הכנת המוח עכברוש תרבויות מצטבר עבור Neuron ופיתוח מחקרים גליה
30 בספטמבר 2009
פרוטוקולים עבור מערכת עובריים במוח חולדה המצרפי תרבות מתואר. אבות multipotent ב אגרגטים יכול לפתח להתמיין נוירונים, האסטרוציטים ו oligodendrocytes.
אנו מציגים מערכת לגידול תאי פרוגניטורים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) תוך כדי התפתחותם והתמיינותם לנוירונים וגליאה בוגרים. הפרוצדורה מתחילה בבידוד ארבעה מוחות מעוברי חולדה ביום E 16 ועיכולם באמצעות פפאין. הרקמות הופכות לתליה של תאים בודדים, מסוננות, נספרות ומפוזרות לתוך שישייה.
תאי לוחות הבארים מורחפים בעדינות פעם אחת ביום למשך יומיים עד שלושה ימים כדי לאפשר היווצרות אגרגטים. לאחר מכן, האגרגטים נאספים ומסוננים דרך רשת של 200 micrometer, וגושים קטנים ושיירי תאים מוסרים על ידי שטיפה. לבסוף, סופרים את האגרגטים ומניחים אותם על כיסויי זכוכית (cover slips) מצופים ב-matrigel.
שלום, אני Coto מהמעבדה של Dr.John L במחלקה למדעי הביו-וטרינריים המשולבים באוניברסיטת Texas a and m. היום נראה לכם פרוצדורה לתרביות של אגרגטי מוח. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה ברמה 3 כדי לחקור שושלת אנדוציטים, התפתחות תאים ואינטראקציות מואצות.
בואו נתחיל. לפני שמתחילים, הכינו על משטח העבודה כלים סטריליים, אתנול 70%, פד ספיגה לעבודה וצלח Petri בקוטר 10 סנטימטרים לניתוח. את המדיום שמרו על קרח.
בתוך תא המגורה, הכין מיקרוסקופ דיסקציה עם פלטפורמת קרח ומספר צלחות של 10 סנטימטרים עם תמיסות דיסקציה, גם הן על קרח. לבסוף, הכן את התמיסות שבהן תשתמש וחמם את מצע הזריעה ל-37 °C באמבט מים. התחל בפרוטוקול זה על ידי קציר עוברים ביום עוברי 16 (E 16) מחולד Sprague Dawley.
ראשית, בצעו המתנה של נקבה הרייה בהתאם לנוהל שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בהם. הניחו את החולדה לאחר ההמתנה על פד ספיג ורססו את בטנה באלכוהול כדי לנקות אותו. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי לתפוס את עור הבטן וביד השנייה השתמשו במספריים כדי לחתוך את העור בלבד, פתחו את העור, והשתמשו בסט נוסף של פינצטה ומספריים סטריליים כדי לחתוך דרך שכבת השריר.
בשלב הבא, הוציאו את הרחם והעבירו אותו לכלי של 10 סנטימטר המכיל תמיסת דיסקציה קרה בקרח. השלב הבא מתבצע בתוך המנדף באמצעות מספרי מיקרו-דיסקציה. הוציאו בזהירות כל עובר מהרחם.
עת כעת לקצור ולהתחיל. עבדו עם המוחות העובריים. קצרו את המוח מכל עובר והניחו את המוחות ששוחררו בתוך צלחת נקייה של 10 סנטימטרים עם תמיסת דיסקציה על גבי פלטפורמת קרח. תחת מיקרוסקופ הדיסקציה, השלימו את דיסקציית המוחות.
הסיר את חלקי המוח האמצעי והמוח האחורי. השתמש בפינצטה עדינה להסרת המנינגס והעבר את שארית המוח הקדמי למבחנה מסוג falcon בנפח 50 מיליליטר המכילה תמיסת דיסקציה. כעת הרקמה מוכנה לשלב הבא.
דיסוציאציה של תאים באמצעות עיכול אנזימטי. ממש לפני תחילת העיכול, הכין תמיסות טריות של propane ומעכב trypsin מסונן. עיקר אותן וחמם אותן ל-37 °C באמבט מים.
הסר את עודפי המצע מהמוחות שנשחטו. לאחר מכן, הוסף ארבעה milliliters של תמיסת עיכול הפרופאן שהוכנה לשפופרת ה-50 milliliters שלך. דגור את השפופרת באמבט מים של 37 degree Celsius למשך חמש דקות בדיוק.
