Name: עיבוד פיין Loblolly PtGen2 cDNA microarray (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: למד עיבוד מערך PtGen2 cDNA לביטוי גנים באורן loblolly. שיטות שטיפה וטיפול מחמירות לפני ואחרי הכלאה מבטיחות אחידות באות ורקע נמוך לתוצאות אמינות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תיוג, הכלאה, ופרוטוקולים כביסה בזאת להכיל כמה שינויים אלה פיתחה בעבר ואילו במכון לחקר הגנום (TIGR), ד&quot;ר שון לוי ב microarray ונדרבילט משאבים משותפים (VMSR) על ידי ד&quot;ר י Quackenbush, וד&quot;ר רוב אלבה תוך תומפסון בויס המכון, (BTI) מאוניברסיטת קורנל.

<ol><li>Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+stress-responsive+genes+in+loblolly+pine+%28Pinus+taeda%29+roots+identified+by+analyses+of+expressed+sequence+tag+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Physiol%22%5BJournal%5D)">Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries.</a> Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).</li>
<li>Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.</li>
<li>Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concise+guide+to+cDNA+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A concise guide to cDNA microarray analysis.</a> Biotechniques. 29, 548-562 (2000).</li>
<li>Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESTs%2C+cDNA+microarrays%2C+and+gene+expression+profiling%3A+tools+for+dissecting+plant+physiology+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development.</a> The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).</li>
<li>Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. August 25-29, Quebec City, Quebec, , (2008).</li>
<li>Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. September 24-27, Albena, Bulgaria, , (2008).</li>
</ol>

PtGen2 היא פיתחה לאחרונה, cDNA microarray מותאם אישית נועד לשמש בעיקר על ידי הקהילה אורן loblolly מחקר. תוצאות ראשוניות שנוצר עד כה הראו את מערך להיות כלי חשוב בהערכת תעתיק אירועים המתרחשים בתגובה ללחץ בצורת, כמו גם ניטור השינויים המתרחשים במהלך התפתחות העובר בתוך הימי אורן, Pinus pinaster 5,6 לנו גם הוכיחו לאחרונה כי PtGen2 עובד היטב הכלאות זנים לחצות באמצעות דגימות שבודדו היעד מגוון רחב של סוגים כוניפאר. 5 כפי PtGen2 הופך להיות מנוצל יותר על ידי חו...

<table><tbody><tr><td>בפרה-היברידיזציה בופר</td><td>בופר</td><td></td><td></td><td>5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA</td></tr><tr><td>בופר היברידיזציה</td><td>בופר</td><td></td><td></td><td>30% פורממיד, 5X SSC, 5X Denhardt&amp;rsquo;, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS</td></tr><tr><td>תמיסת שטיפה מס' 1</td><td>בופר</td><td></td><td></td><td>SSC בריכוז 1X, SDS בריכוז 0.2%, חימום מוקדם ל-43&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>תמיסת שטיפה מס׳ 2</td><td>בופר</td><td></td><td></td><td>0.1X SSC, 0.2% SDS</td></tr><tr><td>תמיסת שטיפה מס' 3</td><td>בופר</td><td></td><td></td><td>0.1X SSC</td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול</td><td>ריאגנט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34959-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות קוניות של 50 מ"ל</td><td>אחר</td><td>Falcon BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות קוניות של 15 מ"ל</td><td>אחר</td><td>Falcon BD</td><td>352196</td><td>השתמשו במכסה זה או במכסה דומה הממוקם בתחתית של כל מבחנה קונוית בנפח 50 מ"ל במהלך סבוב במ centriugation</td></tr><tr><td>צנצנת קופלין</td><td></td><td>Wheaton</td><td>900520</td><td></td></tr><tr><td>צלחית צביעה &amp;מעמד* </td><td>אחר</td><td>Wheaton</td><td>900200</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין מסרום בקר (BSA)</td><td>אחר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9418</td><td></td></tr><tr><td>RNA עם זנב פולי-A</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>POLYA.GF</td><td></td></tr><tr><td>סימון cDNA עקיף באמצעות SuperScriptTM </td><td>ערכה</td><td>Invitrogen</td><td>L1014-02</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>ערכה</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>מערכת</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צבע Cy-5</td><td>ריאגנט</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25001</td><td></td></tr><tr><td>צבע Cy-3</td><td>ריאגנט</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23001</td><td></td></tr><tr><td>החלקות מעליות&amp;#8482;</td><td>אחר</td><td>Erie Scientific</td><td>25X601</td><td></td></tr><tr><td>תאי היברידיזציה</td><td>ציוד</td><td>GeneMachines</td><td>JHYB200003</td><td></td></tr></tbody></table>

