Name: Proteomics כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם ליגנד P2X2-מגודרת ערוצי קטיון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-18T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 36 s
Description: למדו לזהות חלבונים המקיימים אינטראקציה עם קרבוקסי-טרמינוס של קולטני P2X2 באמצעות שיטת pull-down עם חלבון GST וספקטרומטריית מסה. פרוטוקול זה מאפשר מיפוי מקיף של שותפי קשר במוח העכברוש.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SW ו TMV נתמכים על ידי NCRR ו NHLBI במכון הלאומי לבריאות. BSK ו HS נתמכים על ידי NINDS ו NIGMS של מכוני הבריאות הלאומיים.

ניסיונית נהלים הליך הניסוי (איור 2) מורכבת מארבעה חלקים המתוארים בצורה צעד חכם למטה. חלק 1: Subcloning וביטוי של התחנה-C של P2X2 קולטנים. אנחנו הבענו את אורך מלא C-הסופית של P2X2 קולטנים חיידקים כדי לזהות את החלבונים במוח שאליו הוא נקשר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> C-הסופית (שאריות 353-472) של הקולטן P2X2 (איור 1) היה מוגבר על ידי ה-PCR, משובטים לתוך pGEX 4NT1 (GE מדעי החיים) ומאומת עם רצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמיד רקומביננטי הפך E. קולי (BL21) לביטוי של חלבונים רקומביננטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניות גליצרול של חיידקים (E. coli BL21) המכיל את P2X2 CT-GST פלסמיד נגררו עם קצה פיפטה סטרילית מחוסן לתוך 5 מ&quot;ל של לוריא-Bertani (LB) בתקשורת עם סמן סלקטיבי מתאים (50 גרם / מ&quot;ל אמפיצילין) ו מודגרות לילה ב 37C ב שייקר מסלולית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות גדל בן לילה היו מחוסן לתוך 250 מ&quot;ל של LB עם התקשורת אנטיביוטי מתאים (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אמפיצילין) ו מודגרות ב שייקר מסלולית בסל&quot;ד 250 עבור 2-3 שעות ב 37C עד צפיפות אופטית ב 600 ננומטר הגיע ~ 0.6-0.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות היה מושרה עם 1 מ&quot;מ של IPTG ו מודגרות נוספת 3 שעות עבור ביטוי החלבון על 37C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות היה אז הסתובב במשך 15 דקות ב 4C (1ml של התרבות ניצל לניתוח רמת הביטוי תויגה כ &#39;המושרה&#39;) בשעה 5000 גרם. Supernatant היה מושלך לבין גלולה היה resuspended ב 20 מ&quot;ל של תמיסת מלח טריס-EDTA (STE) חוצץ (10 mM טריס-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעיה היה סובב על 5000 גרם במשך 15 דקות בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל בז. Supernatant היה מושלך ואת חצי יבש גלולה הוקפא ב-70C לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> -70C גלולה היה resuspended ב 40 מ&quot;ל של חיץ קרים תמוגה (2% (w / v) sarkosyl, 15 מ&quot;ג ליזוזים, 150 mM NaCl, 50 מ&quot;מ טריס pH7.5, 5 DTT מ&quot;מ הלוח המלא מעכבי פרוטאז) ו ההשעיה הודגר על קרח למשך 30 דקות. במהלך הדגירה זה, 3 מ&quot;ל גלוטתיון-Sepharose חרוזים 4B נשטפו עם 20 מ&quot;ל של תמיסת מלח פוספט חוצץ (PBS) ו - 20 מ&quot;ל T-PBS (0.1% (V / V) tritonX-100 ב PBS) ואחריו PBS. החרוזים היו resuspended ב 1 מ&quot;ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיית חיידקי היה להקפיא מופשר 3 פעמים בחנקן נוזלי sonicated (1s on / off, 30 מיקרון עבור 3 דקות על הקרח) ו מודגרות נוספת למשך 30 דקות עם 4% (v / v) טריטון X-100, 10 mM MgSO 4 ו 2 mM ATP על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lysate היה סובב על 20,000 גרם במשך 15 דקות ב 4C ו גלולה היה מושלך (מדגם גלולה ו 1 מ&quot;ל של supernatant ניצל דף SDS כדי לבדוק את כמויות של חלבונים cytosol ממברנות). Supernatant הודגר עם חרוזים עבור שעות 1 (או לילה) בשעה 4C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החרוזים היו סובב ב 500 גרם דקות 5 ו supernatant היה מושלך (מדגם ניצל לשבריר מאוגד). החרוזים נשטפו עם T-PBS חמש פעמים (שוטף ניצלו עבור פקדי לשטוף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החרוזים היו resuspended אז PBS לתת 50% (w / v) slurry ואוחסנו במקרר בבית 4C עד לשימוש. ריכוז החלבון הוערך על ידי ברדפורד assay (לפי הוראות היצרן). </li></ol> חלק 2: הכנת lysates המוח כולו P2X2 רצפטורים ידועים לידי ביטוי בשפע במוח 8. במהלך ניתוחים הנוכחי, ביקשנו לזהות את החלבונים אינטראקציה עם רצפטורים P2X2 מ שלם חולדה lysates המוח (איור 3). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוח החולדה למבוגרים היה לקצור (בעלי חיים הוקרבו על פי פרוטוקול UCLA IAACUC באישור ועל פי מדריך ה-NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה) ושטף מיד קרים PBS (3X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי lyse התאים 10 מ&quot;ל (~ 5 פעמים את משקל רטוב של המוח שנקטפו) של חיץ קרים תמוגה המכיל 150 mM NaCl, 50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NAF, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM PMSF, 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל של leupeptin, 1% (v / v) NP-40, וכן מעכבי פרוטאז לוח קוקטייל נוסף במוח שנקטפו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת המוח היה homogenised על הקרח עם homogenizer Dounce זכוכית עד תערובת הומוגנית של עקביות הושגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lysate Cell היה סובב על 2000 גרם במשך 5 דקות כדי להסיר את התאים רצוף. Supernatant נאסף וסובב שוב למשך 60 דקות בכל גרם 29000 להסיר אברונים שלמים אגרגטים הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר צנטריפוגה supernatant הועבר צינור נקי. ריכוז החלבון של lysate המוח כולו נמדד על ידי assay ברדפורד (בדרך כלל ~ 15 מ&quot;ג / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lysate היה aliquoted ומאוחסנים ב-70C. </li></ol> חלק 3: בידוד של P2X2 C-זנב הקשורים חלבונים כדי לזהות את השותפים מחייב P2X2 CT-GST מ lysates המוח כולו, למשוך למטה assay בוצעה באמצעות CT-GST משותקת על גלוטתיון חרוזים sepharose 4B כפיתיון. עבור פקדים, GST לבד חייב חרוזים היה בשימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח lysate היה precleared עם חרוזים GST עבור שעה 1 ב 4C. גלולה היה מושלך ואת supernatant שימש מנתח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמויות שוות של GST ו P2X2 CT-GST (10 מיקרוגרם) חייב גלוטתיון sepharose 4 חרוזים B הודגרו לילה עם 100 גרם של חלבונים solubilised precleared מ lysate המוח כולו חולדה, עם סיבוב ב 4C במאגר תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזים היו הסתובב בבית ג&#39;1000 דקות 5 ו supernatant נמחקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החרוזים נשטפו פעם עם למאגר תמוגה ו מבושל שונה Laemli חיץ [4% (w / v) SDS, 10% (V / V) 2 mercaptoethanol, 2% (v / v) גליצרול, 0.004% (w / v) bromophenol כחול 0.125 M TrisCl pH 6.8] במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדגימות סובב ב 5000 גרם דקות 5 ו supernatant מופרדות 10% SDS-PAGE (איור 4). ג&#39;ל הוכתמו ג&#39;ל רובי חלבון SYPRO