA, כפי שנדון בטקסט התומך. אז זהו.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוי שלכם.