עיבוד פיין loblolly ptgen2 cdna microarray

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 הוא cDNA microarray 26,496 תכונה המכיל מוגבר אורן ESTs loblolly. מערך מיוצר במעבדה שלנו לשימוש על ידי חוקרים לומד ביטוי גנים במינים כוניפאר אורן אחרים. PtGen2 פותחה בעקבות גילוי הגן שלנו מאמצים אורן loblolly, והוא מורכב רצפים מזוהים בעיקר לרקמות השורש, אלא גם מן המחט גזע. 1,2 PtGen2 נבדק על ידי והכלאה שונים סיי-צבע שכותרתו cDNAs כוניפאר היעד , הן באמצעות מוגבר ולא מוגבר בשיטות תיוג עקיף, נבדק גם עם מספר תנאים הכלאה ושטיפת. וידאו זה מתמקד בטיפול ועיבוד של שקופיות לפני ואחרי הכלאה מראש, כמו גם לאחר הכלאה, בעזרת כמה שינויים הנהלים שפותחו בעבר. 3,4 כמו כן, בצורת טקסט בלבד, הם הפרוטוקולים המשמשים הדור, תיוג ולנקות של cDNA של היעד, כמו גם מידע על תוכנה המשמשת לעיבוד נתונים במורד הזרם. PtGen2 מודפס עם חיץ להדפיס קניינית המכילה ריכוזים גבוהים של מלח זה יכול להיות קשה להסיר לחלוטין. השקופיות נשטפים הראשון לפתרון SDS חמים לפני הכלאה מראש. לאחר הכלאה מראש, השקופיות נשטפים במרץ כמה שינויים של מים כדי להשלים את הסרת מלחים הנותרים. LifterSlips ™ מנקים אז וממוקמים על השקופיות ומסומן cDNA נטען בזהירות בדרך של פעולה נימי המספק להפצה גם של המדגם על פני השקופית על microarray, ומקטין את הסיכוי ההתאגדות בועה. הכלאה של מטרות למערך נעשית על 48 מעלות צלזיוס בתנאי לחות גבוהה. לאחר ההכלאה, בסדרה של שוטף רגיל נעשים על 53 מעלות צלזיוס בטמפרטורת החדר במשך פעמים המורחבת. עיבוד PtGen2 שקופיות באמצעות טכניקה זו מפחיתה מלח SDS-derived חפצים נראים לעתים קרובות כאשר מערך מעובד פחות קפדני. והכלאה מטרות הנגזרות מספר מקורות שונים כוניפאר RNA, פרוטוקול זה הניב ממצאים פחות עיבוד, רקע מופחת, ובלבד עקביות טוב יותר בין קבוצות הניסוי שונים של מערכים.

CDNA microarray PtGen2 פותחה ללימודי ביטוי גנים אורן loblolly,<em&gt; פ &#39; taeda</em&gt;, כוניפאר ומינים אחרים. כאן, אנו מציגים טרום ופוסט הכלאה הטיפול כביסה טכניקות שיכולות לשמש עם מערך זה להניב יותר עקביות, חפצים מופחת, ועל רקע נמוך.

עיבוד פיין Loblolly PtGen2 cDNA microarray

PtGen2 הוא מערך cDNA מיקרוארה (microarray) בעל 26,496 מאפיינים, המכיל ESTs מוגברים של אורן לובלולי (loblolly pine). המערך מיוצר במעבדה שלנו לשימושם של חוקרים...

