Name: דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 16 s
Description: למדו מיקרו-הזרקה של אקטין מסומן בפלורסצנציה לתאים חיים ואסיפת תאי הדמיה לצמצום פוטובליצ'ינג. שיטה זו מאפשרת מדידות כמותיות של דינמיקת חלבוני השלד התאי בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיית כתמים פלורסנטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפיתוח של qFSM ממומן על ידי מענק NIH U01 GM06230.

<ol><li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy+%28FSM%29+of+microtubules+and+actin+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li>
<li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li>
<li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li>
<li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li>
<li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

גורמים מרכזיים הם קריטיים עבור קבלת בהצלחה רבב תמונות, speckles טוב אבל להתחיל ולסיים עם איכות של אקטין שכותרתו fluorescently שלך. יחס גבוה של תיוג צבען מונומר אקטין, להגדיר סביב 0.4-0.7 תבטיח speckles יופיעו בהיר בדידה, ואילו חלבון הנקרא עצמו צריך להיות מסיסים חינם של אגרגטים. לא פחות חשוב הוא נוהל microinjection. כדי להבטיח הומאוסטזיס תא נורמלי (הישרדות), התאים צריכים להיות מוזרק עם הלחץ זרימה נמוכה, מציגה ריכוז נמוך של חלבון הנקרא. זה דורש מידה מסוימת של מומחיות וניסיון טכני / ...

הזרקת חיץ (IB) 50 mM אשלגן גלוטמט 0.5 מ MgCl2 (נספח א &#39;2) חנות עד 2 שנים ב -20 ° C &nbsp; G-כליקול 2 מ&quot;מ טריס ⋅ Cl, pH 8.0 (נספח א &#39;2) 0.2 מ&quot;מ CaCl2 (נספח א &#39;2) הוסף רק לפני השימוש: 0.2 mM ATP (ראה מתכון mM 100) 0.5 2 mercaptoethanol mM חנות עד היום 1 ב 4 ° C

דימות של תא חי f-אקטין dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (fsm)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש של פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM) כדי ללכוד תמונות ברזולוציה גבוהה של אקטין הדינמיקה PtK1 תאים. היתרון הייחודי של FSM היא יכולתו ללכוד את התנועה קינטיקה מחזור (הרכבה / פירוק) של רשת ה-F-אקטין בתוך תאים חיים. טכניקה זו שימושית במיוחד הנובעות מדידות כמותית של ה-F-אקטין הדינמיקה כאשר יחד עם תוכנה ראייה ממוחשבת (qFSM). אנו מתארים את, מבחר microinjection ויזואליזציה של בדיקות אקטין פלואורסצנטי בתאים חיים. חשוב לציין, נהלים דומים החלים חזותי macomolecular מכלולים אחרים. FSM הוכח עבור microtubules, חוטים ביניים מתחמי הידבקות.

, מבחר microinjection, הדמיה של fluorescently שכותרתו F-אקטין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רבב (FSM).

דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)

בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופיית נקודות פלואורסצנטיות (Fluorescent Speckle Microscopy - FSM) לצילום תמונות ברזולוציה גבוהה של דינמיקת אקטין בתאי PtK1. ...ייחודי

מיקרוסקופיית נקודות פלואורסצנטיות (Fluorescent speckle microscopy) משמשת לחקירת הדינמיקה של חלבוני שלד תא שונים בתאים חיים. בשימוש נכון, ניתן לבצע מדידות כמותיות של המהירות וקינטיקת התחלופה של חלבוני שלד התא. אנו מתחילים הליך זה על ידי הזרקה מיקרוסקופית של נפח קטן של actin המסומן בפלואורסצנציה לתוך תאים חיים.לאחר מכן נרכיב את תא הדמיה כדי להפחית את השפעות ה-photobleaching. ראשית, נניח שני מקטעי סרט דו-צדדי משני צדי המיקרו-סלייד, במקום שבו יונח זכוכית הכיסוי של התאים. לאחר מכן, נטפטף את מדיום ההדמיה לתוך התא על ידי הזרקת המדיום סמוך לאחד מהחריצים הפתוחים.לבסוף, כל ארבעת הצדדים נסגרים בעזרת valet. שלום, שמי ג'יימס לים מהמעבדה של גאלדן דוסר במחלקה לביולוגיה של התא במכון סקריפס למחקר (Scripps Research Institute). היום נדגים לכם פרוצדורה של מיקרוסקופיית נקודות פלואורסצנטיות (fluorescent speckle microscopy).אנו משתמשים בנוהל זה כדי לבחון את הדינמיקה של actin בתאי אפיתל נודדים. לכן, בואו נתחיל. מרכיב מרכזי להשגת סרטוני מיקרוסקופיית נקודות פלואורסצנטיות (fluorescent speckle microscopy) איכותיים הוא סימון נכון של actin באמצעות הפלואורופור שבחרתם; אנו ממליצים להשתמש בפלואורופורים מסוג Alexa ו-rhodamine, נגזרות של NHS ester המטרגטות שאריות ליזין חשופות על פני השטח של actin.חשוב שיחס הסימון יה