כאשר הזמן מסתיים, השתמשו בפיפטה להסרת תמיסת הפרופאן. לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיליליטרים של תמיסת מעכב טריפסין שהוכנה טרי, והחזירו את המבחנה לאמבט המים בטמפרטורה של 37 °C למשך שתיים עד שלוש דקות נוספות. כאשר הזמן מסתיים, הסירו את תמיסת מעכב הטריפסין.
חזור על האינקובציה עם תמיסת מעכב הטריפסין שלוש פעמים נוספות. לאחר הסרת תמיסת מעכב הטריפסין בפעם האחרונה, הוסף 20 milliliters של מצע זריעה pm מחומם למבחנה שלך.
כעת הגיע הזמן לערבב ולשטוף את התאים. ערבבו את התאים באמצעות פיפית של 10 מיליליטר עד להיעלמות כל הגושים, בערך 20 עד 30 פעמים. לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה ב-100 g למשך שבע דקות.
בשלב זה, התאים שלך צריכים להיות מופרדים היטב זה מזה. לאחר שבע דקות, הסר את העלייה (supernatant) והשהה מחדש את המשקע ב-10 milliliter של מדיום זריעה כדי לשטוף את התאים.
לאחר מכן, סובב אותם שוב בצנטריפוגה. הסר את הנוזל העליון (supernatant) וחזור על פעולות השטיפה והצנטריפוגה. שלב לאחר השטיפה השנייה.
שחזר את המשקע ב-10 milliliters של מצע תרבית אגרגטים, והעבר את התאים דרך נפה לתאים של 70 micrometer. לבסוף, ספור את התאים החיים באמצעות המוציטומטר.
כעת אתם מוכנים לאפשר לתאי המוח המופרדים ליצור אגרגטים. לאחר הספירה, השעו את התאים המופרדים במצע גידול לאגרגטים בריכוז של 2 × 10⁶ תאים למיליליטר. העבירו 2 מיליליטר של תרחף התאים לכל באר בצלחת גידול של שישה בארות שאינה מצופה.
במשך שלושה לילות, יש להשעות בעדינות את התאים בכל יום. ביום של זריעת האגרגטים, התאים יתחילו להיווצר כאגרגטים בעזרת פיפט P 1000. לאחר שהתאים גדלו במשך שלושה לילות, השע את התאים בעדינות שוב וסנן את התו suspension דרך רשת של 200 micrometer אל תוך מבחנת פלקון של 50 milliliter.
המתינו עד שהאגרגטים ישקעו לתחתית המבחנה למשך כשלוש עד חמש דקות. לאחר מכן, הסירו בזהירות את העליון (supernatant), הוסיפו מצע, השביו בעדינות את האגרגטים לתמיסוף והמתינו שוב שישקעו. חזרו על הליך זה מספר פעמים.
כדי להסיר תאים מתים, תאים בודדים ושאריות, השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק אם התמיסות העליונות עדיין מכילות תאים שאינם מאגרגים ושאריות. לאחר ששטפת היטב את האגרגטים, השהה אותם בעדינות מחדש באותו מצע וספור את האגרגטים כדי לקבוע את ריכוזם. לאחר מכן, התאם את צפיפות האגרגטים לכ-25 עד 30 אגרגטים ל-50 µl.
כעת הגיע הזמן לזרוע את כיסויי הזכוכית (cover slips) עם האגרגטים. העבירו מנות של 1000 µL של תרחיף האגרגטים לשפופרות eend Dwarf של שני מיליליטר; מכיוון שאגרגטים נוטים לשקוע לתחתית השפופרות, חיוני להכין מספר שפופרות של תרחיף האגרגטים לצורך הזריעה. כיסויי הזכוכית המשמשים בשלב זה מצופים במטריג'ל (matrigel), תסבסב לתרבית תאים, באמצעות דגירה של לילה אחד ב-37 °C.
לאחר הכנת המכסים של תרחיף המקבצים, הוציאו מהאינקובטור את צלחת התרבית המכילה את כיסויי הזכוכית (cover slips) המצופים במטריג'ל (matrigel). הסירו את התמיסה מכל באר. שטפו את כיסויי הזכוכית ב-PBS חמים ולאחר מכן ב-DD H2O.
הם מוכנים כעת לזריעת אגרגטים, כדי לזרוע את כיסוי הזריקה (cover slip) באגרגטים. הפוך את המבחנה של תמיסת האגרגטים כדי לערבב ולהפיץ את האגרגטים באופן אחיד. לאחר מכן, טפטף 50 µL מתמיסת האגרגטים למרכזו של כל כיסוי זריקה.