סרטון זה הופק על ידי חוקרים בבית הספר ליערנות ומשאבי טבע וורנל של אוניברסיטת ג'ורג'יה. מטרתו של סרטון הדרכה זה היא לפרט כיצד לעבד את ה-LOB lolly pine pt, gen two CDNA, microarray שלנו, תוך מתן דגש מיוחד לשטיפה ולטיפול במערך, הן לפני והן אחרי ההיברידיזציה. באופן כללי, הפרוטוקולים שלנו עוקבים אחר אלו שפותחו במכון למחקר גנומי טיגר ובמתקן המשאבים השיתופי למערכים מיקרוסקופיים של ונדרבילט, VMSR, שבו מודפסים המערכים שלנו.מצאנו כי נדרש עיבוד קפדני יותר של PT Gen two כדי להשיג את רמת העקביות הגבוהה ביותר ביחס לאחידות איכות האות ולרקע נמוך. השלב הראשון הוא שטיפה מקדימה. אנו מבצעים זאת מכיוון שבסניק המנקיטה (spotting buffer) שלנו ישנו תכולת מלח גבוהה מאוד, ושטיפה מקדימה זו נחוצה כדי להסיר מלח זה.מניחים את הזכוכיות בנשאת זכוכיות למיקרוסקופ וטובלים אותן בעוצמה 15 עד 20 פעמים בתמיסת 0.2%SDS שחוממה מראש ל-43 degrees. לאחר שטיפת הזכוכיות בתמיסת ה-SDS, מוציאים אותן בזהירות בעזרת פינצטה אל תוך צנצנת קופלנד (Copeland jar) המכילה בופר טרום-היברידיזציה. בופר זה מכיל 5XSSC, 0.1%SDS ו-1%BSA, וגם הוא מחומם ל-43 degrees.מכסים את צנצנת קופלנד (Copeland jar) בפרפיום ומניחים אותה באינקובטור בטמפרטורה של 43 מעלות למשך שעה אחת. לאחר שלב קדם-ההכשרה (pre hybridization), מעבירים את השקופיות לנשאי שקופיות עבור מיקרוסקופ ומעבירים אותן ברצף דרך חמישה החלפות של מים דאיוניים, תוך טבילה של 15 עד 20 פעמים בכל החלפה. לבסוף, מניחים את השקופיות באיזופרופנול וטובלים אותן חמש או שש פעמים לפני סבוב במרכזת Chip 'n Mate לייבוש.לאחר הצנטריפוגה, מייבשים את השקופיות באמצעות אוויר דחוס העובר דרך מסנן של 0.2 מיקרון. לאחר מכן, מניחים על השקופיות פסי הרמה (lifter slips), שגם הם נוקו באוויר דחוס, ומשתמשים בקצה של פיפטה קטנה כדי לדייק את מיקום פס ההרמה על גבי השקופית.לאחר מיקום פסי ההרמה (lifter slips), אך לפני הוספת תמיפת ההיברידיזציה, נוסיף 20 µL של 100 mM dihi, three atol לבארי הלחות הממוקמים בקצות התא. כעת אנו מוכנים להוסיף את ה-CDNAs של המטרה, אשר הומסו מחדש בתמיפת היברידיזציה. קצה הפ pipette מונח בקצה פס ההרמה והסלייד, והתמיסה מוספת באיטיות באמצעות פיפטה.מצאנו כי שימוש באפקט הנימיות להטענת המערכים מספק את העקביות הרבה ביותר ומפחית משמעותית את שילובם של בועות אוויר לא רצויות. לאחר הוספת החומר המטרה למערך, מורכב תא ההכשרה ומכוסה בנייר אלומיניום. לאחר מכן, תא ההכשרה מועמד בבן-מאריא רועד לדגירה למשך הלילה, בדרך כלל 14 עד 16 שעות.