כתם (לפי הוראות היצרן) ו דמיינו באור אולטרה סגול. P2X2 CT הקשורים חלבונים הושוו לאלו החלים באמצעות GST-null כפיתיון. ארבעה ביולוגיים משכפל בוצעו (כלומר four מוח וארבעה ומורדות למשוך עצמאי). </li></ol> חלק 4: זיהוי של חלבונים. חלבונים מופרדים על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה היו נכרת מן הג&#39;ל וזוהו על ידי ספקטרומטריית מסה 12. הערה: העדר אבק לאורך כל התהליך הוא קריטי כדי להפחית את זיהום קרטין. הנסיין צריך ללבוש מסיכה, נטו שיער כפפות כל הזמן ואף פעם לא לגעת באזור ג&#39;ל הריבית ללא שימוש בכפפות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקות כל חלבון גלוי התאושש למשוך P2X2 למטה היו נכרת בסכין גילוח נקי חתוך לקוביות (איור 4). אזורים מקבילים של הג&#39;ל ב GST-null למשוך במורד השביל היו נכרת גם מבלי להתייחס מכתים הלהקה (להקות ספציפיות הפיתיון GST-null היו נכרת גם מזוהה) על מנת להבטיח כי נוכחות של חלבונים מתחת לרמה של באותו אופן רגישות מכתים לא לפספס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתיכות ג&#39;ל הודגרו עם 200 μl של אמוניום ביקרבונט 50 מ&quot;מ 50% (v / v) אצטוניטריל (ACN) ואת צינורות vortexed במשך 15 דקות ב RT. חזור על שלב זה לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתיכות ג&#39;ל היו מיובש על ידי הוספת 200 אצטוניטריל μl (חתיכות ג&#39;ל צריך להתכווץ ולהפוך אטום בצבע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Acetontrile הוסר החלקים ג&#39;ל מיובשים speedvac למשך 10 דקות ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתיכות ג&#39;ל הודגרו אז עם 30 μl של המוכן טרי DTT/10 10 מ&quot;מ טריס (2-carboxy-אתיל) hydrochloride phosphine (TCEP) של נפח מספיק לטבול את השברים. זה היה שמאל למשך 30 דקות בכל אמבט מים 56C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון הבא DTT הוחלף 100 μl ביקרבונט 500 mM אמוניום בתמיסה אצטוניטריל 50% ואת פרוסות ג&#39;ל רחצה עם ביקרבונט ammounium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון הכביסה aspirated ו 200 μl של אצטוניטריל הוסיף מייבשים את הג&#39;לים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אצטוניטריל הוסרה אז 100 μl הכין טרי 100 iodoacetamide פתרון mM נוספה alkylate sulfhydryls חינם. צעד זה המשיך במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון Iodoacetamide הוסר החלקים ג&#39;ל נשטפו עם 200 μl של אמוניום ביקרבונט 50 מ&quot;מ ב acetontrile 50% (pH 8.0) עבור 2 דקות תוך vortexing. צעד זה לשטוף חזר על עצמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת פתרון לרחוץ, חתיכות ג&#39;ל הודגרו עם אצטוניטריל 200 μl אשר הוסר לאחר מכן על ידי ~ 10min speedvac. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה את החתיכות בג&#39;ל מוכנים העיכול טריפסין. חתיכות ג&#39;ל הודגרו בתמיסה 30 טריפסין μl (20 ng / μL ריכוז עובדים) והניח על קרח למשך 10 דקות עבור ג&#39;לים להיות נפוחים היטב. טריפסין עודף הוסר rehydrated חלקיקי ג&#39;ל ועליהן μl 30 עם אמוניום ביקרבונט 50 mM כדי למנוע מהם שקוע לאורך מערכת העיכול אשר הורשה להמשיך במשך 12 עד 16 שעות ב 37C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חמש μl של 5% (v / v) חומצה פורמית מתווסף לבטל את העיכול טריפסין ולעצור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות היו vortexed במשך 15 דקות ו ~ centrifuged בקצרה להביא את הנוזל אל החלק התחתון של הצינור, אשר הועברה לאחר מכן בקבוקון 0.5 נקי שכותרתו מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא 30 μl של 0.1% (v / v) חומצה פורמית ב אצטוניטריל 50% נוספה חתיכות ג&#39;ל אז הם היו רק מכוסה ואחריו vortexing פעמיים 10-15 דקות, מופרדים על ידי צנטריפוגה קצר. צעד זה חזר על עצמו פעם אחת, החלפת חומצה פורמית, אצטוניטריל בין השלבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנוזל הסופי הוסר כל פתרון מיצוי בשילוב בקבוקון אחד. נפח זה הופחת ל UL 30 ~ ב speedvac. המדגם היה מוכן כעת כרומטוגרפיה הפוכה שלב ננו נוזלים זיהוי החלבון על ידי ספקטרומטריית מסה. בדוגמה זו ספציפית, שלב זה מתבצע על ספקטרומטר טנדם Orbi-מלכודת המונית ThermoFisher (שנבחר דיוק המסה הגבוהה שלו, מחזור מהיר לגילוי חלבון ותכונות הפעלה יציבה בדרך כלל), למרות דגמים אחרים ומכשירים היצרנים יכול בקלות להיות בשילוב עם הגישה המתוארת לנקודה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרטים ואת הקריטריונים מנתח spectrometric מסה כעת הציג בקצרה. פפטידים כל הופרדו על ידי שלב הפוכה ננו LC (Eksigent) ופפטידים הועמסו על עמודה הפוכה שלב C18 בקצב הזרימה של μl 3 / min. Mobile שלב היה חומצה פורמית 0.1% ו ACN 2% מים; שלב ב &#39;הנייד היה חומצה פורמית 0.1% ו 20% מים ב ACN. פפטידים היו eluted מהעמודה בקצב הזרימה של 220 nl / min באמצעות שיפוע ליניארית מ-B ל-B 5% -50% על פני 90 דקות, לאחר מכן ב 95% מעל 5 דקות, ולבסוף שמירה ב 95% קבוע 5 דקות . ספקטרה נרכשו במצב נתונים תלויי עם מלכודת-Orbi המשמש סריקות MS ו LTQ עבור MS / MS סריקות. פפטידים זוהו על ידי חיפוש ספקטרום מול מסד הנתונים של עכברוש IPI v.3.53 באמצעות אלגוריתם SEQUEST משולבים בחבילת התוכנה Bioworks. פפטיד כל נפגשו הקריטריונים הבאים: XCorr ≥ 2 (1), ≥ 3 (2) ≥ 4 (3), ו DeltaCN&gt; 0.1. ספקטרה כל המשמשת לזיהוי חלבונים נבדקו באופן ידני וחלבונים לא מקובל כאשר פחות משני פפטידים זוהו. חלבונים רק בהווה הבאים בכל אחד מארבעת P2X2 ומורדות למשוך נעדר במהלך GST-null ומורדות למשוך נחשבו עבור ניתוחים נוספים. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig1.jpg" alt="דמות 1" /> באיור 1. ייצוג סכמטי של למקטע P2X2 קולטן. א הקריקטורה ממחישה את הטופולוגיה של למקטע P2X2 קולטן. תחום cytosolic מורכב N ו-C טרמיני. C-הסופית של הקולטן P2X2 (אדום) ששימשה כפיתיון למשוך את assay. רצף חומצות אמינו ב &#39;של הקולטן P2X2 C-הסופית השתמשו במחקר זה. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig2.jpg" alt="" /> איור 2. תרשים זרימה קו הזמן של פרוטוקול המשמש ביטוי, טיהור, לנתץ וזיהוי של חלבונים. אנחנו מראים את קווי המתאר של הפרוטוקול עם קו הזמן. עכברוש למבוגרים lysate המוח היה מוכן טרי מיד לפני השימוש על מבחני למשוך למטה. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig3.jpg" alt="" /> איור 3. ייצוג סכמטי של ניתוח proteomic בינארי של רשת C-הסופית P2X2 במוח חולדה. C-הסופית של P2X2 קולטנים התמזגו עם חלבון GST חייב חרוזים GST שימש לנתץ מבחני. המוח lysate הוכן וחלבונים הודגרו עם חלבונים רקומביננטי משותקת. חלק מאוגד נשטף למאגר תמוגה. החלבונים שזוהו על ידי ספקטרומטריית מסה. <img src="/files/ftp_upload/1178/Fig%204%20Singh%20et%20al.jpg" alt="" /> איור 4. זיהוי שותפים מחייב הסופית-C של P2X2 קולטנים. ג&#39;ל Sypro מוכתם מראה מגוון של חלבונים המשוערת כי אינטראקציה עם הסופית-C של קולטנים התמזגו עם GST (הקופסה הכחולה). בקרת נתיבים עבור GST לבד (תיבת צהוב) ו - גלוטתיון חרוזים sepharose לבד מוצגים גם. החצים מצביעים על דוגמאות של להקות ייחודי שהיו נכרת לצורך ניתוח נוסף על ידי ספקטרומטריית מסה.

