הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging
13 במרץ 2009
שיטה פשוטה, זולה, יעילה של הכנת עוברים תסיסנית לניתוח לחיות הדמיה מוצג. פרוטוקול שלנו מספק לחות חילוף הגזים ולא לדחוס את העובר תסיסנית. שיטה זו מתאימה עבור הדמיה GFP מבוססי לחיות עוברים תסיסנית באמצעות מיקרוסקופ stereomicroscope או תרכובת זקוף.
שלום. שמי ברוס ריד. אני פרופסור עוזר במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת ווטרלו בווטרלו, אונטריו, קנדה. אנו יוצרים את ארכיון הווידאו הזה היום כדי לתעד טכניקה חדשה שפיתחנו להכנתו של עוברים רכים לצורך ניתוח של הדמיה חיה.
בעת ביצוע אנליזת דימוג חי של עוברי דרוסופילה, אנו משתמשים לעיתים קרובות ברכישת תמונות בשיטת time-lapse, שעלולה להימשך מספר שעות. לכן, חשוב להשתמש בטכניקה שבה העוברים מוגנים מפני התייבשות ומפני היפוקסיה. בנוסף, ברצוננו לפתח טכניקה שתמנע כל דחיסה שלו של העובר.
בכל הנוגע להרכבה, הגענו לשיטה פשוטה, זולה ויעילה שאנו מכנים הכנת טיפה תלויה (hanging drop). הכנת הטיפה התלויה מתאימה לאנליזה של דימות חי של עוברים באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי או כל מיקרוסקופ פתוח (upright compound microscope). סרטון time-lapse זה מציג שמונה עוברים המבטאים GFP, שהוכנו באמצעות פרוטוקול הטיפה התלויה ודוממו במיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשיטת time-lapse.
רצף הדמיה זה מייצג זמן שעבר של למעלה מארבע שעות. תחילת התנועה מעידה על כך שעוברים אלה נמצאים במצב חי. כעת נדריך אתכם בתיאור מפורט שלב אחר שלב כיצד לבצע את פרוטוקול הטיפה התלויה (Hanging drop).
עוברי עוברים נאספים על מצעי מיץ ענבים סטנדרטיים, ביצים, או צלחות. באמצעות אספן ביצים אוטומטי מסוג dsof FLA מחברת Fly max scientific equipment, מאפשר האספן האוטומטי איסוף מסונכרן של עוברי עוברים בשלב התפתחותי שנקבע מראש. כהכנה לסידור ידני של העוברים, מדביקים פיסת סרט דביק דו-צדדי על תבנית מיקרוסקופ ומסירים את גב הסרט.
פרוטוקול הטיפה התלויה דורש תא ייעודי העשוי מלוח פוליקרבונט בעובי 5 mm. הלוח נגזר למידות של זכוכית מיקרוסקופ, ובעזרת רוטור נוצרת שקע בעומק 3 mm. לחות בתא הדימות החי מושגת באמצעות פיסת טישיו שנגזרת כך שתתאים לבאר של התא וספוגה במים מזוקקים.
שמן Halo Carbon אידיאלי לדימות חי של עוברים של drosophila מתואמים מכיוון שהוא חדיר לגזים וצלול מבחינה אופטית. ערבוב של שמן halo carbon series 700 ו-series 56 ביחס של אחד לאחד מביא לצמיגות המתאימה לעבודה עם עוברים של Drosophila. ניתן לאסוף עוברים מלוחיות אגר של מיץ ענבים באמצעות פינצטה עדינה או מכחול דק מאוד.
עוברים נדבקים זה לזה ולקצות הפינצטה. הם נאספים בקלות לקבוצות, גושים של עוברים, הנצמדים לפינצטה.
מורידים בעדינות את הטיפים על פני השטח הדביקים של הסרט על גבי למסקי הקישוט שהוכן מראש. תוך כדי צפייה בעוברים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, דחפו אותם בעדינות או החליקו אותם בעזרת צד הפינצטה. יש לפרוץ את ה-corone מבלי לקרוע את קרומי ה-vilin הפנימיים.
שלב זה דורש יד יציבה, סבלנות ומספר תרגולים. לאחר שהכתר החיצוני נפרץ, העובר לאחר הסרת הכלור נוטה להיצמד לפינצטה. יש להיזהר שלא לאפשר לעובר לאחר הסרת הכלור לבוא במגע עם פני השטח הדביקים של הסרט.