מכשיר אמבט המים מכוון ל-48 °C והשייקר מכוון ל-50 rpm. חשוב לציין כי מרגע הוספת תמיסת ההיברידיזציה ועד לסיום כל שטיפות הפוסט-היברידיזציה, הפעולות מבוצעות בתנאי תאורה עמומים כדי למנוע חמצון פוטו-כימי. למחרת, השקופיות מוצאות מתא ההיברידיזציה ומונחות בצנצנת קופלנד (Copeland jar) המכילה את תמיסת השטיפה מספר 1, שחוממה מראש ל-53 °C.מניחים לשקופיות להישאר בצנצנת קופלנד (Copeland) למשך כדקה עד שהפסי המרימה נופלים, בנקודה זו מוציאים את השקופיות בעדינות בעזרת פינצטה ומניחים אותן בנשא שקופיות למיקרוסקופ כדי להמשיך בשטיפות. לאחר מכן, טובלים את השקופיות בעוצמה כ-15 עד 20 פעמים במיכל שני, המכיל גם הוא את תמיסת השטיפה מספר 1 בטמפרטורה של 53 מעלות. את המיכל מכסים עם פאראפילם ומניחים אותו במנער אוויר בתוך אינקובטור המוגדר ל-53 מעלות ומאה RPM.לאחר דגירה של 10 דקות ושטיפה בתמיסת שטיפה מספר 1, טובלים את השקופיות בחוזקה 15 עד 20 פעמים בתוך כלי עם תמיסת שטיפה מספר 2, הנמצאת בטמפרטורת החדר. את הכלי מכסים ב-para film ומניחים אותו שוב על שייקר בטמפרטורת החדר לדגירה של 10 דקות. לבסוף, מוציאים את השקופיות מתמיסת שטיפה מספר 2 וטובלים אותן בחוזקה 15 עד 20 פעמים בתוך כלי עם תמיסת שטיפה מספר 3.לאחר מכן מעבירים את השקופיות למכל שני של תמיסת שטיפה מספר שלוש, המכוסה בנייר פרפיל, ומניחים אותן שוב על השייקר למשך 10 דקות. לאחר השטיפה הסופית, אנו מרכזים את השקופיות כדי להבטיח ייבוש מלא. לצורך כך, אנו מניחים מכסה של מבחנה Falcon בנפח 15 mil בתוך מבחנה קונית בנפח 50 mil, ומניחים את המערכים בתוך המבחנה הקונית כאשר צד הברקוד פונה כלפי מטה.לאחר מכן, מסובבים את המבחנות בראש עם דליים נדנדים (swinging bucket head) במהירות של 1500 RPM בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, מעבירים את השקופיות למערכת שנייה של מבחנות קוניות בנפח 50 mil, שעוטפו בנייר אלומיניום. לאחר מכן, מנקים את המבחנות באמצעות גז חנקן, המסונן דרך מסנן של 0.22 micron, וסוגרים אותן לצורך הובלה או אחסון עד לשלב הסריקה.אנו אוספים נתוני סריקה באמצעות PerkinElmer scan array 5,000. תמונת המערך מחולקת לרשת, ונתוני הסריקה הגולמיים מעובדים ואילו ניתוח הנתונים הראשוני מבוצע באמצעות חבילת תוכנת ההדמיה של bio discovery. לאחר מכן, נתוני עוצמת האות של הנקודות מנורמלים וניתוחים סטטיסטיים מבוצעים באמצעות BRB array tools, חבילה סטטיסטית חזקה וזמינה בחינם עבור מערכי מיקרו-מערכים (microarrays), שניתן להוריד מה-National Cancer Institute.ניתוחים סטטיסטיים נוספים וחיפושים אחר דפוסי ביטוי גנים בוצעו באמצעות חבילת התוכנה Jeep PPAs לניתוח ודפוסי ביטוי גנים, שהיא חבילת ניתוח מקוונת נוספת הזמינה בחינם. תודה שצפיתם בסרטון שלנו על אופן העיבוד של מערך המיקרו-מערכים PT Gen two של אורן לובלולי (lob lolly pine).האנשים הבאים היו אחראים על התוכן וההפקה של סרטון הדרכה זה.