<ol><li>Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , 3rd edition, Sinauer Associates Inc. Sunderland Massachusetts, USA. (2001).</li>
<li>Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+P2X+receptors+and+ATP+signalling+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).</li>
<li>Egan, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+calcium+ions+to+P2X+channel+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of calcium ions to P2X channel responses.</a> J Neurosci. 24, 3413-3420 (2004).</li>
<li>Burnashev, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+permeability+of+ligand-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium permeability of ligand-gated channels.</a> Cell Calcium. 24, 325-332 (1998).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li>
<li>Levitan, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+protein+complexes+associated+with+neuronal+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels.</a> Nat Neurosci. 9, 305-310 (2006).</li>
<li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X+receptors+as+cell-surface+ATP+sensors+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease.</a> Nature. 442, 527-532 (2006).</li>
<li>Roger, S., Pelegrin, P., Surprenant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+P2X7+receptor+currents+and+membrane+blebbing+via+constitutive+and+dynamic+calmodulin+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Facilitation of P2X7 receptor currents and membrane blebbing via constitutive and dynamic calmodulin binding.</a> J Neurosci. 28, 6393-6401 (2008).</li>
<li>North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of P2X receptors.</a> Physiol Rev. 82, 1013-1067 (2002).</li>
<li>Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+union+of+pharmacology.+XXIV.+Current+status+of+the+nomenclature+and+properties+of+P2X+receptors+and+their+subunits.%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">International union of pharmacology. XXIV. Current status of the nomenclature and properties of P2X receptors and their subunits.</a> Pharmacol Rev. 53, 107-118 (2001).</li>
<li>Young, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+shape%2C+architecture+and+size+of+P2X4+receptors+determined+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular shape, architecture and size of P2X4 receptors determined using fluorescence resonance energy transfer and electron microscopy.</a> J Biol Chem. 283, 26241-26251 (2008).</li>
<li>Edmondson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+epsilon+signaling+complexes+include+metabolism-+and+transcription%2Ftranslation-related+proteins%3A+complimentary+separation+techniques+with+LC%2FMS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C epsilon signaling complexes include metabolism- and transcription/translation-related proteins: complimentary separation techniques with LC/MS/MS.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 421-433 (2002).</li>
<li>Evans, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthosteric+and+allosteric+binding+sites+of+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors.</a> Eur Biophys J. 38, 319-327 (2009).</li>
</ol>

