Name: זיהוי של חלבון Ubiquitination (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: למדו לזהות אוביקוויטינציה של חלבונים בתאים מתורבתים ובמבחנה. שיטה זו מאפשרת חקר ליגאזות אוביקוויטין ומנגנוני מחלות קשורים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים RO1 DC006497, RO1 NS057289 ו PO1 ES016738 (עד ז&#39;ז&#39;אנג); קליפורניה המכון לרפואה הרגנרציה מענקים RS1-00331-1 ו-RL1 00682-1 (עד ז&#39;ז&#39;אנג); הפרקינסון האמריקאי מחלות האגודה (&#39;עד ת&#39;ג&#39;אנג צ&#39;ו י&quot;ש); ואת ג&#39;יי מייקל פוקס הקרן לחקר הפרקינסון (צ&#39;אנג).

גילוי ubiquitination חלבון בתאים בתרבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים בתרבית Transfect עם פלסמידים המבטאים את החלבון של עניין (epitope-tagged גרסה) יוביקוויטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את התא להשלים תמוגה חיץ (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM טריס-HCl, pH 8.0) עם orthovanadate 2mm נתרן, נתרן פלואוריד 50 מ&quot;מ, מעכבי פרוטאז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאים עם 100 חיץ תמוגה μl תא לכל צלחת (6 צלחת ס&quot;מ). אם מנה גדולה יותר משמש, לכוון את עצמת השמע בהתאם. מערבולת התבשיל בזהירות לתת החיץ תמוגה לכסות את כל השטח של תאים בוגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף התאים עם מגרד תא ולהעביר את lysates תא לתוך צינור Eppendorf 1.5 מ&quot;ל. מניחים את הצינור לצלחת חמה מיד לרתיחה 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שאר התאים עם מכשיר sonication. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 900ul של חיץ דילול (10 mM טריס-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, טריטון 1%). דגירה דגימות 4 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין דגימות מדולל ב XG 20,000 למשך 30 דקות. מעבירים את supernatant שנוצר צינור Eppendorf חדש. היזהר לא להפריע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ריכוז החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו חלבון או G-agarose חרוז מצומדות נוגדנים נגד חלבון המטרה במאגר תואם (50% slurry). חותכים את הקצה הצר של טיפ P-200 פיפטה ולהעביר 14-20 μl של שרף מיקרוגרם של 500-1,500 lysates תא מוכנים immunoprecipitation. עבור תאים עם נצילות גבוהה transfection, 500 מיקרוגרם יהיה מספיק. עבור תאים עם נצילות transfection נמוך, יותר חלבון עשוי להיות נחוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת lysate-חרוז התא ב 4 ° C לילה עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה חרוזים XG ב 5000 עבור 5 דקות. לשאוב supernatant. שטפו את שרף עם למאגר כביסה (10 mM טריס-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40) פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין החרוזים בפעם האחרונה ב XG 20,000 למשך 30 שניות. לשאוב החיץ כביסה שיורית ומרתיחים שרף עם חיץ טעינת SDS 2X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען דוגמאות על ג&#39;ל SDS עמודים עבור immunoblotting ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי היוביקוויטין לבין חלבון המטרה עם נוגדנים בהתאמה. עבור immunoblotting, אנחנו בדרך כלל לזהות היוביקוויטין הראשון. הממברנה מכן ניתן יהיה להשתמש כדי לזהות את זירז חלבון. </li></ol> זיהוי של חלבון המטרה ubiquitination על דרך ב assay ubiquitination חוץ גופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את החיץ ubiquitination 5X (100 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 7.5, 25 מ&quot;מ MgCl2, 2.5 מ&quot;מ DTT, 10 mM ATP). אחסן אותם aliquots קטן -20 ° C עד חודש 6. פרוטוקולים מסוימים גם להוסיף פוספט קריאטין קריאטין קינז לתוך למאגר עבור 1,2 התחדשות ATP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תגובה, להכין תערובת המכילה את הפעולות הבאות: <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Μl 8 </td><td> Ubiquitination 5X חיץ </td></tr><tr><td> 250 ng </td><td> ubiquitination E1 </td></tr><tr><td> 500 ng </td><td> ubiquitination E2 </td></tr><tr><td> 0.5 מיקרוגרם </td><td> היוביקוויטין </td></tr><tr><td> 0.5 מיקרוגרם </td><td> חלבון עניין </td></tr><tr><td></td><td> נפח המים הכולל 40 μl </td></tr></tbody></table> כמו שולטת, להכין תגובות דומות בהעדר או E1, E2, או יוביקוויטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה או יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את התגובה על ידי הוספת SDS-PAGE חיץ מדגם להרתיח את המדגם עבור 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען דוגמאות על ג&#39;ל SDS-PAGE עבור immunoblotting ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי היוביקוויטין לבין חלבון המטרה עם נוגדנים בהתאמה. </li></ol>

