דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

פרוצדורה זו מאפשרת לקבוע דפוסי ביטוי גנים בעוברים של דגי זבברה ברזולוציה גבוהה, כאשר גשש ribo antisense עובר היברידיזציה ל-mRNA המטרה המשלימה. גשש ה-Ribo המסומן מזוהה על ידי נוגדן המצומד לאנזים פראוקסידאז; fluoro four מצומד לארמיד מתווסף לעוברים, והפראוקסידאז ממיר את ה-IDE לתרכובת ריאקטיבית ביותר. תהליך זה מוביל לשיקוע יציב של ה-fluoro four, בעוד ש-IDE שאינו קשור נשטף, ובכך נחשף הדפוס התת-תאי המפורט של התפלגות ה-mRNA.

ניתן להבחין בביטוי של גן שני באמצעות גשושית מסומנת באופן מובחן וצבע פלואורי שונה, מה שמאפשר השוואה מפורטת של הביטוי. שלום, אני Tim Brent מהמעבדה של Scott Holly במחלקה לביולוגיה מולקולרית, תאית והתפתחותית באוניברסיטת Yale. היום נראה לכם פרוטוקול לביצוע היברידיזציה בסיטואו (in situ) פלואורסצנטית כפולה ברזולוציה גבוהה של עוברים של zebrafish בשיטת whole mount.

אנו משתמשים בנוהל זה כדי לחקור את הסגמנטציה בדגי zebrafish. לכן, בואו נתחיל. התחילו את הנוהל עם עוברים שקובעו למשך לילה בקור ב-paraformaldehyde.

שימוש במלאי של paraform aldehyde שהופשר זה עתה עבור קיבוע זה הוא קריטי להצלחת הצביעה. הסיר את תמיסת הקיבוע ושטוף את העוברים בטמפרטורת החדר פעמיים למשך חמש דקות בכל פעם ב-PBS. לאחר מכן, הסר את הכוריון של העוברים.

העוברים מונחים בלוחות שקע מזכוכית. באמצעות פינצטה עדינה, הסר מעתה ואילך את ה-Corian. השתמש בפיפטת פסטור מזכוכית שעברה פוליש באש כדי להעביר את העוברים.

אחרת, העוברים יידבקו לקצות הפוליפרופילן הרגילים. העוברים שעברו דכלורינציה מועברים דרך סדרה של שטיפות בריכוזי methanol עולים. השטיפה האחרונה היא ב-100% methanol.

לבסוף, העוברים מועברים למתנול טרי ונשמרים בטמפרטורה של 20- מעלות למשך הלילה. למחרת, העבירו את העוברים דרך סדרה של שטיפות בריכוזי מתנול יורדים, ולאחר מכן בשתי שטיפות של חמיש דקות בבופר PBST. לאחר מכן, קבעו את העוברים ב-para formaldehyde למשך 20 דקות.

סיימו את הקיבוע הקצר בשני שטיפות PBST של חמש דקות כל אחת. כעת אנו מוכנים לביצוע פרמיליזציה לעוברים. העוברים המקובעים הופכים לחדירים על ידי דגירה עם protein ACE K. ודאו שמיקרו-צנור הצנטריפוגה מונח על צדו.

משך שלב העיכול תלוי בגיל העובר. לדוגמה, עוברים בשלב somato agenesis מדגרים למשך שלוש עד ארבע דקות. שטפו קצרה ב-PBST ושטפו פעם אחת ב-PBST למשך חמש דקות.

קבעו את העוברים ב-paraformaldehyde. לבסוף, שטפו את העוברים פעמיים ב-PBST למשך חמש דקות. העוברים מוכנים כעת להיברידיזציה עם הגששים של ה-RNA.

כעת, לאחר שקיבענו את העוברים והפכנו אותם לחדירים, נתחיל בתהליך ההיברידיזציה באמצעות דגירה של חמש דקות ב-HI minus בטמפרטורה של 65 °C. זכרו לחמם מראש את תמיסת ה-HIIN לפני השימוש. לאחר מכן, דגרו את העוברים ב-HI plus למשך שעה אחת.

שוב, זכרו לחמם מראש את תמיסת ה-high plus. כעת הסירו את רוב תמיסת ה-hip plus, אך השאירו 50 µL, תוך וידוא שהעובריים טבולים לחלוטין. הוסיפו 1 µL מכל גשש (probe) וערבבו על ידי נקישה עדינה של המבחנה.

מעתה ואילך, כסו את המבחנות בנייר אלומיניום. מאחר והפלואורסצאין רגיש לאור, והדגירה נמשכת לילה שלם ב-65 °C, תהליך ההיברידיזציה הושלם. כעת נסיר את עודפי הגששים.

יש להסיר את הדטרגנט כדי לשפר את הצביעה. עם זאת, שימו לב כי העוברים הופכים לדביקים בהיעדרו של הדטרגנט. שטפו פעמיים בתמיסת 50% form amide two XSSC למשך 30 דקות בכל פעם.

שטפו פעם אחת ובשני פתרונות XSSC למשך 15 דקות. לבסוף, שטפו פעמיים ב-0.2 פעמים SSC למשך 30 דקות בכל פעם. לאחר מכן, נבצע ויזואליזציה של כל גשושית.

כעת ניתן להתחיל בגילוי הגששים שעברו היברידיזציה. גלה תחילה את גשש הפלואורסצאין כיוון שהוא פחות יציב וחלש יותר מגשש ה-dig oxygen. ראשית, בצע חסימה עם 500 microliters של 2% blocking reagent בבפר maleic acid למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

בשלב הבא, הוסיפו נוגדן anti-fluorescein מצומד ל-peroxidase בדילול של 1:500 בתוך תמיסת החסימה. דגרו למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C. ודאו כי מבחנת המיקרו-צנטריפוגה מונחת על צדה.

