Name: בנקאות המוח: הפיכת רוב דוגמאות המחקר שלך (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-24T16:02:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: למד כיצד לבצע דגימה שיטתית של רקמת מוח להכנת חתכים בקריוסטט ושימור בבנק מוחות. שיטה זו מבטיחה ניתוח סטריאולוגי ללא הטיה ושימור אנטיגנים לחקר עתידי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מבקשים להודות Ikiel Ptito לקבלת תמיכה טכנית המשיכה שלו.

חלק 1: טרום עיבוד של רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות צריך להיות perfused היטב עם paraformaldehyde, glutaraldehyde, או פורמלין. זו יכולה להיות מושגת באמצעות זלוף transcardial הסטנדרטית המשמשת בדרך כלל כדי לקצור איברים אחרים. במחקר הנוכחי הנושא היה מורדמת עם קטמין הידרוכלוריד (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג, IM), מורדמים עם ממנת יתר של pentobarbital נתרן (25 מ&quot;ג / ק&quot;ג, ד) ו perfused transcardially עם 0.1 מ PBS עד exsanguinated לחלוטין. זה ואחריו פתרון paraformaldehyde 4% PBS דקות 5 (~ 1 ליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוח צריך להיות חסום stereotaxically, להסיר הגולגולת, שקל, ונפח נחוש 2. רקמה אמור להיות cryoprotected בפתרונות סוכרוז מדורגים עם ריכוז סופי של סוכרוז 30% חיץ פוספט. גושי רקמה אמור להיות קפוא isopentane ב -65 ° C ו המאוחסן ב -80 ° C עד שאתה מוכן לחתוך. </li></ol> חלק 2: דגימה שיטתית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימה שיטתית מסתמך על תוכנית ראויה לפני חתך. האזור כולו של עניין הן את גודל מקורי, הזנב ואת הגב, הגחון צריך להיות מוגדר היטב. אטלס stereotaxic של המין בשימוש עוזר להגדיר את האזור של הריבית כדי לקבוע את אורך האזור של עניין. לאחר אורך האזור של עניין נקבע יש צורך להקים את מרווח הדגימה. לדוגמה, מאטלס stereotaxic לך לקבוע כי היקף כולו rostro-הזנב של האזור של עניין הוא כ 3 מ&quot;מ אורך, כאשר חתך במישור העטרה. לאחר מכן אתה מחליט להגדיר את cryostat סעיף ב 50μm, בקצב הזה יהיה לך 60 סעיפים המכסים את היקף מקורי, הזנב של האזור של עניין. לצורך המחקר טיפוסי stereological משוחדת 6-10 חלקים שנדגמו באופן שיטתי נדרשים לקבל תוצאות אמינות. בדוגמה זו 10 סעיפים ברווחים שווים לאורך כל תוצאה rostro-הזנב היקף במרווח דגימה של 1 / 6 חלקים. </li></ol> חלק 3: יצירה של הבנק המוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תדר הדגימה סעיף נקבע, הצעד הבא הוא לקבוע איזה כתמים יבוצע מיד. לדוגמה, אם אתה מכתים עם סגול cresyl תוכלו לתפוס 1 / 6 חלקים בשקופית. זו תהיה סדרה 1. אם אתה יודע אולי יש נוגדנים פוטנציאל כמה שאתה רוצה לרוץ, אבל גם רוצה לראות את