<ol><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1%2C+and+DJ-1+form+a+ubiquitin+E3+ligase+complex+promoting+unfolded+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation.</a> J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).</li>
<li>Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2-mediated+NEDD8+conjugation+of+p53+inhibits+its+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity.</a> Cell. 118, 83-97 (2004).</li>
<li>Didier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF5%2C+a+RING+finger+protein+that+regulates+cell+motility+by+targeting+paxillin+ubiquitination+and+altered+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization.</a> Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).</li>
<li>Laney, J. D., Hochsetrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+14.5+Analysis+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination.</a> Current Protocols in Protein Science. , 14.5.1-14.5.11 (2002).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

במצגת זו, אנו הראשון שתיאר צעדים המאפשרים לזהות שינוי יוביקוויטין על החלבון של עניין בתאי יונקים בתרבית. על מנת לזהות ubiquitination במיוחד על החלבון של עניין, לא על הלא קוולנטית חלבונים אינטראקציה, היינו מצב מחמירים עבור תמוגה התא, immunoprecipitation ושטיפת 1,3. Ubiquitination, זוהה על ידי immunoprecipitation של חלבון המטרה במצב כזה קשה ואחריו immunoblotting אנטי היוביקוויטין, ולכן הוא עשוי להיות ספציפיים לחלבון היעד. כדי למנוע deubiquitination חלבון במהלך הפרוצדורות,...

זיהוי של חלבון ubiquitination

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, את הקובץ המצורף קוולנטיים של היוביקוויטין פוליפפטיד למקד חלבונים, הוא שינוי posttranslational המפתח בוצע על ידי קבוצה של שלושה אנזימים. הם כוללים היוביקוויטין, הפעלת אנזים E1, E2 היוביקוויטין-conjugating האנזים, האנזים E3 יוביקוויטין. בניגוד ל E1 ו E2, E3 המצע ligases היוביקוויטין סגוליות לתצוגה. מצד שני, אנזימים deubiquitylating יש תפקידים רבים בעיבוד חלבונים polyubiquitinated. Ubiquitination יכול לגרום לשינוי של יציבות חלבון, לוקליזציה הסלולר, ופעילות ביולוגית. מוטציות של גנים המעורבים במסלול ubiquitination / deubiquitination או תפקוד מערכת היוביקוויטין שינו המשויכים רבים מחלות אנושיות שונות, כגון סוגים שונים של סרטן, ניוון מוחיים, והפרעות מטבוליות. הגילוי של ubiquitination שינה או נורמלי של חלבונים היעד עשויה לספק הבנה טובה יותר על בפתוגנזה של מחלות אלה. כאן אנו מתארים פרוטוקולים לזהות ubiquitination החלבון בתאים בתרבית<em&gt; In vivo</em&gt; ו מבחנות<em&gt; במבחנה</em&gt;. פרוטוקולים אלה שימושיים גם כדי לזהות שינויים אחרים היוביקוויטין כמו מולקולה קטנה כגון sumolyation ו neddylation.

