שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס
2 במרץ 2009
GFP-Fusion חלבונים נמצאים בשימוש נרחב כדי להמחיש האברונים ידי מיקרוסקופיה confocal. אולם, ההקרנה של מוטציות המשפיעות על המורפולוגיה של האברונים בדרך כלל דורש mutagenesis הפרט היא זמן רב. הנה, אנחנו מדגימים שיטה לשלב בו זמנית אברון-GFP סמנים כמעט 5,000 שאינם חיוניים גנים בשמרים.
ההליך מתחיל בהכנת מערך של CP one GFP, תחילה על ידי גידול של שורת תאים ולאחר מכן העברת המערך באמצעות סיכה (pin out) לצלחת חדשה. במקביל, הכין עותק טרי של DMA. בשלב הבא נבצע הזדווגות בין מערך ה-ACP one GFP ל-DMA ונבחר דיפלואידים, אשר יועברו לאחר מכן לספוירולציה במצע ספוירולציה.
חמישה ימים לאחר מכן, צאצאי ה-Myotic מונבטים על מצע LRK, שבו רק haplos מסוג MAT A יגדלו. באמצעות שני סבבי ברירה נוספים, אנו מבודדים תאים haplo הנושאים הן את ACP one GFP, והן גן שהושתק (knocked out) עבור can mycin. לבסוף, ניתן לבחור זנים בודדים ישירות מהצלחת ולבחון את מורפולוגיית המיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
שלום, אני Chap T ממעבדת Law מהמחלקה לביולוגיה של התא וההתפתחות במכון למדעי החיים של אוניברסיטת בריטיש קולומביה. שלום, אני Jesse Chao, גם אני ממעבדת Loan. היום נדגים לכם שיטה לתפוקה גבוהה להחדרת סמני GFP ברקעים מוטנטיים שונים בשמרים באמצעות מערכת רובוטית.
אנו משתמשים בנוהל זה במעבדתנו כדי לחקור את המורפולוגיה של אבנים כגון D, הרשת האנדופלזמית ומיטוכונדריה. אז בואו נתחיל. עבור פרוטוקול זה, אנו משתמשים בשני זני שמרים שונים.
CP one GFP הוא זן עם תיוג GFP בקצה ה-C של ACP one, אשר נוצר באמצעות רקומבינציה הומולוגית בתיווך PCR תוך שימוש בפלסמיד PKT 1 28. הרקע של הזן הוא BY 7 0 4 3. אנו משתמשים גם בזן DMA או במערך מוטנטים עם מחיקה (deletion mutant array), שהוא מערך של כ-5,000 מוטנטים עם מחיקה של גנים שאינם חיוניים.
כל הגנים הלא-חיוניים הללו הושבתו ב-G four 18. רקע הזן של המערך הוא BY 47 41. כדי להתחיל, גדלו מדשאי ACP one GFP על ידי מזיגת 5 mL של תרבית ACP one GFP מהלילה על פלטת hiss.
יש להניח לצלחת להתייבש מספיק באמצעות להבה או במכסה מ hút ביולוגי. לאחר הייבוש, יש לדגרי את הצלחת בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך לילה. לאחר הדגירה, השתמש ברובוט כדי לסדר את זן ה-A CP one GFP ל-1,536 מושבות לצלחת.
במקביל, הכין עותק טרי של ה-DMA באמצעות העברה בשיטת replica pinning לארבעה מצעי YPDG 18. לאחר מכן, דגור את המצעים בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך לילה עד לצמיחת הזנים. הכן את זן ה-GFP של A CP באמצעות העברה בשיטת replica pinning מה-DMA והעברה של המושבות למצעי YPD, ודגור את המצעים בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך לילה.
לאחר דגימה בשיטת replica plate, את המושבות תחת SD hiss G four 18 plates לצורך בחירת תאים שהוכנס להם ה-DNA, דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך לילה. כדי להתחיל בתהליכי ספורולציה ונבטות, בצעו תחילה replica plate של הדיפלואידים על צלחות YPDG four 18 כדי להגביר את יעילות הספורולציה בשלב הבא. לאחר דגימה בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך יום אחד, בצעו replica plate של הדיפלואידים על מצע ספורולציה משופר (enhanced Sporulation media), המכיל רמות מופחתות של מקורות פחמן וחנקן כדי להשרות יצירת נבגים ไมוטיים.
