Name: ES Cell-נגזר תא תרבויות Neuroepithelial (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: למדו לייצר תאי גזע עובריים לתאים קדם-נוירואפיתליאליים באמצעות SDIA. שיטה זו מסייעת לחוקרים לחקור מנגנוני התפתחות עצבית ולהתקדם ברפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

שלב 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Mitomycin-C-פלייט ggrowth עכבות (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​במשך 2.5 שעות) MS5 תאים בצפיפות של 70,000 / CM2 על ג&#39;לטין מצופה (0.01% במשך 30 דקות) 6 צלחות היטב α-ממ התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים המחוברים ואת יצרו monolayer (מעל צמיחה לילה), לעבור SRM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידנית לבודד תאים עובריים מושבות של תאים ES תרבויות באמצעות מזרק בעל מחט 27 ½ G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Tritrurate המושבות בזהירות עם קצה כחול 1 מ&quot;ל ו צלחת בצפיפות נמוכה על MS5 תאים (בדרך כלל 2-3 מושבות בכל צלחת 6 היטב). </li></ol> הערה: תאים ES יכולה גם להיות שנלקחו התפשטות אנזימטיות באמצעות collagenase או טריפסין. שלב 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול בתאים עובריים על MS5 ניזונים במשך 14-21 ימים עד ליצור מושבות שושנת המכילים. </li></ol> הערה: המדיה שינוי לעיתים קרובות. רוזטות הן בדרך כלל בקצוות החיצוניים של המושבות היווצרות שלהם יכול להיות מאוד משופר אם 300-500 ng / ml noggin מתווספת SRM (3). בכמה פרוטוקולים בידול, SRM ניתן להחליף עם N2-מדיה שיושלם עם צמיחה או גורמים אחרים כדי לקדם את המפרט תאים (2-5). שלב 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד לבחור את רוזטות עם 27 ½ G מחט תחת מיקרוסקופ. </li></ol> הערה: הימנע חיתוך לקטוף את MS5 בתאי סטרומה. אם המושבות עמוסים רוזטות, אפשר גם לבודד את המושבה כולה. שלב 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב לאשכולות רוזטות, tritrurate אותם בקפידה עם טיפ 1 מ&quot;ל כחול, צלחת אותם על פולי-L-ornithine (0.001%) ו פיברונקטין (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) או laminin (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) מצופה 6 בארות N2-מדיה להשלימו בדרך כלל עם bFGF (20 ng / ml). רוזטות תהיה רפורמה ולהרחיב. </li></ol> הערה: כדי לשפר את הישרדות התא, אפשר הצלחת אשכולות קטנים טיפות להגדיל את צפיפות התאים. צעד זה גם יכול להיות שונה על ידי השלמת N2-מדיה עם צמיחה נוסף או גורמים אחרים כדי לקדם את המפרט תאים (2-5).

<ol>
	<li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity.">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28, 31-40 (2000).</li><li>Perrier, A. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+midbrain+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).</li><li>Pruszak, J., Isacson, O., Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+dopaminergic+neurons.">Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons.</a> Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook. , (2007).</li><li>Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+and+methods+for+cell+sorting+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+cell+populations.">Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations.</a> Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).</li><li>Sonntag, K. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+yield+of+neuroepithelial+precursors+and+midbrain-like+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+using+the+bone+morphogenic+protein+antagonist+noggin.">Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin.</a> Stem Cells. 25, 411-418 (2007).</li><li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+dopaminergic+neurons+and+pigmented+epithelia+from+primate+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity.">Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).</li><li>Ko, J. Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursors+as+a+continuous,+stable,+and+on-demand+source+for+human+dopamine+neurons.">Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons.</a> J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).</li><li>Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+precursors+derived+from+human+embryonic+stem+cells+maintain+long-term+proliferation+without+losing+the+potential+to+differentiate+into+all+three+neural+lineages,+including+dopaminergic+neurons.">Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons.</a> J Neurochem. , (2007).</li><li>Zhang, S. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+subtype+specification+from+embryonic+stem+cells.">Neural subtype specification from embryonic stem cells.</a> Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).</li><li>Pankratz, M. T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+via+an+obligated+primitive+anterior+stage.">Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage.</a> Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).</li><li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+neural+rosettes+from+cloned+bovine+blastocysts:+a+model+of+early+neurulation+events+and+neural+crest+specification+in+vitro.">Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro.</a> Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).</li><li>Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+peripheral+sensory+and+sympathetic+neurons+and+neural+crest+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 923-930 (2005).</li></ol>

למחברים אין ניגודים להצהיר עליהם.