processing-the-loblolly-pine-ptgen2-cdna-microarray

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד...

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

הצמח וברקמות רבים, כולל השיפה ו העצה של אורן loblolly...

שיטה משופרת של בידוד RNA מן אורן Loblolly ( פ &#39; taeda ל) ומינים אחרים Conifer

בחיפוש יסודי ביולוגיה של התא היא להגדיר את המנגנונים העומדים בבסיס זהותה של האברונים המרכיבים התאים האיקריוטים. כאן אנו מציעים שיטה לזהות את הגנים האחראים על תקינות מורפולוגית ופונקציונלית של אברונים צמחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואת הדור הבא של כלים רצף.

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

כתב יד זה מתאר את השימוש בטכנולוגיה חדישה המסופקת על ידי מיקרו-מערכי DNA. מיקרו-מערכים מספקים סקירה כללית של השינויים הטרנסקריפטומיים בחיידקים שנגרמו בתנאי מסוים. יתר על כן, אנו מדגישים את הקלות שבה ניתן לנתח כמויות גדולות של נתונים באמצעות חבילות תוכנה נוחות שפותחו בבית.

צינור מהיר ואמין למחקר בקטריאלי transcriptome ניתוח מקרה: ויסות גני Serine תלויה ב<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

טכנולוגיית Microarray מאפשרת מדידה כמותית ופרופיל ביטוי גנים של תעתיקים על בסיס גנומי. לכן, פרוטוקול זה מספק הליך טכני אופטימלי במערך בקר בהתאמה אישית בשני צבעים תוך שימוש בעוברי בקר ביום 7 כדי להדגים את ההיתכנות של שימוש בכמות נמוכה של RNA כולל.

Transcriptome Profiling של In-Vivo עוברי אדם שור הופק באמצעות פלטפורמת microarray שני צבעים

מאמר זה מתאר את היישום של metabolomics לא ממוקד, transcriptomics ניתוח סטטיסטי רב משתני תמלילי ברי ענבים מטבוליטים כדי לקבל תובנה לגבי מושג טרואר, כלומר, השפעת הסביבה על תכונות איכות ברה.

קונספט טרואר לפרש דרך הענבים הברים Metabolomics ו transcriptomics

מאמר זה מתאר הליך זיהוי ואפיון של משפחה ג'ין הגפן חלה על משפחתו של תודרנית Tóxicos ב Levadura (ATL) E3 אוביקוויטין ligases.

זרימת עבודה מקיפה עבור הביטוי מטא אנליזה ATL E3 אוביקוויטין ליגאז ג'ין משפחת גפן וזיהוי הגנום כולו

פרוטוקול זה מתאר את התהליכים כללי, בקרת איכות בודק הדרושים להכנת בריאים למבוגרים תאים בודדים בתרבית של תפוקה גבוהה, מבוסס-droplet תא בודד RNA-Seq ההכנות. קביעת רצף פרמטרים, יישור קריאה וניתוח bioinformatic תא בודד במורד הזרם הינם גם מסופקים.

רביב Transcriptomics מבוססי Barcoding תא בודד של רקמות בוגרות יונקים

מחקר זה מציג פרוטוקול מולטיאום מרחבי Trekker–CUT&amp;Tag, המשלב ברקידוד מרחבי ישיר של חתך רקמה עם ניתוח מולטיאום חד-תאים. גישה זו מאפשרת פרופילינג חד-תאי של ביטוי גנים ושינוי ההיסטון H3K27ac בו-זמנית, ומציעה תובנות מכניות על ויסות גנים בהקשר של מיקרואנטומיה של רקמות.

לאחר פתרון מרחבי, פרופיילינג מולטיאומי חד-תאי משולב של מטרות טרנסקריפטום ואפיגנומיה בחתכי רקמה קפואים.

כדי לחקור את תהליכי ההתפתחות של ascospores ב Gibberella zeae, נוהל איסוף בתנאים סטריליים מצולם על מנת להפיק את הרמה הגבוהה ביותר של מידע עבור תיאור פרוטוקול. זה אמור להקל על שחזור של הניסוי, היבט חיוני כאשר ביטוי מלא הגנום בדיקות פרופיל מיושמים.

Gibberella zeae Ascospore ייצור אוסף לניסויים microarray.

למד עיבוד מערך PtGen2 cDNA לביטוי גנים באורן loblolly. שיטות שטיפה וטיפול מחמירות לפני ואחרי הכלאה מבטיחות אחידות באות ורקע נמוך לתוצאות אמינות.

עיבוד פיין Loblolly PtGen2 cDNA microarray

גלה סרטונים נוספים