החזירו בעדינות את הפיתחון למדגרה ללא הפרעה נוספת כדי לאפשר לצבירי התאים להיקשר באופן אחיד לזכוכית הכיסוי. צפיפות הצבירים היא קריטית; אם הצבירים ממוקמים קרוב מדי זה לזה או אם צפיפות ההנחה גבוהה, הם נוטים להתמזג ככל שהם גדלים, ארבע עד שש שעות לאחר ההנחה הראשונית. הוסיפו 500 µL של מצע תרבית לכל באער.
כדי לתחזק את תרבית האגרגטים, החליפו חצי מכמות המצע בכל שלושה עד ארבעה ימים. בעת החלפת המצע, הוסיפו אותו לאורך הדופן של הבאר כדי למנוע פגיעה באגרגטים. מספר שעות לאחר שהאגרגטים נצמדו לכיסוי הזכוכית (cover slip), ניתן להבחין בצמיחה מהאגרגטים.
אקסונים גדלים במהירות בשבועיים הראשונים ויוצרים קשרים שופעים בין האגרגטים. תאי פרוגניטור של Ggl נודדים רדיאלית אל מחוץ לאגרגטים ומבדילים עם הזמן לאסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים בוגרים. כעת הצגנו בפניכם כיצד לגדל אגרגט של CS.
בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להוסיף את הנפח בצורה נכונה ולערבב את התערובת באופן אחיד. וזהו.
תודה לצפייה ובהצלחה בניסוי שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול לתרבית של אגרגטים של מוח עוברי של חולדה. התאים הקדמוניים הרב-פוטנציאליים (multipotent progenitors) בתוך אגרגטים אלו יכולים להתמיין לנוירונים, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- תרבית תאים
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- הבנת התפתחות מערכת העצבים המרכזית (CNS) חיונית למחקר בתחום מדעי המוח.
- תאי מקור רב-פוטנציאליים (Multipotent progenitors) יכולים להביא להיווצרותם של סוגי תאים שונים במערכת העצבים.
- תרביות אגרגטים מהוות מודל לחקר דיפרנציאציה תאית.
- שיטה זו מאפשרת התבוננות בהתנהגות תאים בסביבה מבוקרת.
מטרת המחקר
- להקמת מערכת תרבית אמינה עבור תאי פרוגניטור עצביים של ה-CNS.
- להקל על חקר הדיפרנציאציה לנוירונים וגליה בוגרים.
- לספק פרוטוקול שניתן לשחזר במעבדות אחרות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד מוחות מעוברים של חולדות בשלב E16.
- עיכול של רקמת מוח ליצירת תגלה של תאים בודדים.
- סינון וספירת תאים לפני יצירת אגרגטים.
- זריעה של אגרגטים על כיסויי זכוכית מצופים במטריגל לצורך ניתוח המשכי.
תוצאות עיקריות
- יצירה מוצלחת של אגרגטים מתאי פרוגניטור מבודדים.
- הדגמה של דיפרנציאציה לנוירונים ולתאי גליה.
- ביסוס של פרוטוקול הדיר בביצוע למחקרים עתידיים.
- יישומים פוטנציאליים בהבנת התפתחות והפרעות של ה-CNS.
מסקנות
- מערכת התרבית המתוארת יעילה לחקר תאי פרוגניטור של ה-CNS.
- אגרגטים יכולים לשמש כמודל לדיפרנציאציה נוירונלית וגליאלית.
- שיטה זו יכולה לקדם את המחקר במדעי העצבים ההתפתחותיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה עבור מנהלים
פרוטוקול זה מבסס מודל in vitro הניתן לשחזור של התפתחות מערכת העצבים המרכזית (CNS), המאפשר חקירה מכניסטית של אינטראקציות נוירו-גליאליות והתקדמות שושלת התאי האוליגודנדרוגליאליים. באמצעות שחזור דיפרנציאציה של תאי פרוגניטורים לנוירונים, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים במערכת נטולת סרום, המודל תומך בתיקוף מטרות ובסריקה פנוטיפית במחקרים על מחלות ניווניות של מערכת העצבים. המערכת מספקת פלטפורמה ניתנת להרחבה להערכת השפעת תרכובות על מיאלינציה והבשלת גליאה, ובכך מסייעת לאסטרטגיות להפחתת סיכונים בשלבים הפרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) באמצעות תצפית על גבוב של תאי מקור רב-פוטנציאליים להפוטיפים עצביים וגליאליים בוגרים.