בשלב הבא, התחל את הגילוי באמצעות מערכת הגברת האות tyrom או TSA TYROM IDE המצומדת לفلואורופור. ה-horse radish peroxidase שעל הנוגדן ממירה את ה-TY IDE למתווך בעל תגובתיות גבוהה. ה-TY IDE התגובתי יוצר קשר קוולנטי לשאריות הנמצאות בסמיכות לנוגדן, מה שמוביל לשיקוע מקומי של הפלואורופור.

התחילו בארבעה שלבי שטיפה של 20 דקות עם בופר חומצה מאליאית (maleic acid buffer) בריכוז 1x בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטפו פעמיים ב-PBS. ה-fluorescein TY IDE הומס מראש ב-DMSO לצורך אחסון. סובבו את סובסטרט ה-TSA זה בנפנוף קצר (spin down) כדי לרכז את הנוזל.

בשלב הבא, דללו את מצע ה-TSA ביחס של 1 ל-50 בבופר דליל להגברה. הוסיפו את התמיסה לעובריים והדגירו למשך 45 דקות. הניחו את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה על צדה.

במהלך שלב דגירה זה, העבירו את העוברים דרך סדרה של שטיפות במשך 10 דקות בריכוזי methanol עולים. השטיפה האחרונה היא למשך 10 דקות ב-100% Methanol; לאחר מכן דגרו למשך 30 דקות בתמיסה של 1% hydrogen peroxide כדי לנטרל את ה-peroxidase שעל הנוגדן. אחרת, הדבר עלול להפריע לגילוי ה-dig oxygen.

העבירו את העוברים באמצעות פרובה דרך סדרה של שטיפות בריכוזי methanol פוחתים, ובשתי שטיפות של 10 דקות בבופר PBS. פעולה זו מבטיחה את הסרתו המלאה של ה-methanol. סימון הנוגדנים של ה-dig xigen והפרובה מתחיל בשלב חסימה (blocking), בדומה לנוגדן הקודם.

בשלב הבא, יש להוסיף נוגדן anti-digoxigenin בדילול של 1:1000. הנח את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה על צדה והדגר אותה במקרר למשך הלילה. למחרת, שטוף את הדגימה בטמפר חומצה מאליית בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, בעזרת PBS quickpin, יש להעביר את מצע ה-SCI five tyrom. יש לדללו ביחס של 1:50 ולהוסיפו לעוברים. יש להדגיר למשך 45 דקות כאשר המבחנה מונחת על צדה.

לבסוף, שטפו שלוש פעמים ב-PBST. שלב צביעה סופי עם prop iodide מסמן את הגרעינים. התחילו בשתי שטיפות של חמש דקות ב-two XSSC.

בשלב הבא, טפל ב-RNAs למשך 30 דקות ב-37 °C. שטוף שש פעמים ב-two XSSC בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הוסף את תמיסת ה-propidium iodide וצבע למשך שמונה דקות. שטוף שש פעמים ב-two XSSC.

קבע את העוברים ב-para formaldehyde למשך 20 דקות. ולבסוף, בצע שתי שטיפות של חמש דקות ב-PBST. תהליך הרכבת העוברים לצפייה מתחיל בשתי דגירות של 10 דקות ב-25% ו-50% glycerol.

בשלב הבא, העבירו את הדגימות ל-75% glycerol והדגירו אותן למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. שלב ההבהרה הלילי זה מקל על דיסקציית העובריים. לבסוף, בצעו דיסקציה והסירו את החלמון מהעובריים.

על מנת להפחית את הפלואורסצנציית הרקע, בצעו קיבוע שטוח (flat mount) של העוברים על זכוכית למסמך ובחנו אותם תחת המיקרוסקופ. תמונות אלו מציגות חתך קונפוקאלי בודד דרך הקצה האחורי של עובר דג זברה בשלב של 10 סומייטים. הצביעה האדומה מראה mRNA של delta C שזוהה באמצעות גשש המסומן ב-dig oxygen ובריאגנט TSA sci-fi.

הצביעה הירוקה מייצגת את ה-mRNA שלה שזוהה באמצעות גשש המסומן ב-fluorescein. וריאגנט TSA fluorescein; גרעינים שנצבעו ב-propidium iodide נצבעים בכחול בעוברי דגימה עם צביעה כפולה.

ניתן לקבוע באופן חד-משמעי אזורים של ביטוי נפרד או חופף. הליך זה חושף את הלוקליזציה התת-תאית של mRNA, כפי שניתן לראות בתצוגות תקריב אלו של צביעת HER1. שעתוק פעיל של הגן נחשף על ידי נקודות צביעה בגרעין.

תאים אחרים מראים לוקליזציה ציטופלזמית של ה-mRNA. בעובר שעבר צביעה כפולה, ניתן לראות תאים המבצעים תעתוק של שני הגנים או של אחד מהם.

בנפרד, הראינו כיצד לבצע היברידיזציה במקום (in situ hybridization) פלורסצנטית כפולה ברזולוציה גבוהה של עוברים של דגי זברה בשיטת whole mount. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי תחילה אנו בוחנים את הגששים שלנו באמצעות גששי צביעה סטנדרטיים המתווכים על ידי פוספטאזה עירונית; גששים שנותנים אות נקי וחזק יעבדו היטב בשיטת in situ פלורסצנטית.

השתמשנו בהצלחה גם במיקום אימונו-היסטוכימי של beta catenin במקום בצביעה ב-propidium iodide. כאשר אנו מבצעים וריאציה זו, אנו עורכים את תגובות ההיברידיזציה ב-55 °C במקום ב-65 °C. וזהו.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.