ייתכן שיהיה קשה מאוד לשלוף אותם מהסרט במהירות. העבירו את העוברים שחוטבתו הוסרה להילה. טפטפו טיפות שמן פחמון על לוכית כיסוי. מומלץ להחזיק זאת בקרבת מקום. הגבישו את קצה הפינצטה לפני השטח של טיפת שמן הפחמון בהילה.
ניתן לאשר כי העובר השתחרר מהפינצטה אל תוך העברת השמן בעין בלבד, באמצעות רקע שחור ומקור תאורה סיב אופטי המוגדר בזווית אלכסונית, לפני העברת העובר הבא. מומלץ לנגב את השמן מהפינצטה בשל ציפה שלן בשמן ההלו-פחמני. העוברים המקובצים צפים על פני טיפת השמן.
ניתן לשלוט במיקום ובכיוון של העובריים על ידי דחיפתם לתחתית טיפת השמן והפיכה מהירה של כיסוי הזריקה (cover slip) בפרוטוקול הטיפה התלויה. אנו הופכים את כיסוי הזריקה מעל הבאר הלחה של תא הדימות החי. כאשר כיסוי הזריקה הפוך, העובריים ינוחו על צדו התחתון של כיסוי הזריקה.
ניתן לבדוק את תנוחת המנוחה של העוברים תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופ. אם התוצאה אינה מספקת, ניתן לחזור על הפרוצדורה. ברגע שהעוברים נמצאים בתנוחה הרצויה, מקבעים את כיסוי הזכוכית לתא הדימיון החי באמצעות סרט דביק.
התא מאוורר על ידי חיתוך חורים בסרט. העוברים מוכנים כעת לצילום.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה פשוטה ויעילה להכנת עוברים של Drosophila לצורך ניתוח בדימיון חי (live-imaging). הפרוטוקול מבטיח לחות תקינה והחלפת גזים תוך מניעת דחיסה של העוברים, ובכך הוא הופך למתאים לדימיון מבוסס GFP.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- טכניקות דימוי
רקע
- ניתוח דימוי חי של עוברים של Drosophila מבוצע בדרך כלל באמצעות רכישת תמונות בשיטת time-lapse.
- עוברים רגישים להתייבשות ולהיפוקסיה במהלך מפגשי דימוי ממושכים.
- טכניקה המונעת דחיסה של העוברים חיונית להשגת דימוי מדויק.
- דימוי מבוסס GFP דורש תנאים ספציפיים לקבלת תוצאות אופטימליות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה המגנה על עוברים של Drosophila מפני התייבשות.
- הבטחת חילוף גזים הולם במהלך הדמיה.
- מניעת דחיסת עוברים במהלך הדמיה חיה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת עוברים של Drosophila לדימוי חי.
- יישום בקרת לחות במהלך מפגשי הדימוי.
- שימוש במיקרוסקופ סטריאואוסקופי או במיקרוסקופ קומפוזיט זקוף לדימוי.
- יישום טכניקות דימוי מבוססות GFP.
תוצאות עיקריות
- השיטה שומרת ביעילות על הלחות ועל חילוף הגזים עבור העוברים.
- העוברים נשארים ללא דחיסה, מה שמאפשר איכות דימוי טובה יותר.
- דימוי מבוסס GFP מניב תוצאות ברורות לאורך תקופות ממושכות.
- הטכניקה פשוטה וחסכונית עבור חוקרים.
מסקנות
- שיטה זו משפרת את איכות הדמיה חיה של עוברים של Drosophila.
- היא מספקת גישה מהימנה לחוקרים בתחום.
- ניתן לאמץ את הפרוטוקול בקלות בסביבות מעבדה מגוונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימות חי של אורגניזמי מודל הוא קריטי עבור תיקוף מטרות וסריקה פנוטיפית בשלבים מוקדמים של הגילוי. פרוטוקול הטיפה התלויה (hanging drop) נותן מענה למגבלות מרכזיות של התייבשות, היפוקסיה ודחיסה מכנית, הפוגעות בחיוניותו של העובר ובאיכות הנתונים במהלך דימות time-lapse ממושך. על ידי מתן אפשרות לדימות של עוברי Drosophila ללא דחיסה ובאופן רלוונטי פיזיולוגית, השיטה תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים של התערבויות גנטיות ופארמקולוגיות בפורמט בר-הרחבה ומשתלם כלכלית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של בקרה גנטית בתהליכים דינמיים כגון מורפוגנזה של רקמות והידבקות תאים, ללא ארטיפקטים מכניים הנובעים מדחיסה.