- ערך תפעולי: מספק מערכת תרבית ללא סרום הרלוונטית לבני אדם, במטרה להפחית את הסיכון לבעיות תרגום תלויי-מין במחקרי מעורבות מטרה (target engagement).
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר תוצאות מדידות של צמיחת אקסונים, נדידה גליאלית והיווצרות מעטפת מילין עבור קמפיינים של סריקת תרכובות.
- ערך תפעולי: תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות צפיפות אגרגטים מוגדרת (25–30 aggregates/50 µL) והחלפות מצע מתוזמנות מדי 3–4 ימים.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ערך מדעי: מדמה אינטראקציות אקסו-גליאליות והבשלת אוליגודנדרוציטים, ובכך מספק מערכת רלוונטית למחלות לצורך מחקר של הפרעות דמיליניזציה.
- ערך תפעולי: מאפשר מעקב אורך של דיפרנציאציה תאית לאורך 3–4 שבועות, ובכך תומך באפיון יעילות ורעילות תלוי-זמן.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), ובכך היא מציעה פלטפורמה להפחתת סיכונים ביולוגיים להערכה מוקדמת של תרכובות לפני המעבר למודלים פרה-קליניים מורכבים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות של מסלולי שילוח בין תאי גליה לנוירונים באמצעות גילוי מבוקר של תאי פרוגניטורים של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
- סריקה: מאפשר הערכה כמותית הניתנת לשחזור של השפעות תרכובים על שלמות האגרגט וביטוי סממנים ספציפיים לשושבת.
- אנליטיקה: מייצר פלטיים מדידים הכוללים אורך אקסון, נדידה רדיאלית של תאי גליה ושלבי הבשלה של אוליגודנדרוציטים לצורך קבלת החלטות מבוססת נתונים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני באמצעות מידול של תהליכי התפתחות של מערכת העצבים המרכזית הרלוונטיים לבני אדם ומסלולים הקשורים למיאלין.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה סטנדרטית וניתנת להרחבה לייצור אגרגטים, הישימה על פני פרויקטים מרובים במדעי המוח ותחומי טיפול שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במכניזמי המטרה על ידי הפחתת ההסתמכות על שורות תאים שנחשפו יתר על המידה ולכידת דינמיקות של בידול פיזיולוגי.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות נהלי דיסוציאציה, אגרגציה והזרעה סטנדרטיים, תוך שימוש בצפיפויות תאים ולוחות זמני הבשלה מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go על ידי אספקת תובנות מוקדמות לגבי השפעות של תרכובות על תהליכים קריטיים במערכת העצבים המרכזית (CNS), כגון מיאלינציה ותפקודי תמיכה גליאליים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מועמדים מותאם סיכון, בהתבסס על פעילות שהוכחה במערכת של תרבית משולבת (co-culture) גליאלית-נוירונלית רלוונטית פיזיולוגית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של רקמה עוברית, בדיסוציאציה אנזימטית ובטכניקות של תרבית אגרגטים סטרילית.
- תלוי בגישה לנשירים של חולדות Sprague-Dawley בהיריון בתזמון מדויק, בציוד דיסקציה ובאינקובטורי CO2 לתחזוקת תרבית למשך 3–4 שבועות.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי שטיפת האגרגטים, צפיפות הזריעה והחלפת המצע בין המשתמשים השונים כדי להבטיח עקביות פנוטיפית.
- התאמה למינים אחרים או לשלבים התפתחותיים אחרים תדרוש אופטימיזציה מחדש של זמני העיכול האנזימטי ושל צפיפויות הזריעה.
- מוגבל בשל היעדר רכיבים וסקולריים וחיסוניים, דבר שעלול להשפיע על מידול של היבטים נוירו-דלקתיים של הפרעות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:52
Introduction
0:00
Title
1:27
Preparing for Dissection
2:02
Harvesting the E16 Rat Embryos
3:19
Isolating the Forebrains
4:25
Digesting and Triturating the Forebrain Tissue
6:09
Washing, Filtering, and Counting the Dissociated Cells
7:03
Culturing the Dissociated Cells to Promote Aggregation
7:54
Preparing the Coverslips and Washing the Aggregates
9:15
Seeding the Coverslips with the Aggregates
11:06
Representative Connections Formed Among Aggregates
11:29
Conclusion