פרוטוקול זה מדגים את השלבים השונים ליצירת ובידוד neuroepithelial תאים מתאי גזע עובריים אנושיים באמצעות SDIA. יישום של שיטה זו הוא סעפת נעשה שימוש בפרוטוקולים רבים לייצר נוירונים המצוין (למשל 1, 2, 5-9). רוזטות נחשבים דומים התאים בצינור העצבי עם פנוטיפ קדמית (2, 5, 10), מכילים גם אבות הרכס העצבי (11, 12). בנוסף, הם שומרים על רמה מסוימת של גמישות, כיוון שהם יכולים להיות בדוגמת על ידי גורמים מסוימים בתנאים תרבות מוגדרת. לפיכך, SDIA הנגזרות אבות עצביים יכול להצמיח סוגי תאים רבים ממערכת העצבים המרכזית היקפ...

<table><tbody><tr><td>L-Glutamine</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>alpha-MEM</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12571</td><td></td></tr><tr><td>פניסלין/סטפטומיצין</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Knockout-DMEM</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>תחליף סרום Knockout</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חומצות שומשניות לא חיוניות של MEM</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12383</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td></td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>תוסף N2-A</td><td></td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07152</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin-C</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0503</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין מסוג A</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-ornithine</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td>תמיסת 0.01%</td></tr><tr><td>למינין</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2020</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה בסיסי לפיברובלסטים (bFGF)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>13256</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 1 mL עם מחט 27 1/2 G</td><td></td><td>BD Biosciences</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>מדיום N2-A</td><td>מדיום</td><td></td><td></td><td>DMEM/F12 + 1% תוסף N2-A</td></tr><tr><td>מדיום תחליף סרום (SRM)</td><td>מדיום</td><td></td><td></td><td>Knockout-DMEM + 20% תחליף סרום Knockout + 1% תמיסת חומצות שומשניות לא חיוניות של MEM + 2 mM L-glutamine</td></tr><tr><td>מדיום &amp;alpha;-MEM</td><td>מדיום</td><td></td><td></td><td>&amp;alpha;-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% פניסלין/סטפטומיצין</td></tr><tr><td>MS5</td><td>שורת תאים</td><td></td><td></td><td>תאי סטרומה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלטות 6 בארות</td><td></td><td></td><td></td><td>לתרבית רקמה</td></tr></tbody></table>

es cell-נגזר תא תרבויות neuroepithelial

ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures

לתאי גזע עובריים יש פוטנציאל להתמיין לתאי מכל שכבות נבט, מה שהופך אותם לכלי אטרקטיבי לפיתוח טיפולים חדשים. באופן כללי, התמיינות של תאים עובריים מלווה את המושג ראשית ליצור ובתאים לא בשלה, אשר לאחר מכן ניתן מופצות הבדיל לתוך פנוטיפים הסלולר בוגרת. זה חל גם על neurogenesis תא הנגזרות ES, שבו את התפתחותם של תאים עצביים בעקבות שני שלבים עיקריים: ראשית, גזירת והרחבת מבשרי neuroepithelial בשלה בידול השני שלהם לתוך תאים עצביים בוגרת. שיטה נפוצה כדי לייצר אבות עצביים מתאי גזע עובריים מבוסס על היווצרות embryoid הגוף (EB), אשר חושף את התמיינות של תאים מכל שכבות נבט כולל neuroectoderm. שיטה חלופית ויעילה יותר כדי לגרום להתפתחות התא neuroepithelial משתמשת פעילות סטרומה תא הנגזרות גרימת (SDIA), אשר ניתן להשיג על ידי שיתוף culturing תאים ES עם מח עצם הגולגולת שמקורם בתאי סטרומה (1). שניהם, היווצרות EB ו SDIA, לחשוף את הפיתוח של רוזטה כמו מבנים, אשר נחשבים דומים עצביים צינור ו / או עצביים לפסגה, כמו אבות. מבשרי עצביים יכולים להיות מבודדים, התרחבה מובחן יותר לתוך נוירונים ספציפיים בתאי גליה תנאי שימוש תרבות מוגדרת. כאן, אנו מתארים את הדור ובידוד של רוזטות כאלה שיתוף תרבות ניסויים עם קו תא סטרומה MS5 ​​(2-5).

גזירת מבשרי neuroepithelial מ עובריים (ES) בתאי גזע באמצעות פעילות סטרומה תא הנגזרות גרימת (SDIA).

ES Cell-נגזר תא תרבויות Neuroepithelial

לתאי ES יש פוטנציאל להתמיין לתאים מכל שכבות הנבט, מה שהופך אותם לכלי אטרקטיבי לפיתוח טיפולים חדשים. ב...

es-cell-derived-neuroepithelial-cell-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנחנו מראים השיטה שלנו לבודד אפידרמיס עכבר לתאי גזע עצביים לפסגה (EPI-NCSC). טכניקה מערבת מיקרו לנתח זקיקי השערה, בידוד בליטה ו placeing אותו בתרבית רקמה. EPI-NCSC להתחיל להגר explants בליטה על גבי תשתית בתוך 3-4 ימים.