הנתונים מספק כתם הראשי שלך או פשוט אין לך את הזמן כדי לבצע את אימונוהיסטוכימיה, במקום סדרה הנותרים 5 סעיפים כדי שהם היו פרוסים לשמר אנטיגן בארות המכיל (1 פוליוויניל% pyrrolidone, אתילן גליקול 50% o.1M PBS, Ph 7.4). הטבלה שלהלן מספקת תוכנית דגימה המורכב שקופית 1 ו 1 צלחת (צלחת 48-היטב רגיל) סעיפים כחלק הבנק מוח (טבלה 1). <img src="/files/ftp_upload/1260/table1.jpg" alt="טבלה 1" /> טבלה 1. הדגימה סעיף תדר כאן הוא 1 / 6. בסעיף הראשון מושם על שקופית עבור מכתים סגול cresyl ולמחרת 5 סעיפים ממוקמות לתוך אנטיגן לשמר. מספר סעיף 7 הוא נתפס אז בשקופית וחתכים 9-12 ממוקמים אנטיגן לשמר. מחזור זה חוזר על עצמו עד לאזור של עניין או בלוק של רקמות מחולק ממצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב הבא הוא סעיף ממצה את גוש של רקמה. מניחים כמות קטנה של הטבעה בינוני על צ&#39;אק ולתת לו להקפיא. מניחים את צ&#39;אק לתוך הראש microtome ו לגלח מספיק של המדיום קפוא יש משטח שטוח. הסר את צ&#39;אק מהראש microtome מקום שטוח בתוך cryostat. יוצקים הטבעה בינוני על צ&#39;אק ועל בתוקף במקום לחסום את המוח עם הצד החתוך stereotaxically ממוצבת ביובש על צ&#39;אק. לאט לחלוטין להטביע את המוח הרכבה בינונית. מניחים את צ&#39;אק עם המוח לתוך הראש microtome וסעיף באמצעות פרמטרים שנקבעו מראש עבור תדר הדגימה סעיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בלוק של רקמות כבר מחולק ממצה וחתכים ממוקמות לתוך בארות, מכסים את הצלחת עם מכסה, עוטפים את המכסה עם parafilm, ומכניסים למקפיא -20 מעלות צלזיוס. התחבר המספר הכולל של החלקים שצולמו עבור כל סדרה, רווח בסעיף הדגימה, ומספר הסדרה עבור כל חיה. יומן זה יהיה חיוני כדי לעקוב אחר הסרת הבאות של חלקים מהבנק המוח אימונוהיסטוכימיה בעתיד. </li></ol> חלק 4: תוצאות נציג: דגימה שיטתית באופן זה כבר מקובל במעבדה שלנו במשך 3 השנים האחרונות. היו לנו הרבה הצלחה בביצוע אימונוהיסטוכימיה על החומר אוחסן ב אנטיגן לשמר שלוש שנים אחרי זה היה פרוס ללא הידרדרות של האות (איור 1). יתר על כן, כחלק הבנק המוח שלנו יש לנו מחובר קרוב ל 20,000 חלקים שיטתית של הלא אנושיהמוח הפרימטים (איור 2) במסגרת תוכניות לטווח ארוך המחקר שלנו. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260figure1.jpg" alt="" /> באיור 1. זהו קטע מן המוט העורפית של פרימטים לא אנושיים immunostained עבור NeuN מראה הן שכבה VI ו ביניים נוירונים החומר הלבן. סעיף זה בפרט אוחסן אנטיגן לשמור על -20 מעלות צלזיוס למשך תקופה של 2 שנים. בר סולם = 100μm. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260fig2.jpg" alt="figure2" /> איור 2. Vervet הבנק המוח שלנו מורכב כיום קרוב ל 20,000 חלקים שיטתית מ 30 קופים.