תעלות יונים הם קבוצה גדולה של חלבונים בממברנה נפרד. הם מכילים מים מלא נקבוביות כי סלקטיבי לאפשר תנועה של יונים מטה הדרגתיים אלקטרוכימי על פני קרום התא. יון ערוצי השער פתוח בין המדינות סגור. צעד gating מופעלת על ידי משדרי (למשל ATP) במקרה של P2X ערוצי ליגנד מגודרת יון, או שהוא עשוי להיות מוסדר על ידי אינטראקציות עם חלבונים אחרים. בעשור האחרון עדים לעלייה הבנתנו כיצד קולטנים P2X להיקשר ATP 13, אבל את תפקידם של החלבונים הנלווים בוויסות תפקוד P2X נשאר הבין פחות טוב. הגישה ה...

<table><tbody><tr><td>אצטוניטריל</td><td>ריאגנט</td><td>JT Baker</td><td>9829-02</td><td></td></tr><tr><td>אקרילאמיד</td><td>ריאגנט</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>אמפיסילין</td><td>ריאגנט</td><td>VWR international</td><td>VW1507-01</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום ביקרבונט</td><td>ריאגנט</td><td>Fluka</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט (APS)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין טריפוספט (ATP)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>ריאגנט ברדפורד</td><td>ריאגנט</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>ריאגנט</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>קומהסי כחול R-250</td><td>ריאגנט</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-24972</td><td></td></tr><tr><td>דיתיוטריטול (DTT)</td><td>ריאגנט</td><td>EMD Millipore</td><td>3860</td><td></td></tr><tr><td>אתילנדיאמיןטטרהחומצה (EDTA)</td><td>ריאגנט</td><td>VWR international</td><td>VW1474-01</td><td></td></tr><tr><td>אתילנגליקולטטרהחומצה (EGTA)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית</td><td>ריאגנט</td><td>EMD Millipore</td><td>11670-1</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי גלוטתיון ספרוז 4B</td><td>ריאגנט</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5132-01</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית (HCl)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל-בטא-D-תיוגלקטופירנוזיד (IPTG)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15502</td><td></td></tr><tr><td>יודואצטמידים</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>מצע לוריה-ברטני (LB)</td><td>ריאגנט</td><td>EMD Millipore</td><td>1.00547.5007</td><td></td></tr><tr><td>לופטין</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>ליזוציים</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלוריד (NaCl)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פלואוריד (NaF)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אורתוונדט (Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>נונידט P40</td><td>ריאגנט</td><td>Fluka</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>פנילמתנסולפונילפלוריד (PMSF)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>טבלית מעכבי פרוטאז</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>סטנדרט חלבון</td><td>ריאגנט</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0305</td><td></td></tr><tr><td>סרקוזיל</td><td>ריאגנט</td><td>Acros Organics</td><td>61207</td><td></td></tr><tr><td>מבחנה עם פקק הברגה</td><td>כלי</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0866</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>צבע ג'ל לחלבון SYPRO&amp;#174; Ruby</td><td>ריאגנט</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3125</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-טטרהמתילאתילנדיאמין (TEMED)</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>טריס בסיס</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>ריאגנט</td><td>Promega Corp.</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>טווין 20</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>מים</td><td>ריאגנט</td><td>Burdick &amp;amp; Jackson</td><td>365-4</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר מסות טנדם LTQ-Orbitrap</td><td>כלי</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מערכת ננו-כרומטוגרפיה נוזלית</td><td>כלי</td><td>Eksigent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בטא-מרקפט&amp;#8211;נול</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>גליצרין</td><td></td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-6</td><td></td></tr></tbody></table>

proteomics כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם ליגנד p2x2-מגודרת ערוצי קטיון