עכבר עוריות עצבית קרסט לתאי גזע (EPI-NCSC) תרבויות

שיטה פשוטה ואמינה על בידוד תרבות בתאי גזע עצביים של רקמה אנושית מושלכים קליפת המוח העוברי מתואר. תרבויות שמקורם ידוע הפרעות נוירולוגיות האדם יכול לשמש אפיון של תהליכים פתולוגיים תאית ומולקולרית, כמו גם לספק פלטפורמה כדי להעריך את יעילות תרופתי.

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

תאים אנושיים neuroprogenitor (NPCs) הורחבו בתנאים מתרבים. NPCs היו מובחן לתרבויות נוירון, עשיר בנוכחות שילוב של neurotrophins. סמנים עצביים זוהו על ידי מכתים immunofluorescence. כדי לבודד אוכלוסייה טהורה של נוירונים, NPCs הובדל בשקופיות קרום PEN וmicrodissection ללכוד לייזר בוצע.

Microdissection לכידת לייזר של נוירונים מהתאים מובחנים Neuroprogenitor אדם בתרבות

תאי גזע עצביים שנקטפו מהמוח הבוגר מתרבים מנוצלים ביישומים החל המחקר הבסיסי של התפתחות מערכת עצבים לחקור יישומים קליניים פוטנציאליים ברפואת רגנרטיבית. זה הופך את השליטה קפדנית בתנאי הבידוד וculturing משמשים לגידול תאים אלה קריטיים להישמע תוצאות ניסוי.

גידול בתאי גזע עצבי מאזורים קונבנציונליים ולא קונבנציונליים של המוח מכרסם מבוגרים

מתוך כוונה לאפיין שינויים ב-miRNAs על תאי גזע עצביים אנושיים מובחנים (hNSCs) אנו מתארים התמיינות hNSC במערכת תלת מימדית, הערכת שינויים בביטוי microRNA על ידי מערך miRNA PCR, וניתוח חישובי לחיזוי יעד miRNA ואימותו על ידי בדיקת לוציפראז כפולה.

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

דור של תאי גזע pluripotent מושרה מספק סיכויים מרתקים לגזירה של השתלות אוטולוגית. עם זאת, ההתקדמות במדינת pluripotent מחדש בידול מייגע עדיין מעכבת תרגום קליני. כאן אנו מתארים את הגזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה הישירה שלהם לתאים עצביים מושרה ובידול שלאחר מכן לשושלות עצביות.

גזירה של fibroblasts אדם הבוגר וההמרה ישירה שלהם לתאים להרחבה עצבי אב

מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT) מאפשר לסרטן להפוך לפולשני. כדי לחקור EMT, מתואר מודל מבחנה מבוסס תאי גזע עצביים (NSC) נטול סרום ואנזימים. מערכת סטנדרטית זו מאפשרת הערכה כמותית ואיכותית של נדידת תאים, ביטוי גנים וחלבונים. המודל מתאים לגילוי תרופות.

Enzyme- ואת הסרום ללא דגם תרבית תאי גזע עצבי לחקירות EMT המתאימים גילוי תרופות

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור של התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים והבידול שלהם לתוך תאים מחולל קדמון. הפרוטוקול הוא פשוט, חסון, מדרגי, ומתאים לסינון סמים וליישומים רפואת התחדשות.

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה לneurite מוצלח הערכה ורעילות המוח של תרכובות מולקולה קטנה.

Neurite Outgrowth שיטת והערכה רעילות נוירועם האדם העצבי תא מחולל נוירונים

במאמר זה אנו מתארים מערכת נוקלאופקציה שנועדה לשפר את יעילות העברת הגנים בתאי גזע עצביים מורחבים (NSCs) שבודדו מהאזור התת-חדרי של המורין הבוגר. הממצאים מראים כי שיטה זו משפרת באופן משמעותי את ההפרעה הגנטית בתאי גזע גזעיים, עולה על היעילות של פרוטוקולי טרנספקציה מסורתיים ומשפרת את שיעור הישרדות התאים.

בידוד, התרחבות ונוקלאופקציה של תאי גזע עצביים מאזור תת-חדרי מורין בוגרים

אנו מציגים פרוטוקול התמיינות תלת מימדי (תלת מימדי) במבחנה המייצר נוירוספירות בגודל הניתן לשחזור כדי לייצר תאי פסגה עצבית גולגולתית מתאי גזע עובריים של עכברים. אנו מראים כי מתודולוגיה זו מפחיתה את השונות בהשוואה לפרוטוקולים קודמים וכיצד ניתן להשתמש בה לבדיקה מרובה לחקר התפתחות תאי פסגה עצבית גולגולתית.

תאי פסגה עצבית גולגולתית פרוטוקול התמיינות תלת מימדי במבחנה לבדיקה מרובבת

למדו לייצר תאי גזע עובריים לתאים קדם-נוירואפיתליאליים באמצעות SDIA. שיטה זו מסייעת לחוקרים לחקור מנגנוני התפתחות עצבית ולהתקדם ברפואה רגנרטיבית.

ES Cell-נגזר תא תרבויות Neuroepithelial

גלה סרטונים נוספים