עיבוד פיין Loblolly PtGen2 cDNA microarray
20 במרץ 2009
CDNA microarray PtGen2 פותחה ללימודי ביטוי גנים אורן loblolly, פ ' taeda, כוניפאר ומינים אחרים. כאן, אנו מציגים טרום ופוסט הכלאה הטיפול כביסה טכניקות שיכולות לשמש עם מערך זה להניב יותר עקביות, חפצים מופחת, ועל רקע נמוך.
סרטון זה הופק על ידי חוקרים מבית הספר וורנל ליערנות ומשאבי טבע באוניברסיטת ג'ורג'יה. מטרת סרטון ההדרכה הזה היא לפרט כיצד לעבד את ה-LOB lolly pine pt, gen two CDNA, microarray תוך שימת לב מיוחדת לשטיפה וטיפול במערך, לפני ואחרי הכלאה. באופן כללי, הפרוטוקולים שלנו עוקבים אחר אלה שפותחו במכון למחקר גנומי Tiger ובמתקן המשאבים המשותפים של Vanderbilt Microarray, VMSR, שבו מודפסים המערכים שלנו.
מצאנו שנדרש עיבוד קפדני יותר של PT Gen Two כדי לספק את הכמות הגדולה ביותר של עקביות ביחס לאחידות איכות האות ורקעים נמוכים. השלב הראשון הוא שטיפה מוקדמת. אנו עושים זאת מכיוון שמאגר האיתור שלנו מכיל תכולת מלח גבוהה מאוד ושטיפה מוקדמת זו נחוצה כדי להסיר את המלח הזה.
השקופיות מונחות במנשא מיקרוסקופ וצוללות במרץ 15 עד 20 פעמים בתמיסת SDS של 0.2% שחוממה מראש ל-43 מעלות. לאחר שטיפת השקופיות בתמיסת SDS, הן מוסרות בזהירות בעזרת מלקחיים לצנצנת קופלנד המכילה מאגר טרום הכלאה. מאגר זה מכיל חמישה XSSC 0.1% SDS ו-1% BSA, והוא מחומם גם ב-43 מעלות.
צנצנת קופלנד מכוסה בבושם ומונחת בחממה של 43 מעלות למשך שעה. לאחר הכלאה מוקדמת, השקופיות מוסרות למנשא שקופיות במיקרוסקופ ומעובדות ברצף באמצעות חמישה שינויים של מים נטולי יונים שצוללים 15 עד 20 פעמים בכל שינוי. לבסוף, השקופיות מונחות באיזופרופנול וטובלות חמש או שש פעמים לפני שהן צנטריפוגות לייבוש בצנטריפוגת שבב M mate.
לאחר הצנטריפוגה, המגלשות מפוצצות באוויר דחוס המועבר דרך פילטר 0.2 מיקרון. לאחר מכן מכסים את המגלשות בהחלקות הרמה, שגם נוקו באוויר דחוס, ואנו משתמשים בקצה פיפטה קטן כדי להתאים את החלקת ההרמה למצב הנכון. בשקופית.
לאחר מיקום החלקות ההרמה, אך לפני הוספת מאגר ההכלאה, אנו מוסיפים 20 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי דיהי, שלושה אטול לבארות הלחות הממוקמות בקצות החדר. כעת אנו מוכנים להוסיף את ה-CDNA של היעד, שהושעו מחדש במאגר ההיברידיזציה. קצה הפיפטה ממוקם בקצה החלקת המרים והמגלשה והתמיסה מוזרמים לאט.
מצאנו כי ניצול האפקט הנימי לטעינת המערכים מספק את העקביות הגדולה ביותר ומפחית מאוד את השילוב של בועות לא רצויות. לאחר הוספת חומר היעד למערך, תא ההכלאה מורכב ומכוסה בנייר אלומיניום. לאחר מכן מכניסים את תא ההכלאה לאמבטיית מים רועדים לדגירת לילה, בדרך כלל 14 עד 16 שעות.