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

ליגנד-מגודרת תעלות יונים ביסוד תקשורת הסינפטי במערכת העצבים 1. אצל יונקים יש שלוש משפחות של ליגנד-מגודרת ערוצים: את הלולאה cys, גלוטמט ו-מגודרת ערוצי קולטן P2X 2. בכל מקרה המחייב של המשדר המוביל פתיחת הנקבוביות שדרכו יונים לזרום למטה הדרגתיים אלקטרוכימיים שלהם. רבים ליגנד-מגודרת הערוצים גם חדיר יוני סידן 3, 4, אשר במורד איתות תפקידים 5 (תקנה למשל גן) כי תעלה את משך הזמן של פתיחת הערוץ. לפיכך ליגנד-מגודרת ערוצי יכולה לאותת על סולמות זמן רחב החל כמה אלפיות כדי ימים. בהינתן אלה תפקידים חשובים יש צורך להבין כיצד ליגנד-מגודרת תעלות יונים עצמם מוסדרים על ידי חלבונים, ואיך החלבונים האלה עשויים לכוון איתות. מחקרים אחרונים מצביעים על כך רבות, אם לא כולם, ערוצי עשוי להיות חלק קומפלקסים חלבונים איתות 6. במאמר זה נסביר כיצד לזהות את החלבונים אשר נקלטות על ידי ה-C-מסוף ההיבטים של תחום P2X2 הקולטן cytosolic. קולטנים P2X הם ATP-מגודרת ערוצי קטיון וכוללת שבע יחידות משנה (P2X1-P2X7). קולטנים P2X באים לידי ביטוי נרחב במוח, שם הם לתווך שידור סינפטיים מעוררים ועל סיוע presynaptic של שחרור הנוירוטרנסמיטר 7. קולטנים P2X נמצאים תאים להתרגש ולא להתרגש לתווך תפקידי מפתח איתות דלקת עצבית, ותפקוד הלב וכלי הדם 8. P2X2 קולטנים נפוצים במערכת העצבים 9 הם המוקד של המחקר הזה. למקטע כל P2X נחשב בעל שני חלקים קרום פורש (TM1 &amp; TM2) מופרדים על ידי אזור תאי 7 ו-N ו-C תאיים טרמיני (איור 1a) 7. יחידות משנה P2X 10 (P2X1-P2X7) מראים הומולוגיה ברצף 30-50% ברמת חומצת אמינו 11. קולטנים P2X מכילים רק שלוש יחידות משנה, המהווה את stoichiometry הפשוטה בין קולטנים ionotropic. P2X2 C-הסופית כוללת של 120 חומצות אמינו (איור 1b) והוא מכיל כמה חלבון העגינה אתרים קונצנזוס, התומכים בהשערה כי P2X2 קולטן עשוי להיות חלק מתחמי איתות. עם זאת, למרות מספר פונקציות יוחסו הסופית-C של P2X2 קולטנים 9 המחקר לא תיאר את השותפים מולקולרית כי בני הזוג לצד תאיים של חלבון זה דרך באורך מלא C-הסופית. במאמר זה אנו מתארים שיטות גישה proteomic לזהות את החלבונים אינטראקציה עם באורך מלא C-הסופית של P2X2 קולטנים.

אנו מתארים פרוטוקול פשוט לזהות חלבונים במוח אשר נקלטות על ידי התחנה הסופית C מלא אורכו של ה-ATP-מגודרת P2X2 קולטנים. הרחבה ויישום שיטתי של גישה זו כל הקולטנים P2X צפוי להוביל להבנה טובה יותר של איתות לקולטן P2X.

Proteomics כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם ליגנד P2X2-מגודרת ערוצי קטיון

תעלות יונים המופעלות על ידי ליגנדים מהוות את הבסיס לתקשורת סינפטית במערכת העצבים1. בינקים קיימות שלוש משפחות של תעלות המופעלות על ידי ליגנדים: משפחת ה-cys...