Ubiquitination הוא שינוי posttranslational המפתח בוצע על ידי קבוצה של שלושה אנזימים. מוטציות של גנים המעורבים שינוי זה קשור הרבה מחלות אנושיות שונות. כאן אנו מתארים פרוטוקולים לזהות ubiquitination החלבון בתאים בתרבית<em&gt; In vivo</em&gt; ו מבחנות<em&gt; במבחנה</em&gt;.

זיהוי של חלבון Ubiquitination

יוביקיטינציה, היחבור הקוולנטי של הפוליפפטיד יוביקוויטין לחלבונים מטרה, היא מודיפיקציה פוסט-טרנסלציונית מרכזית המבוצעת על ידי מערכת של...

שלום, אני Chu מהמעבדה של Jo במכון ברמינגהאם למחקר רפואי. היום נדגים לכם פרוטוקול לזיהוי אגלומרציה של חלבונים. אנו משתמשים בשיטה זו במעבדתנו כדי לחקור את parkin או ligases של UBI3 ואת הסובסטרט שלהם.אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, בצעו טרנספקציה לתאים עם פלסמידים המבטאים הן את חלבון המטרה והן גרסה של ubiquitin עם תג epitope. תנו לתאים לגדול במשך כ-40 שעות, ולאחר מכן עברו לספסול המעבדה כדי לייסף את התאים, שאבו את מצע הנוזלים ושטפו את התאים פעמיים בעזרת PBS.בשלב הבא, יש לליית את התאים על ידי הוספת 100 µL של באפר לליזת תאים, המכיל 2% SDS, לכל צלחת בקוטר 6 cm. יש לסובב כל צלחת כך שהבאפר יכסה את התאים לחלוטין. לאחר מכן, השתמש במגרדת תאים כדי לאסוף את התאים המלויטים והעבר אותם לפרובית של 1.5 mL.הניחו מיד את המבחנה על בלוק חימום והרתיחו את התאים הליטיים למשך 10 דקות כדי לדנוטורציה נוספת ולהמסה של חלבונים. לאחר ההרתחה, השתמשו במכשיר סוניקציה כדי לגזוז את התאים ואת ה-DNA שלהם. שלב זה הופך את הליסאטים התאיים לפחות צמיגיים.לאחר הסוניקציה, הוסיפו 900 µL של בופר דילול והשאירו את הדגימות בסיבוב בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 עד 60 דקות. לאחר הדגירה, סבבו את הדגימות המדוללות בצנטריפוגה ב-20,000 Gs למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C כדי להפיק חלבונים מסיסים. לאחר מכן, תוך הקפדה לא להפריע למשקע, העביר

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מתאר שיטה לחלץ ולטהר פפטידים יוביקוויטיניל המכילים שאריות פפטידים די-גליצין מתערובת פפטידים מורכבת. השיטה המוצגת עשויה לסייע בזיהוי אתרי יוביקוויטינציה מקוריים בחלבון.

מיצוי מבוסס אימונוזיקה של פפטידים יוביקוויטינילטים: טכניקה לחילוץ סלקטיבי של פפטידים מתויגים של יוביקוויטין משברי פפטידים מטוהרים

הפרוטוקול הנוכחי מפרט שיטה למדידת הפעילות של אנזימים תפקודי הומולוגי deubiquitinating. בדיקות מיוחדות קוולנטית לשנות את האנזים ולאפשר לגילוי. שיטה זו מחזיקה את הפוטנציאל לזהות מטרות טיפוליות חדשות.

שיטה למדידת הפעילות של אנזימי Deubiquitinating בשורות תאים ודגימות רקמה

אנו מציגים שיטה לטיהור, איתור וזיהוי של פפטידים diGly שמקורם בחלבונים אוביקטיביים מדגימות ביולוגיות מורכבות. השיטה המוצגת מופצת, איתנה, ומבצעת שיטות שפורסמו ביחס לרמת העומק של האנליזה האוביקווינופית.

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

אוביקווינציה היא שינוי פוסט-טרנסלייתי המשחק תפקידים חשובים בתהליכים סלולריים והוא מתואם באופן הדוק על ידי דאובינציה. פגמים בשתי התופעות מתחת לפתווגיות אנושיות. אנו מספקים פרוטוקולים לביצוע התגובה אוביקווינציה ותגובת דאוביטיות באמצעות רכיבים מטוהרים.