אמבט המים מכוון ל-48 מעלות והשייקר מכוון ל-50 סל"ד. חשוב לציין גם כי מנקודת הוספת תמיסת ההכלאה דרך כל השטיפות שלאחר הכלאה, ההליכים מתבצעים בתאורה חלשה למניעת חמצון פוטו. למחרת, השקופיות מוציאות מתא ההכלאה ומונחות בצנצנת קופלנד המכילה תמיסת כביסה מספר אחת, שחוממה מראש ל-53 מעלות.
המגלשות מורשות להישאר בצנצנת קופלנד למשך כדקה עד שההחלקות של המרים נופלות, ובשלב זה מסירים את השקופיות בעדינות בעזרת מלקחיים ומניחים במנשא שקופיות מיקרוסקופ כדי להמשיך בשטיפות. לאחר מכן המגלשות צוללות במרץ כ-15 עד 20 פעמים במיכל שני, המכיל גם תמיסת כביסה מספר אחת ב-53 מעלות. לאחר מכן מכסים את המיכל בבושם ומניחים אותו בשייקר אוויר אינקובטור המוגדר על 53 מעלות ומאה סל"ד.
לאחר תמיסת הדגירה והשטיפה של 10 דקות, מספר אחת, השקופיות צוללות במרץ 15 עד 20 פעמים למיכל עם תמיסת כביסה מספר שתיים, שנמצאת בטמפרטורת החדר המיכל. זה מכוסה בסרט פרה ומונח שוב על שייקר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות דגירה. לבסוף, השקופיות מוסרות מתמיסת כביסה מספר שתיים וצוללות במרץ 15 עד 20 פעמים למיכל עם תמיסת כביסה מספר שלוש.
לאחר מכן מוציאים את השקופיות למיכל שני של תמיסת כביסה מספר שלוש מכוסה בפרפיל ומניחים שוב על השייקר למשך 10 דקות. לאחר הכביסה הסופית, אנו מצנטריפוגים את השקופיות ליובש מוחלט. כדי לעשות זאת, אנו מניחים כובע פלקון של 15 מיל לתוך צינור חרוטי של 50 מיל, ואנו מניחים את ברקוד המערכים כלפי מטה לתוך הצינור החרוטי.
לאחר מכן מסתובבים הצינורות בראש דלי מתנדנד ב-1500 סל"ד בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, השקופיות מוסרות לסט שני של צינורות חרוטיים של 50 מיל, שכוסו בנייר אלומיניום. לאחר מכן מטוהרים את הצינורות בגז חנקן, המסונן דרך מסנן ומכסה של 0.22 מיקרון להובלה או לאחסון עד לסריקה.
אנו אוספים נתוני סריקה במערך סריקה של PerkinElmer 5,000. תמונת המערך מרושתת ונתוני סריקה גולמיים מעובדים וניתוח נתונים ראשוני נעשה עם חבילת תוכנות ההדמיה של Bio Discovery. לאחר מכן, נתוני עוצמת האות הנקודתיים מנורמלים כאשר ניתוח סטטיסטי מבוצע עם כלי מערך BRB, חבילה סטטיסטית מיקרו-מערך חזקה וזמינה בחינם הניתנת להורדה מהמכון הלאומי לסרטן.
ניתוח סטטיסטי אחר וחיפושי דפוסי ביטוי גנים מבוצעים עם דפוס ביטוי הגנים וחבילת הניתוח של Jeep PPAs. חבילת ניתוח מבוססת אינטרנט נוספת זמינה בחינם. תודה שצפית בסרטון שלנו כיצד לעבד את המיקרו-מערך של אורן לולי PT Gen שני.