הליך זה מתחיל בביטוי יתר של הקצה C הרקומביננטי של קולטן ה-P2X2, שהונדס כחלבון איחוי GST, לאחר ליזיס בקטריאלי. החלבון המזוקק מדגרין עם חרוזי glutathione sepharose 4B, והריכוז נקבע באמצעות שיטת Bradford. לאחר מכן, חלבונים מליזיס מזוקק של מוח חולדה מדגרינים עם הקצה C של קולטני P2X2 הקשורים לחרוזי glutathione sepharose; קומפלקסים חלבוניים הקשורים לקצה C של קולטני P2X2 מבודלים באמצעות SDS-PAGE, אלקטרופורזה של ג'ל וחיתוך, ומזוהים באמצעות ספקטרומטריית מסות.שלום, אני Harpring מהמעבדה של JIT K במחלקה לפיזיולוגיה באוניברסיטת קליפורניה לוס אנג'לס. שלום, אני Sarah Walburn מהמעבדה של Tom Vka במחלקה לאנסטזיה באוניברסיטת קליפורניה לוס אנג'לס. היום נדגים לכם את הפרוצדורה לבידוד וניקוי של ה-CTS של רצפטורי P two X two.אנו משתמשים בחלבונים אלו כדי לזהות את ה-in מהמוח האדום ובמעבדה שלנו אנו משתמשים בחלבונים אלו כדי לחקור את ההשלכות התפקודיות על קולטני P2X2. אז בואו נתחיל. הדומיין הציטוזולי של קולטן P2X2 מורכב מהקצוות N ו-C.הקצה ה-C של קולטן ה-P2X2 ישמש כפיתיון (bait) עבור בדיקת ה-pull down, כפי שמוצג גם ברצף הקצה ה-C של קולטן ה-P2X2 ששימש למחקר אינטראקציה זה. כדי לבטא את הקצה ה-C באורכו המלא של קולטני P2X2, השתמש בטכניקות ביולוגיה מולקולרית קונבנציונליות כדי לשלב את רצף הציפוי עבור הקצה ה-C של הקולטן, שאריות 353 עד 472, לתוך פלסמיד PGE X4 NT1.לאחר מכן, הפלסמיד הרקומיננטי מוחדר (transformation) למאבט BBL 21 של e coli לצורך ביטוי. החיידקים המכילים את הפלסמיד הרקומיננטי גודלים בתרבית LB בטמפרטורה של 37 °C. כאשר הצפיפות האופטית של התרבית ב-600 nm היא בין 0.6 ל-0.8.השרו את התרבית באמצעות 1 mM IPTG והדגירו למשך שלוש שעות ב-37 °C. עם סיום ההדגרה של שלוש השעות, הוציאו מנת aliquot של 1 mL מהתרבית ושמרו אותה לניתוח מאוחר יותר. סובבו את שארית התרבית ב-5,000 G למשך 15 דקות ב-4 °C. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הנוזל העליון (supernatant) והשעיקו מחדש את המשקע ב-20 mL של בופר saline tris EDTA. העבירו את המשקע שהושעה מחדש למבחנה מסוג falcon של 50 mL.כעת יש לסבב את התרחיף בצנטריפוגה ב-5,000 Gs למשך 15 דקות כדי לאסוף את המשקע החצי-יבש, אותו מקפיאים בטמפרטורה של negative 70 degrees Celsius למשך לילה. למחרת, יש להחזיר את המשקע הקפוא למצב של תרחיף ב-40 milliliters של lysis buffer קר במקרר, ולהניח על קרח למשך 30 דקות בזמן שהמשקע המומס נח על הקרח. הכינו שלושה milliliters של glutathione seros four B beads.ראשית, שטפו את החרו지를 עם 20 milliliters של PBS ו-20 milliliters של TPBS. לאחר מכן, שטפו את החרו지를 ב-PBS טהור ותלו אותם מחדש ב-one milliliter של PBS. את תרחיף החיידקים בבופר ליזיס (lysis buffer) יש להקפיא ולהפשיר כעת באמצעות חנקן נוזלי.את הדגימה הקפואה הדגרינו על קרח להפשרה, ולאחר מכן ביצענו שוב שטיפה בחנקן נוזלי. שלב זה חזר על עצמו שלוש פעמים. לאחר מכן, בצע סוניקציה לתמיסת ההפשרה וההקפאה על קרח.לאחר הסוניקציה, דגרו את תרחיף החיידקים עם תמיסה המכילה 4% tritton X 110, מילימולר magnesium sulfate, ושני מילימולר ATP למשך 30 דקות על קרח. לאחר מכן, סובבו את הליזאט ב-20,000 Gs למשך 15 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ושמרו את supernatant. לפני השלכת המשקע (pellet), קחו דגימה קטנה של המשקע יחד עם ה-supernatant כדי לנתח את החלבונים בציטוזול ובממברנות.דגרו את supernatant עם החרוזים למשך שעה אחת או למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. לאחר הדגירה, סובבו את החרוזים בצנטריפוגה ב-500 Gs למשך חמש דקות. השליכו את מרבית ה-supernatant, אך שמרו דגימה קטנה המייצגת את חלקם של החלבונים שאינם קשורים. שטפו את משקע החרוזים חמש פעמים עם 25 milliliters של TPBS, תוך שמירה של כמות קטנה מכל שטיפה לצורך בקרות שטיפה.לבסוף, השהו מחדש את החרו지를 ב-PBS עד להשגת תרחיף בריכוז של 50% משקל לנפח, ואחסנו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. ניתן להעריך את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת Bradford בהתאם להוראות היצרן, והוא צפוי להיות 500 micrograms per milliliter. כדי לזהות את השותפים לקשירה של P two X two CT GST מתוך ליזאטים של מוח שלם, בוצע pull down assay שבו שימש CT GST המקובע על חרוזים מצופי גלוטתיון כפיתיון כביקורת.השתמשו ב-GST לבדו הקשור לחרו지를 כפיתיון, אשר יכונה להלן ליזט של GST Knoll Rat Brainin. עבור בדיקת קישור חלבון היתוך GST, הכנה בוצעה באמצעות פרוטוקול סטנדרטי ובאפר ליזה, וריכוז החלבון נאמד ב-15 milligrams per milliliter באמצעות בדיקת Bradford. לפני תחילת הבדיקה.בצע ניקוי מקדים (Pre-clear) של ליזט המוח שהופשר על ידי דגירה עם 30 µL של חרוזי GST למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 °C, לאחר שהליזט דגור עם חרוזי ה-GST. סבב את החרוזים בצנטריפוגה במהירות של 1000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. שמור את הסופרנטנט ושמור נפח קטן ממנו כביקורת.כעת חשבו את נפח הליזאט שאמור להכיל 100 micrograms של החלבון המומס שעבר ניקוי מוקדם, וערבבו נפח זה של ליזאט עם 10 micrograms של חרו지를 קשורי GST ו-10 micrograms של חרו지를 קשורי P two X two CT GST. השלימו את הנפח ל-200 microliters באמצעות בופר ליזיס. דגרו את הליזאט עם החרוזים למשך הלילה ברוטטור בטמפרטורה של 4 °C.