לאחר מכן, דגרו את הצלחות הפטריות בטמפרטורה של 25 °C למשך חמישה ימים לפחות. לאחר הדגירה, גרמינו את ה-mat, צאצא מיאוטי, על ידי זריעה של המושבות בשיטת replica plating על מצע LRK. מצע זה יגרום לנביטה של תאי tabloid מנבגים; דגרו את הצלחות הפטריות בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים כדי לבחור תאים הנושאים הן את אלל ה-GFP והן את אלל המוטציה הבודדת.
תאי Matt A נזרעים בשיטת replica plating על מצע lade G four 18, הבורר תאי haplo הנושאים את מחיקת הגן; דגרו את המצעים הללו בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך לילה. לאחר מכן, בצעו replica plating של צאצאים מיאוטיים של mat, a על מצע L-H-R-K-G four 18 כדי לבחור צמיחה של מוטנטים בודדים הנושאים גם את ACP one GFP; דגרו למשך לילה בטמפרטורה של 30 degrees Celsius.
ניתן לאחסן את הצלחות בטמפרטורה של 4 °C למשך עד שלושה חודשים. כדי להדמיאן את המוטנטים הרצויים המבטאים CP one GFP ישירות מהצלחת, התחילו בבידוד המושבות הרצויות מהצלחות. גדלו את התאים בטמפרטורה של 30 °C במצע YPD או SD hiss עד לשלב הלוגאריתמי המוקדם.
לבסוף, בצעו הדמיה של המוטנטים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית עם סט מסנני GFP; בתמונה קונפוקלית זו, בוצעו הדמיה של מוטנט ושל זן בר עם סמן ACP one GFP באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לחקור את מורפולוגיית המיטוכונדריה. מוטנט זה מראה פנוטיפ מיטוכונדריאלי משובש ולכן הוא מועמד טוב להמשך חקירה. הצגנו בפניכם כיצד לשלב ביעילות סמן מולטי-קלונאלי, ACP one GFP, במערך מוטנטים של מחיקה באמצעות מערכת רובוטית.
בעת ביצוע הליך זה, חשוב להכין את המצעים באופן טרי ולאפשר למקום זמן ייבוש מספיק. אם המצעים יהיו לחים מדי, תצטבר קונדנסציה שתגדיל את הסיכון לזיהום. כמו כן, יש לוודא שוב שכל מצעי הברירה הוכנו כהלכה, שכן הם קריטיים לפרוטוקול זה.
ניתן להשתמש בפרוצדורה זו גם עבור סוגים אחרים של סמנים. לדוגמה, כדי להדגים את ה-er, אנו משתמשים באופן שגרתי בסמנים air 11 ו-GSP. זהו התהליך.
תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה להחדרת סמני GFP של אבוןים לכמעט 5,000 גנים שאינם חיוניים בשמרים, ובכך מייעל את התהליך של ויזואליזציה של מורפולוגיית האבוןים. באמצעות גישה זו, חוקרים יכולים לסרוק ביעילות מוטציות המשפיעות על מבנה האבוןים.
מרכיבי המחקר המרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- גנטיקה
רקע
- חלבונים המחוברים ל-GFP הם כלים חיוניים להדמיה של מבנים תאיים.
- שיטות מסורתיות לסריקת מוטציות הן עתירות עבודה.
- שמרים משמשים כאורגניזם מודל למחקרים גנטיים.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת הדמיה מפורטת של אברונים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לשילוב בו-זמני של סממני אבנים.
- הקלה על סריקת מוטציות המשפיעות על מורפולוגיית האבנים.
- שיפור היעילות של מחקרים גנטיים בשמרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של מערך CP one GFP מתאים של תאים שהוצמחו.
- השבעה של מערך ה-GFP עם DMA לבחירת דיפלואידים.
- ספורולציה של דיפלואידים על מצעים ספציפיים.
- תצפית על מורפולוגיה מיטוכונדריאלית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
תוצאות עיקריות
- הטמעה מוצלחת של סמני organelle-GFP לתוך גנים של שמרים.
- השגה יעילה של תאים הפלואידיים עם שינויים גנטיים רצויים.
- הדמיה של מורפולוגיית האברונים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- תהליך יעיל לסריקת מוטציות גנטיות.
מסקנות
- השיטה מקצרת באופן משמעותי את הזמן הנדרש לסריקה גנטית.
- היא מספקת מסגרת חסונה לחקר תפקוד אברונים.
