עיבוד פיין Loblolly PtGen2 cDNA microarray

סרטון זה הופק על ידי חוקרים מבית הספר וורנל ליערנות ומשאבי טבע באוניברסיטת ג'ורג'יה. מטרת סרטון ההדרכה הזה היא לפרט כיצד לעבד את ה-LOB lolly pine pt, gen two CDNA, microarray תוך שימת לב מיוחדת לשטיפה וטיפול במערך, לפני ואחרי הכלאה. באופן כללי, הפרוטוקולים שלנו עוקבים אחר אלה שפותחו במכון למחקר גנומי Tiger ובמתקן המשאבים המשותפים של Vanderbilt Microarray, VMSR, שבו מודפסים המערכים שלנו.

מצאנו שנדרש עיבוד קפדני יותר של PT Gen Two כדי לספק את הכמות הגדולה ביותר של עקביות ביחס לאחידות איכות האות ורקעים נמוכים. השלב הראשון הוא שטיפה מוקדמת. אנו עושים זאת מכיוון שמאגר האיתור שלנו מכיל תכולת מלח גבוהה מאוד ושטיפה מוקדמת זו נחוצה כדי להסיר את המלח הזה.

השקופיות מונחות במנשא מיקרוסקופ וצוללות במרץ 15 עד 20 פעמים בתמיסת SDS של 0.2% שחוממה מראש ל-43 מעלות. לאחר שטיפת השקופיות בתמיסת SDS, הן מוסרות בזהירות בעזרת מלקחיים לצנצנת קופלנד המכילה מאגר טרום הכלאה. מאגר זה מכיל חמישה XSSC 0.1% SDS ו-1% BSA, והוא מחומם גם ב-43 מעלות.

צנצנת קופלנד מכוסה בבושם ומונחת בחממה של 43 מעלות למשך שעה. לאחר הכלאה מוקדמת, השקופיות מוסרות למנשא שקופיות במיקרוסקופ ומעובדות ברצף באמצעות חמישה שינויים של מים נטולי יונים שצוללים 15 עד 20 פעמים בכל שינוי. לבסוף, השקופיות מונחות באיזופרופנול וטובלות חמש או שש פעמים לפני שהן צנטריפוגות לייבוש בצנטריפוגת שבב M mate.

לאחר הצנטריפוגה, המגלשות מפוצצות באוויר דחוס המועבר דרך פילטר 0.2 מיקרון. לאחר מכן מכסים את המגלשות בהחלקות הרמה, שגם נוקו באוויר דחוס, ואנו משתמשים בקצה פיפטה קטן כדי להתאים את החלקת ההרמה למצב הנכון. בשקופית.

לאחר מיקום החלקות ההרמה, אך לפני הוספת מאגר ההכלאה, אנו מוסיפים 20 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי דיהי, שלושה אטול לבארות הלחות הממוקמות בקצות החדר. כעת אנו מוכנים להוסיף את ה-CDNA של היעד, שהושעו מחדש במאגר ההיברידיזציה. קצה הפיפטה ממוקם בקצה החלקת המרים והמגלשה והתמיסה מוזרמים לאט.

מצאנו כי ניצול האפקט הנימי לטעינת המערכים מספק את העקביות הגדולה ביותר ומפחית מאוד את השילוב של בועות לא רצויות. לאחר הוספת חומר היעד למערך, תא ההכלאה מורכב ומכוסה בנייר אלומיניום. לאחר מכן מכניסים את תא ההכלאה לאמבטיית מים רועדים לדגירת לילה, בדרך כלל 14 עד 16 שעות.

אמבט המים מכוון ל-48 מעלות והשייקר מכוון ל-50 סל"ד. חשוב לציין גם כי מנקודת הוספת תמיסת ההכלאה דרך כל השטיפות שלאחר הכלאה, ההליכים מתבצעים בתאורה חלשה למניעת חמצון פוטו. למחרת, השקופיות מוציאות מתא ההכלאה ומונחות בצנצנת קופלנד המכילה תמיסת כביסה מספר אחת, שחוממה מראש ל-53 מעלות.

המגלשות מורשות להישאר בצנצנת קופלנד למשך כדקה עד שההחלקות של המרים נופלות, ובשלב זה מסירים את השקופיות בעדינות בעזרת מלקחיים ומניחים במנשא שקופיות מיקרוסקופ כדי להמשיך בשטיפות. לאחר מכן המגלשות צוללות במרץ כ-15 עד 20 פעמים במיכל שני, המכיל גם תמיסת כביסה מספר אחת ב-53 מעלות. לאחר מכן מכסים את המיכל בבושם ומניחים אותו בשייקר אוויר אינקובטור המוגדר על 53 מעלות ומאה סל"ד.

לאחר תמיסת הדגירה והשטיפה של 10 דקות, מספר אחת, השקופיות צוללות במרץ 15 עד 20 פעמים למיכל עם תמיסת כביסה מספר שתיים, שנמצאת בטמפרטורת החדר המיכל. זה מכוסה בסרט פרה ומונח שוב על שייקר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות דגירה. לבסוף, השקופיות מוסרות מתמיסת כביסה מספר שתיים וצוללות במרץ 15 עד 20 פעמים למיכל עם תמיסת כביסה מספר שלוש.

לאחר מכן מוציאים את השקופיות למיכל שני של תמיסת כביסה מספר שלוש מכוסה בפרפיל ומניחים שוב על השייקר למשך 10 דקות. לאחר הכביסה הסופית, אנו מצנטריפוגים את השקופיות ליובש מוחלט. כדי לעשות זאת, אנו מניחים כובע פלקון של 15 מיל לתוך צינור חרוטי של 50 מיל, ואנו מניחים את ברקוד המערכים כלפי מטה לתוך הצינור החרוטי.

לאחר מכן מסתובבים הצינורות בראש דלי מתנדנד ב-1500 סל"ד בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, השקופיות מוסרות לסט שני של צינורות חרוטיים של 50 מיל, שכוסו בנייר אלומיניום. לאחר מכן מטוהרים את הצינורות בגז חנקן, המסונן דרך מסנן ומכסה של 0.22 מיקרון להובלה או לאחסון עד לסריקה.

אנו אוספים נתוני סריקה במערך סריקה של PerkinElmer 5,000. תמונת המערך מרושתת ונתוני סריקה גולמיים מעובדים וניתוח נתונים ראשוני נעשה עם חבילת תוכנות ההדמיה של Bio Discovery. לאחר מכן, נתוני עוצמת האות הנקודתיים מנורמלים כאשר ניתוח סטטיסטי מבוצע עם כלי מערך BRB, חבילה סטטיסטית מיקרו-מערך חזקה וזמינה בחינם הניתנת להורדה מהמכון הלאומי לסרטן.

ניתוח סטטיסטי אחר וחיפושי דפוסי ביטוי גנים מבוצעים עם דפוס ביטוי הגנים וחבילת הניתוח של Jeep PPAs. חבילת ניתוח מבוססת אינטרנט נוספת זמינה בחינם. תודה שצפית בסרטון שלנו כיצד לעבד את המיקרו-מערך של אורן לולי PT Gen שני.

האנשים הבאים היו אחראים על התוכן וההפקה של סרטון הדרכה זה.