<ol><li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.+Aat+Rec%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec.</a> 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+Non-human+Primate+Brain+in+Stereotaxic+Space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

דגימה שיטתית היא שיטה זולה שנועדה למקסם את חומר מחקרי. אסטרטגיה זו הדגימה נועדה לציית לכללי stereology משוחדת הדורש דגימה שיטתי ברחבי האזור. זה קריטי, כי את סדר הסעיפים עבור כל סידרת נשמר. במעבדה שלנו השתמשנו בהצלחה בשיטה זו עבור הבנקאות הן אוגר והלא אנושי חלקים במוח הפרימטים. עד כה אספנו חלקים במוח קרוב ל 20,000 קוף vervet (Chlorocebus aethiops sabeus) ובאופן שגרתי לבצע immunohistochemisty על סעיפים שאוחסנו במשך למעלה משנה. היתרונות של הבנק היטב המאופיינת במוח כוללים את ...

<table><tbody><tr><td>אתילן גליקול (Ethylene glycol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>E178-4</td><td></td></tr><tr><td>פוליביניל פירולידון (Polyvinyl pyrrolidone)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-500</td><td></td></tr><tr><td>תווך שיכון תרמי (Thermal Scientific Embedding Medium)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בנקאות המוח: הפיכת רוב דוגמאות המחקר שלך

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Stereology משוחדת היא שיטה מדויקת ויעילה לאמוד את מספר נוירון הכולל (או סוג תא אחר) באזור מסוים של עניין<sup&gt; 1</sup&gt;. כדי להשיג מטרה זו בסעיפים 60-10 שיטתי צריך להיות נחקר מכסה את המבנה כולו. בדרך כלל זה כרוך עיבוד 1 / 5 חלקים אשר משאיר כמות משמעותית של חומר לא מעובד. על מנת למקסם את החומר, אנו מציעים שיטה זולה לשימור רקמות קבוע במסגרת תוכנית ארוכת טווח מחקר אחסון. כאשר הרקמה פרוס ומעובד הרצוי, קטעי כתם או נוגדן חלופי צריך להיות ממוקם באופן שיטתי אנטיגן לשמור על -20 ° C עבור עיבוד עתידי. שימוש של 24 צלחות היטב, קטעי ניתן להציב על מנת בעתיד אחזור. באמצעות שיטה זו, רקמות יכול להיות מאוחסן ומעובד אימונוהיסטוכימיה במשך שנים.

בנקאות המוח דגימה שיטתית של חומר ביולוגי מספק את הבסיס stereology משוחדת למקסימום את פוטנציאל נתונים המתקבלים הדגימה כל אחד.

סטריאולוגיה בלתי מוטית היא שיטה להערכה מדויקת ויעילה של מספר הנוירונים הכולל (או סוג תא אחר) באזור עניין נתון1. כדי...

כדי להתחיל בהליך זה, יש להכין את נתח המוח עבור הקריוסטט ולקבוע את תדירות דגימת החתכים. לאחר מכן, יש להכין את נוזל שימור האנטיגן ואת השקופיות. יש להניח את נתח המוח על הצ'אק (chuck) בתוך הקריוסטט.לאחר שהמוח הוטמע בצורה מאובטחת על חיתוך הצ'אק בעובי שנקבע מראש, יש לבצע חיתוכים סיסטמטיים כך שהסדרה הראשונה תונח על סלייד, וסדרות נוספות יונחו בבארים שמולאו מראש בחומר לשימור אנטיגנים. לאחר שכל גוש הרקמה נוצל, יש להניח את הפלטה במקפיא בטמפרטורה של 20- °C כחלק מבנק המוחות שלך. שלום, אני ד"ר Mark Burke מהמעבדה למדעי העצבים הוויזואליים בבית הספר לאופטומטריה של אוניברסיטת מונטריאול.שלום, אני ד"ר שאהין זור, גם אני ממעבדת מדעי העצבים החזותיים בבית הספר לאופטומטריה באוניברסיטת מונטריאול. שלום, אני ד"ר מו פטו, מנהל מעבדת מדעי העצבים החזותיים בבית הספר לאופטומטריה, אוניברסיטת מונטריאול. היום נראה לכם הליך למשמורת שיטתית של רקמת מוח ב-antigen preserve.אנו משתמשים בנוהל זה במעבדה שלנו כדי למקסם את חומרי המחקר וכבסיס לביצוע תיאור מורפולוגי בלתי מוטה. אז בואו נתחיל. פרוטוקול זה מתאר כיצד לדגום באופן שיטתי רקמת מוח שעברה קיבוע, חלוקה סטריאוטקטיקה לפרוסות בעובי של סנטימטר אחד והקפאה.כדי לראות את השלבים המוקדמים הללו בפירוט, עיינו במאמר ה-JoVE האחרון שלנו העוסק בניתוח מוח של פרימטים שאינם אדם במרחב סטריאוטק

brain-banking-making-the-most-of-your-research-specimens

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים מודל עכברים של הפרעת פוסט טראומטית (PTSD) החושפת את השינויים המתמשכים בתפקוד נוירואנדוקריניים ותגובה המאוחרת לטווח ארוך, המוגזמת פחד, אופייניים לחולי PTSD. מודל החיה ושיטות שתוארו כאן הם שימושיים עבור correlating סמנים ביולוגיים בגרעיני מוח, שהם מכאניים אך לא ניתן למדוד בחולים, עם סמנים ביולוגיים בתאי דם לבן בפריפריה, שיכול.

סמנים ביולוגיים במודל חיה לחשיפה קושרת עצבית, המטולוגית, והתנהגות של PTSD

הסרטון מדגים הליך שלב אחר שלב לניתוח סימטרי של מוח אנושי קבוע לאחר המוות, הכנת גושי רקמה קטנים יותר לניתוח נוסף.