בתחומי החוץ והאי של האבנים הנוזומטיות

פרוטוקול זה מטרתו להקים אוביקוויב (וכדומה) ו אוביקוויב-אוהב (Ubls) הפרוטאמים ספציפיים כדי לזהות שינויים של סוג זה של שינויים לאחר העברה (לאחר ההעברה), הקשורים במצב ספציפי כגון טיפול או פנוטיפים.

יצירת פרופיל אוביקוויפין ואוביקוויב-שינויים עצמאיים וזיהוי של שינויים משמעותיים

שיטה זו מתארת הערכה של שינויים גלובליים בטופולוגיית שרשרת ubiquitin. ההערכה מבוצעת על ידי יישום של גישה פרוטאומית ממוקדת ספקטרומטריית מסה.

ניתוח שרשרת Ubiquitin על ידי ניטור תגובה מקבילה

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבדיקת יוביקוויטילציה של מצע מסוים ויוביקוויטין-ליגאז E3 בתאי יונקים. קווי תאים HEK293T שימשו לביטוי יתר של חלבונים, המצע הפוליוביקוויטילטיבי טוהר מליאסטים של תאים על ידי מיצוי חיסוני, ונפתר ב- SDS-PAGE. אימונובלוטינג שימש כדי לדמיין את השינוי הפוסט-תרגומי הזה.

הערכה של יוביקוויטילציה של מצע על ידי E3 יוביקוויטין-ליגאז בליסאטים של תאי יונקים

הפרוטוקול מתאר שיטה שלב אחר שלב לטיהור חלבונים הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים באמצעות חלבון מדכא הגידול p53 כדוגמה. חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום טוהרו מתאים בתנאים מחמירים של אי-דנטורציה ודנאטורציה.

טיהור של חלבוני p53 הנמצאים בכל מקום מתאי יונקים

הפרוטוקול הנוכחי מדגיש שיטה שונה לזיהוי וכימות של קישורי DNA-חלבון (DPC) והשינויים שלאחר התרגום שלהם (PTM), כולל יוביקוויטילציה, SUMOylation ו-ADP-ריבוסילציה המושרה על ידי מעכבי טופואיזומראז ועל ידי פורמלדהיד, ובכך מאפשר לחקור היווצרות ותיקון של DPCs וה-PTM שלהם.

זיהוי כמותי של הצלבות DNA-חלבון והשינויים שלאחר התרגום

הניסוי המשמש כאן מציג שיטה של עגינה מולקולרית בשילוב טכנולוגיות בדיקה כדי לחזות ולאמת את האינטראקציה בין מולקולות קטנות של הרפואה הסינית המסורתית לבין מטרות חלבון.

סינון תרכובות ברפואה הסינית המסורתית לעיכוב פעילות UCHL3 על בסיס עגינה מולקולרית וטכנולוגיית בדיקת אנזים דה-ביקוויטינציה

יוביקוויטינציה היא רגולטור קריטי של תפקודי החלבון התוך-תאי. כאן, אנו מתארים שתי שיטות ניתוק תאים לזיהוי רמות יוביקוויטינציה של חלבוני סובסטרט בתאי יונקים ומשווים את יעילותן בניתוח רמות יוביקוויטינציה. ביטוי יתר של חלבונים בתאים HEK293T הושר על ידי טרנספקציה חולפת, וחלבונים מאוביקוויטיניים זוהו בניתוח Western Blot.

אסטרטגיות השוואתיות לזיהוי יוביקוויטינציה בליזטים של תאי יונקים באמצעות SMAD2/SMURF2 כמודל

למדו לזהות אוביקוויטינציה של חלבונים בתאים מתורבתים ובמבחנה. שיטה זו מאפשרת חקר ליגאזות אוביקוויטין ומנגנוני מחלות קשורים.

זיהוי של חלבון Ubiquitination

גלה סרטונים נוספים