- ניתן ליישם גישה זו במגוון מחקרים גנטיים בשמרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
שיטה זו לבדיקה בשעתק גבוה של מורפולוגיית אבניי השמרים מאפשרת בחינה שיטתית של תפקוד גנים בביוגנזה של אבניי, ובכך תומכת בתיקוף מטרות בשלבי גילוי מוקדמים. באמצעות שילוב של טיפול רובוטי במערכים עם ברירה של סמנים כפולים, היא מספקת נתונים פנוטיפיים ניתנים לשחזור ובקנה מידה רחב, לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים של פגיעות גנטיות. גישה זו מאיצה את מיפוי המסלולים ואת תעדוף המטרות המשפיעות על תפקוד המיטוכונדריה או הרשת האנדופלזמית (ER) בתוכניות פרה-קליניות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר הערכה של מחיקות גנים ברחבי הגנום על מורפולוגיה מיטוכונדריאלית כדי לתקף מטרות המעורבות בירושת אבנים המבנה של האבניקים.
- ערך תפעולי: משתמש בניצוב רובוטי כדי לעבד 4,672 מוטנטים ביעילות, מה שמפחית את העבודה הידנית ומגביר את התפוקה.
- ערך ניבוי: מזהה משנים גנטיים של מבנה האבניקים כדי להפחית סיכונים במטרות בשלבים מוקדמים של תהליך הגילוי.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות של מורפולוגיית אברונים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: מייצר זני מחיקה הומוזיגוטים עם סמני GFP משולבים, המבטיחים ביטוי עקבי של הגורם המדווח לאורך כל המערך.
- מוכנות לבדיקה: מספק מוטנטים הפלואידיים מסודרים במערך, המוכנים לסריקת תרכובות או למיפוי אינטראקציות גנטיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשר פנוטיפים של אבייני תאים בשמרים למסלולים שמורים הרלוונטיים למודלים של מחלות אנוש.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מבהיר את תפקוד הגנים בביוגנזה של אבייני תאים כדי לתמוך בבחירת מטרות לצורך תיקוף פרה-קליני.
- בירור מסלולים: ממפה רשתות גנטיות השולטות בדינמיקה מיטוכונדריאלית כדי להנחות סריקת תרכובות מבוססת מנגנון.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
השיטה משתלבת בשלב שבין הגילוי המוקדם לזיהוי המטרה, בכך שהיא מספקת נתונים על מורפולוגיית האורגניאלים, המאפשרים להעריך את מידת הביטחון במטרה ואת הרלוונטיות של המסלול לפני סריקת תרכובות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי תפקוד גנים ביצירת אברונים באמצעות פרופיל מורפולוגי שיטתי.
- סריקה: מאפשר דימוי אברונים הניתן לשחזור ומבוסס מערכים, לצורך סריקה בעלת תוכן גבוה של הפרעות גנטיות או כימיות.
- אנליטיקה: מספק תוצרי קריאה פנוטיפיים מבוססי דימוי המאפשרים השוואה בין תנאי מוטציה לבקרים מסוג wild-type.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פגמים באברונים של שמרים לתהליכים תאיים שמורים בעלי רלוונטיות פוטנציאלית למודלים פרה-קליניים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לסריקה פנוטיפית של אברונים באמצעות מספר סמנים מתויגים ב-GFP.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי קישור בין גנוטיפ לפנוטיפ של אבניי המבנה התאי (organelles) בקנה מידה רחב.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות טיפול רובוטי סטנדרטי ותזרימי עבודה של ברירה כפולה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להערכה מקבילה של אלפי רקעים גנטיים.
- השפעה על הפורטפוליו: מקל על תעדוף מטרות מותאם סיכון בהתבסס על פנוטיפים של מורפולוגיית אבניי המבנה התאי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בגנטיקה של שמרים, הזיווג, ספורולציה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- תלוי במערכות פינינג (pinning) רובוטיות ובסביבות דגירה מבוקרות לטיפול במערכים.
- מחייב הכנה סטנדרטית של מצעים ופרוטוקולי ברירה למניעת זיהומים ולהבטחת התאוששות של מוטנטים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה לסממנים שונים של אברונים (למשל, ER לעומת מיטוכונדריה).
- מוגבל לרקעים של גנים שאינם חיוניים; גנים חיוניים דורשים גישות חלופיות כגון אללים מותנים או CRISPRi.