- ערך תפעולי: שומר על חיות העובר למשך למעלה מארבע שעות, דבר התומך בתצפית אורךית על תפקוד גנים ודינמיקה של מסלולים.
- ערך ניבוי: מפחית תוצאות חיוביות שגויות הנובעות מפנוטיפים מושרי עיכרים, ובכך משפר את הביטחון במבחני תיקוף של מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשחזור עבור דימות חי המבוסס על GFP, הממזערת שונות סביבתית.
- ערך תפעולי: עושה שימוש בחומרים זמינים בעלות נמוכה (שמן הלוקרבון, תא פוליקרבונט, סרט דביק) המתאימים להתאמה לעבודה בסריקה רחבה (high-throughput).
- מוכנות הבדיקה: מנצל את הציפה של העוברים בשמן כדי לשמור על יציבות מיקום, ובכך להפחית סחיפה ולשפר את עקביות האות ברכישת סרטי זמן (time-lapse).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תומך בדימות של תהליכי התפתחות שמורים הרלוונטיים למודלים של מחלות אנושיות, ובכך מקל על ביצוע אקסטרפולציה בין מינים שונים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר תצפית על התנהגויות תאיות (למשל, מוות תאי, היצמדות) בתנאים פיזיולוגיים, ובכך משפר את הביטחון החזוי עבור מודלים פרה-קליניים בהמשך.
- מערכת הרלוונטית למחלה: ניתן להשתמש בעוברי Drosophila המבטאים דגיש-GFP (GFP reporters) הקשורים למחלה כדי לנטר מודולציה של מסלולים in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פרוטוקול הטיפה התלויה (hanging drop) משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ובמיוחד עבור בדיקות הדורשות דימות דינמי ולא דחוס של רב-מרסמים (reporters) המקודדים גנטית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה ישירה של השפעות knockdown של גנים או ביטוי יתר על מורפוגנזה עוברית.
- סריקה: מספקת קריאות פלואורסצנציה כמותיות ובעלות רזולוציית זמן, החיוניות להשוואת השפעות של תרכובות או תנאים גנטיים.
- אנליטיקה: מייצרת נתוני timelapse יציבים ובאיכות גבוהה, המתאימים לאנליזה מורפומטרית ולכימות פנוטיפי.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין ממצאים גנטיים ב-Drosophila לנתיבים שמורים, ובכך מסייעת בבחירת מטרות עבור מודלים של חולייתנים.
- שימוש חוזר ארגוני: הפשטות והעלות הנמוכה של הפרוטוקול מאפשרות אימוץ רחב על ידי צוותים שונים כשיטה סטנדרטית להכנה של דימוי.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: משפר את הביטחון החזוי על ידי ביטול ארטיפקטים של דחיסה ושמירה על תנאים פיזיולוגיים במהלך הדמיה.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות בקרה סטנדרטית של לחות, חילופי גזים וטיפול בעובריים.
- ערך אסטרטגי: מפחית רעש ביולוגי בקמפיינים של סריקה, מה שמעלה את רגישות הבדיקה ומפחית את שיעורי הפגיעות השגויות (false hits).
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קבלת החלטות אמינה יותר של go/no-go באישור יעדים על ידי אספקת נתונים פנוטיפיים ברמת דיוק גבוהה יותר.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בעוברים של Drosophila ובטכניקות של הסרת המעטפת (dechorionation).
- תלוי בגישה לשמנים הלוקרבוניים (halocarbon oils) ולכלי מיקרו-ייצור בסיסיים להכנת התא.
- מחייב סטנדרטיזציה של גיל העוברים, הגנוטיפ ועקביות ההרכבה בין משתמשים שונים.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של ציוף השמן וגאומטריית התא.
- מגבלה מעשית: מתאים ביותר לעוברים שנותרים צפים בשמן הלוקרבון; אינו ישיים לסוגי תאים דחוסים יותר או בעלי תכונות היצמדות.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:15
Introduction
1:52
Step 1: Collect Embryos
2:24
Step 2: Prepare a Dechorionation Slide
2:51
Step 3: Prepare Imaging Chamber
3:32
Step 4: Place Halocarbon Oil on a Coverslip
4:05
Step 5: Picking Embryos From Plates
4:38
Step 6: Place Embryos onto Tape
5:01
Step 7: Roll Embryos to Remove the Chorion
6:15
Step 8: Transfer Embryos to Halocarbon Oil
6:47
Step 9: Push Embryos to Bottom of Oil
7:14
Step 10: Invert Coverslip on Live Imaging Chamber
7:38
Step 11: Secure Coverslip with Tape