האנשים הבאים היו אחראים על התוכן וההפקה של סרטון הדרכה זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג את מיקרו-מערך ה-cDNA PtGen2 שפותח למחקרי ביטוי גנים באורן הלובלי ומינים אחרים של מחטניים. המאמר מפרט את שיטות הטיפול והשטיפה לפני ואחרי הכלאה כדי לשפר את העקביות ולהפחית ארטפקטים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ניתוח ביטוי גנים
- טכנולוגיית מיקרו-מערכים
- ביולוגיה של צמחים
רקע
- מיקרו-מערכי cDNA חיוניים לחקר ביטוי גנים.
- PtGen2 תוכנן במיוחד לאורן הלובלי ולמחטניים.
- טכניקות טיפול נכונות חיוניות לתוצאות אמינות.
- תכולת מלח גבוהה במאגר הכתמים מחייבת שטיפה מקדימה.
מטרת המחקר
- לשפר את העקביות של נתוני ביטוי גנים.
- להפחית רעש רקע בתוצאות המיקרו-מערך.
- לספק פרוטוקול סטנדרטי לחוקרים.
שיטות ששימשו
- שטיפה מקדימה להסרת מלחים ממאגר הכתמים.
- שיטות שטיפה קפדניות לאחר הכלאה.
- השוואה עם פרוטוקולים ממתקני מחקר מבוססים.
- הערכת איכות האות ורמות הרקע.
תוצאות עיקריות
- נצפתה עקביות משופרת באיכות האות.
- הושגו רמות רקע נמוכות יותר באמצעות טכניקות משופרות.
- הפרוטוקולים הוכחו כיעילים בניסויים מרובים.
- הוצעו המלצות למחקרים עתידיים.
מסקנות
- טכניקות טיפול ושטיפה משופרות חיוניות להצלחת מיקרו-מערך.
- פרוטוקולים סטנדרטיים יכולים להוביל לנתוני ביטוי גנים אמינים יותר.
- מחקר עתידי יכול לבנות על ממצאים אלו לתוצאות טובות יותר.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key challenge in plant genomics: achieving reproducible microarray data despite high-salt spotting buffers that can introduce artifacts. By standardizing pre- and post-hybridization washing steps, the method enhances data consistency and reduces background noise, supporting reliable gene expression profiling in conifer species. This contributes to target validation efforts in forestry biotechnology by enabling clearer detection of differentially expressed genes under experimental conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional responses in conifer tissues, supporting hypothesis testing in stress or developmental pathways.
- Operational Value: Reduces technical variability from salt artifacts, improving confidence in target identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, low-background microarray slides suitable for reproducible hybridization across experimental groups.
- Operational Value: Establishes a robust slide preparation workflow that enhances assay reproducibility and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by providing reliable expression profiles from pine tissues, useful in studying environmental adaptation or wood formation.
- Operational Value: Facilitates cross-study comparability through consistent slide processing, aiding translational continuity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology workflow, specifically supporting reliable target profiling in non-model plant systems where genetic tools are limited.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven expression analysis in loblolly pine, clarifying gene responses in root, needle, and stem tissues.
- Screening: Delivers microarray slides with uniform signal quality, enabling reliable comparative screening of gene expression under varying conditions.
- Analytics: Generates clean, normalized signal intensity data compatible with downstream tools like BRB Array Tools and JePPAs for statistical analysis.
- Translational Research: Supports continuity from gene discovery to functional validation by providing trustworthy expression baselines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable slide preparation protocol that can be applied across multiple conifer species and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in gene expression measurements by minimizing salt- and SDS-derived artifacts.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across slides and laboratories through defined washing and handling steps.
- Strategic Value: Reduces risk of false positives/negatives in expression profiling, supporting better go/no-go decisions in target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidate genes based on cleaner, more reliable expression data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microarray handling and hybridization techniques.
- Needs access to temperature-controlled water baths, incubators, and centrifuges for slide processing.
- Demands standardized reagents including SDS, SSC, BSA, and isopropanol for washing and dehydration.
- Requires adaptation of humidity control and hybridization timing based on target RNA source and labeling method.
- Practical limitation: High-salt spotting buffer necessitates rigorous pre-washing; incomplete salt removal may persist if steps are shortened.