חתך ביהמיספרי סימטרי של המוח האנושי לאחר המוות

פרוטוקול מיצוי חלבון נפוץ באמצעות מאגר האוריאה / thiourea / SDS לרקמת מוח אדם ועכברים מאפשר indentification של חלבונים על ידי 2D-DIGE והאפיון הבא שלהם על ידי immunoblotting 2DE המיני. שיטה זו מאפשרת לאדם להשיג תוצאות יותר לשחזור ואמינים מביופסיות אדם ומודלים ניסיוניים.

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

נהלי חיתוך מוח מאורגנים נחוצים כדי לתאם תופעות נוירופסיכיאטריות ספציפיות עם אבחנות neuropathologic מוחלטות. גזרי המוח מבוצעים בצורה שונה על בסיס למקרים Clinico-אקדמיים שונים. פרוטוקול זה מתאר הליך חיתוך המוח סימטרי bihemispheric לחקור הבדלים חצי מוח פתולוגיות מוח אנושיים וכדי למקסם / וביומולקולרית נוכחית ועתידיות טכניקות הדמייה.

סימטרי Bihemispheric לאחר מות מוח חיתוך לחקר בריא והגבלות מוח פתולוגיים בבני אדם

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הקפאה של סעיף רקמת מוח מחיות מרובים כחלופה ייעול עיבוד המוח יחיד. זה מפחית את השתנות מכתימים במהלך אימונוהיסטוכימיה, מפחית את הזמן cryosectioning והדמיה.

Cryosectioning בו זמנית של המוח מכרסמים מרובים

פרוטוקול זה מתאר שיטה למעקב אחר מסלולים בודדים של הזדקנות המוח באמצעות תוכנית תרומת מוח ואפיון נכון של המוח. תורמי מוח מעורבים במחקר אורכי ארוך טווח כולל הערכות רב מימדיות סדרתיות. הפרוטוקול מכיל תיאור מפורט של עיבוד המוח ומתודולוגיית אבחון מדויקת.

פרוטוקול בנק המוח Abbiategrasso לאיסוף, עיבוד ואפיון מוחות מזדקנים

הליך זה מתאר את אוסף אזורי המוח קפוא בנפרד כדי להשיג חלבון באיכות גבוהה ו-RNA באמצעות כלים זולים וזמינים בדרך כלל.

אוסף של אזורים קפואים המוח מכרסם עבור ניתוח במורד הזרם

ביובנקים הם משאבים חיוניים למחקר ביו-רפואי והיחידה לרפואה תרגומית ודיגיטלית במכון האירופי לאונקולוגיה היא מודל בתחום זה. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של נהלי ההפעלה הסטנדרטיים של ביו-בנקים לניהול סוגים שונים של דגימות ביולוגיות אנושיות.

ביובנק לרפואה תרגומית: נהלי הפעלה סטנדרטיים לניהול דגימות אופטימלי

פרוטוקול זה מתאר שיטה להקל על איסוף דגימות מדגימות כריתת ערמונית רדיקלית. המטרה היא למפות, לאפיין ולנתח במיקרו-מאקרו דגימות רקמה מהדגימות על סמך קריטריונים אנטומופתולוגיים לפני אחסונן בביובנק.

שיפור האמינות הביו-בנקאית של גידול הערמונית באמצעות טכניקת דגימה משופרת ואפיון היסטולוגי

מדעי המוח המודרניים צריכים לחקור הבדלים בין מינים רבים, כולל מכרסמים במעבדה ובני אדם. עם זאת, קשיים טכניים מתעוררים כאשר מעורבים יונקים בעלי מוח גדול. גישה זו מתייחסת לשונות בין-מינים באוכלוסיות נוירונים ביונקים שונים מאוד, ומניבה תוצאות דומות למיפוי לחשיפת דפוסי אבולוציה.

גישה השוואתית למחקרי ספירת תאים כמותיים במוחות יונקים שונים מאוד

למד כיצד לבצע דגימה שיטתית של רקמת מוח להכנת חתכים בקריוסטט ושימור בבנק מוחות. שיטה זו מבטיחה ניתוח סטריאולוגי ללא הטיה ושימור אנטיגנים לחקר עתידי.

בנקאות המוח: הפיכת רוב דוגמאות המחקר שלך

גלה סרטונים נוספים