ביום למחרת, סובבו את החרוזים בצנטריפוגה במהירות של 1000 Gs למשך חמש דקות והסילו את הנוזל העליון. שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של lysis buffer. לאחר מכן, הוסיפו לחרוזים 50 µL של lely buffers שעברו שינוי והרתיחו את החרוזים בבופר זה למשך חמש דקות.סבבו את הדגימות המורתחות ב-5,000 GS למשך חמש דקות והריצו את הדגימות המדוברות על ג'ל SDS-PAGE בריכוז של 10%. השוו את החלבונים הקשורים ל-P two X two CT לאלו שהופקו באמצעות הפיתיון GST Nola. השלב הקריטי האחרון של הניתוח הוא הוצאת החלבונים המופרדים מהג'ל לצורך זיהוי באמצעות ספקטרומטריית מסות מהשלב זה ואילך.היעדר אבק לאורך כל התהליך הוא קריטי להפחתת זיהום בקרטין. התחל בחיתוך הפסים מהג'ל באמצעות להב תער נקי. לאחר מכן, חתוך את הפסים לשלושה מקטעים קטנים יותר והנח כל פס באבובת מיקרו-צנטריפוגה מסומנת התואמת לאזורים בג'ל ב-GST.יש לחתוך גם את נתיב הביקורת (No pull down) באותו האופן, ללא התחשבות בצביעת הפסים. כדי להבטיח שחלבונים שריכוזם נמוך מרף רגישות הצביעה לא יפוספסו, ערבבו את חלקי הג'ל עם 200 µL של 50 mM ammonium bicarbonate ו-50% v/v Acetonitrile, ולאחר מכן ערבבו את המבחנות באמצעות וורטקס למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר ערבול ב-vortex, הסר את תמיסת השטיפה וחזור על הפעולה. הסר את תמיסת השטיפה האחרונה ובצע דהידרטציה לחתיכות הג'ל על ידי הוספת 200 microliters של aceto nitrile. חתיכות הג'ל אמורות להתכווץ ולהפוך לעכורות.בתוך שתי דקות, הסירו את ה-acetyl nitrile וייבשו את חלקי הג'ל. לאחר ייבוש של חלקי הג'ל באמצעות speed vac למשך 10 דקות, דגמו אותם להדגרה בתמיסה של 10 millimolar DTT ו-10 milli molar TEP שהוכנה טרי. נפח התמיסה, בדרך כלל כ-30 microliters, חייב להיות מספיק כדי להטביע את חלקי הג'ל.השאירו את פיסות הג'ל להרדוקציה בתמיסה למשך 30 דקות בבלוק חימום בטמפרטורה של 56 degree Celsius. לאחר מכן, הסירו את תמיסת ה-DTT TEP והחליפו אותה בתמיסת שטיפה של 100 microliter של 500 millimolar ammonium bicarbonate ב-50%Acetonitrile; ערבבו ב-vortex למשך 10 דקות. לאחר הערבוב, שאבו את שטיפת ה-ammonium bicarbonate והחליפו אותה ב-200 microliters של Acetonitrile כדי לייבש את פיסות הג'ל. פיסות הג'ל אמורות להתכווץ ולהפוך למעולמות (opaque) תוך שתי דקות.לאחר האלקילציה, כדי להחליף כל קבוצות sulf hydros חופשיות, החלף את ה-acetyl nitrile ב-100 µL של תמיסת I OTO Acetamide בריכוז 100 mM שהוכנה טרי. דגרי את התערובת במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר הדגירה, הסר את תמיסת ה-IDO Acetamide ושטוף את חלקי הג'ל עם 200 µL של ammonium bicarbonate בריכוז 50 mM ו-50% Acetonitrile באמצעות וורטקס למשך חמש דקות.שלב שטיפה זה חוזר פעם אחת. הסירו את תמיסת השטיפה האחרונה והדגירו את חתיכות הג'ל ב-200 µL אצטוניטריל למשך 10 דקות. הסירו את האצטוניטריל ויבשו את הדגימות באמצעות speed vac.בשלב זה, פיסות הג'ל מוכנות לעיכול באמצעות טריפסין. יש להוסיף 30 µL של תמיסת טריפסין בריכוז עבודה של כ-20 ng/µL ולהדגיר על קרח למשך 10 דקות.חלקי הג'ל צריכים להתנפח היטב. יש להסיר את עודפי תמיסת ה-trypsin ולהטביע את חלקיקי הג'ל שעברו רהידרציה ב-30 µL של ammonium bicarbonate בריכוז 50 mM. יש לאפשר לעיכול להימשך במשך 12 עד 16 שעות ב-37 °C, ולאחר העיכול הממושך להוסיף 5 µL של formic acid בריכוז 5% כדי לנטרל את ה-trypsin ולהפסיק את העיכול.לאחר מכן, ערבבו את המבחנות ב-vortex למשך 15 דקות. לאחר הערבוב, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה לזמן קצר כדי להביא את הנוזל לתחתית המבחנה, והעבירו תמיסה זו המכילה את הפפטידים שעברו עיכול למבחנת half mill נקייה ומסומנת. בשלב הבא, כסו את חלקי הג'ל בכ-30 µL של תמיסת מיצוי המכילה 0.1% formic acid ב-50% acetyl NI trial, וערבבו ב-vortex למשך 10 עד 15 דקות. הוסיפו תמיסת מיצוי זו למבחנת ה-half mill החדשה.חזור על שלב זה. לאחר העברת תמיססת המיצוי למבחנה חדשה בנפח 0.5 מ"ל, נפח המבחנה המכילה את תמיססת העיכול מהלילה ואת שתי תמיססות המיצוי מופחת לכ-30 µL באמצעות SpeedVac. תמיססת פפטידים זו מוכנה כעת לאנליזה באמצעות LC-MS/MS.הפרידו את החלבונים באמצעות nano lc בפאזה הפוכה, תוך שימוש בעמודת C 18 בפאזה הפוכה; רכשו ספקטרה במצב תלוי-נתונים (data dependent mode), כאשר ה-orbitrap משמש לסריקות MS וה-LTQ לסריקות MS to MS. זהו את החלבונים על ידי חיפוש הנתונים מול מאגר ה-IPI של החולדה באמצעות אלגוריתם sequester המשולב בחבילת התוכנה Bioworks, ולאחר מכן בצעו בדיקה ידנית של הספקטרה עבור חלבונים המופיעים בכל אחד מארבעת חזרות הדגימות ואינם נוכחים ב-GST. אין להכליל pull downs נוספים לצורך ניתוח המשך.כאן מוצג ג'ל של צביעת Cipro המראה קשת של חלבונים משוערים המקיימים אינטראקציה עם הקצה C של רספטורי P two X two. מחוברים ל-GST כפי שמסומן בתיבה הכחולה; נתיבי ביקורת עבור GST לבדו מסומנים בתיבה הצהובה, וכן מוצגים glutathione sphero speeds לבדם.החצים מצביעים על דוגמאות של פסים ייחודיים שנגזרו להמשך אנליזה באמצעות ספקטרומטריית מסות. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבטא ולטהר את ה-CTOs של רצפטורי P two X two. כמו כן, הצגנו בפניכם כיצד לבצע את תהליך ה-pull down וכיצד לזהות את החלבונים האינטראקטיביים.חשוב לזכור בעת ביצוע פרוצדורה זו להרכיב כפפות ורשת לכיסוי השיער כדי להפחית את זיהום הקרטין בדגימות. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

proteomics-to-identify-proteins-interacting-with-p2x2-ligand-gated

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

התא חדיר crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] מייצב אינטראקציות חלוף...

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

גישת יוכימיים מתוארת לזהות באינטראקציות vivo חלבונים (PPI) של חלבונים בממברנה. השיטה משלבת צלב המקשר חלבון, טיהור זיקה וספקטרומטריית מסה, וניתנת להתאמה כמעט לכל סוג תא או האורגניזם. עם גישה זו, גם זיהוי של PPI החולף הופך לאפשרי.

קרום עמוד שדרה: ביוכימית כלי לזיהוי חלבונים אינטראקציות של חלבונים בממברנה בVivo

טכניקות biosensor אופטיות יכולות לזהות שינויים במסה ליד קרום הפלזמה בתאים חיים ומאפשרות אחד כדי לעקוב אחר תגובות תאיות בתאים ובאוכלוסיות של תאים בודדים. פרוטוקול זה יתאר גילוי האפנון של תעלות אשלגן על ידי קולטנים בשילוב ה-G-חלבון בתאים שלמים באמצעות גישה זו.

שימוש בBiosensors האופטי ללא תווית לזיהוי מודולציה של תעלות אשלגן על ידי קולטנים מצמידים G-חלבון

חלבונים מתקשרים זה עם זה ואינטראקציות אלה קובעות במידה רבה את תפקודיהם. ניתן לזהות שותפים לאינטראקציה עם חלבונים בתפוקה גבוהה in vivo באמצעות בדיקת כושר שמרים המבוססת על בדיקת השלמת שבר חלבון דיהידרופולאט רדוקטאז (DHFR-PCA).

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

וזמינותו הסלולר המתוארת נועד לצורך זיהוי הקולטן כימוקין CXC 4 (CXCR4)-סוכנים שמעצבת לעכב או לגרות, תחרותי או allosterically, תאיים Ca2 + שחרור שיזם CXCR4 הפעלה.

קינטי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית Ca2 + גיוס Assay לזהות את G-חלבון בשילוב קולטן אגוניסטים היריבים, מאפננים Allosteric

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מסך חלבון חוץ-תאי מיקרו-מערכים זיהוי הקולטן הרומן-ליגנד אינטראקציות תפוקה גבוהה. אנו גם מתארים שיטה כדי לשפר זיהוי של אינטראקציות חלבון ארעי באמצעות קומפלקסים של חלבונים-microbead.

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

מתן רגישות מתא בודד, cytometry זרימה בזמן אמת הוא לצורכיכם לכמת קולטן עם מודאלים מרובים פונקציות של תרבויות חיים. באמצעות ובתאים עצבית למבוגרים, הפונקציה קולטן P2X7 הוערכה באמצעות זרם סידן זוהה על ידי סידן אינדקטור, היווצרות נקבובית transmembrane על-ידי אתידיום ברומיד ספיגת ולאחר phagocytosis באמצעות חרוזים לייטקס פלורסנט.

Cytometry זרימה לחיות תאים בזמן אמת כדי לחקור סידן זרם היווצרות נקבובית, Phagocytosis על ידי רצפטורים P2X7 ובתאים עצבית למבוגרים

פרוטוקול זה מציג שיטה למדידת קשירת אדנין נוקלאוטיד לקולטנים בזמן אמת בסביבה תאית. הקישור נמדד כהעברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) בין נגזרות נוקלאוטידים של טריניטרופניל לבין חלבון המסומן בחומצת אמינו פלואורסצנטית לא קנוני.

מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת

טכניקות ליצירת ספרייה של פפטידים קצרים שיכולים להפעיל תאי פיסט באמצעות קולטן MRGPRX2 מתוארים. טכניקות הקשורות הן קלות, זולות, וניתן להרחיבן לקולטני תאים אחרים.

הקרנת פפטידים המפעילים MRGPRX2 באמצעות תאי HEK מהונדסים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר לכידה וזיהוי של אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות למחלה מתאים ורקמות מקומיות באמצעות בדיקות כימיות וספקטרומטריית מסה. מערכי הנתונים של האינטראקציה המתקבלים מנותחים באמצעות פלטפורמה ייעודית מבוססת אינטרנט כדי לחשוף ליקויים דינמיים ברשת ושינויים במסלול הקשורים למחלות.

מיפוי אינטראקציות חלבון-חלבון לא מתפקדות במחלה

שיטת ChIRP מבוססת UV לזיהוי אינטראקציות ישירות בין lncRNA לחלבון.

שיטת ChIRP מבוססת UV לזיהוי ניתן לאימות חלבונים המקיימים אינטראקציה ישירה עם LncRNA: מתאים מתורבתים לאשך עכבר

למדו לזהות חלבונים המקיימים אינטראקציה עם קרבוקסי-טרמינוס של קולטני P2X2 באמצעות שיטת pull-down עם חלבון GST וספקטרומטריית מסה. פרוטוקול זה מאפשר מיפוי מקיף של שותפי קשר במוח העכברוש.

Proteomics כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם ליגנד P2X2-מגודרת ערוצי קטיון

גלה סרטונים נוספים