live-cell-imaging-f-actin-dynamics-via-fluorescent-speckle-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה נועד להדריך את הקורא בפעולה של כוח אטומי משולב אופטי מיקרוסקופ הדמיה לגירוי מכני של תאים חיים בתרבות. פרוטוקול צעד אחר צעד מוצג. נתונים נציג קבוצה שמראה תא חי בתגובה לגירוי מכני מוצג.

תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

הדמיה מיקרוסקופית של תאים אנדותל לחיות להביע GFP-אקטין מאפשר אפיון של שינויים דינמיים מבנים cytoskeletal. שלא כמו טכניקות להשתמש דגימות קבוע, שיטה זו מספקת הערכה מפורטת של השינויים הזמני cytoskeleton אקטין בתאי אותו לפני, במהלך ואחרי גירויים פיזיים, תרופתי, או דלקתיים שונים.

עיון cytoskeleton אקטין ב לתאי אנדותל חיים הבעת GFP-אקטין

מידע מרחבי-זמני על חלבונים דינמיים בתוך תאים חיים הוא חיוני להבנת הביולוגיה. סוג של מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה הנקראת מיקרוסקופ תאורה תלת-ממדי מהיר (f3D-SIM) חושף מידע ייחודי על טבעת Z הציטוקינטית בחיידקים: הן המראה דמוי החרוז והן הדינמיקה המהירה של FtsZ בתוך הטבעת.

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

התפלגות מרחבית ודינמיקה זמנית של חלבוני קרום פלזמה ושומנים היא נושא חם בביולוגיה. כאן נושא זה מטופל על ידי ניתוח תנודות תמונה מרחבי-זמני המספק מבחינה רעיונית את אותן כמויות פיזיקליות של מעקב אחר חלקיקים בודדים, אך הוא משתמש בתוויות מולקולריות קטנות ובהגדרות מיקרוסקופיה סטנדרטיות.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

כדי לחקור מהירויות זרימה וכיווניות של אקטין חוטי בסינפסה האימונולוגית של תאי T, הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים חיים משולבת עם פלואורסצנציה של השתקפות פנימית כוללת ומכומתת עם ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה מרחבית-זמנית.

קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים

אנו מציגים פרוטוקול עבור היישום של interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופי (iPALM), שיטה מיקרוסקופית 3 ממדי מולקולה בודדת לוקליזציה סופר רזולוציה, אל ההדמיה של שלד התא יקטין בתאי יונקים חסידים. גישה זו מאפשרת הדמיה מבוססת אור של תכונות מבניות ננו שאחרת נותרו לא פתורים על ידי מיקרוסקופיה אופטית-מוגבל עקיפה קונבנציונלית.

תלת מימדי סופר רזולוציה מיקרוסקופית של סיבים F- אקטין ידי interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופית (iPALM)

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה ומאפשר הפריט החזותי כמותית של היווצרות מורכבות של חלבונים מוקש, המבוססת על העברת האנרגיה תהודה פורסטר, ואורך חיים פלורסצנטיות הדמיה במיקרוסקופ.

להמחיש מוקש תאיים סחר על-ידי קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ

נתאר כמה מיקרו - photomanipulation טכניקות כגון FRAP photoactivation לאפשר קביעת פרמטרים תנועתיות ואת הדינמיקות ייתכן של חלבונים בתוך מעביר תאים. ניסיוני הקריאות הבאות כוללות דינמיקה subcellular מחזור של הרגולטורים תנועתיות או של שלד התא המשמש כבסיס של אקטין.

בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

כדי להתקדם, קונוסים צמיחה חייבים להפעיל כוחות משיכה נגד הסביבה החיצונית. דור כוחות המתיחה תלוי בדינמיקת אקטין ובצימוד מצמד. המחקר הנוכחי מתאר שיטות לניתוח דינמיקת אקטין, צימוד מצמד וכוחות משיכה להתקדמות חרוט הצמיחה.

ניתוחים של אקטין דינמיקה, מצמד צימוד וכוח המתיחה לקידום קונוס צמיחה

אנו מציגים פרוטוקולים לבדיקות מיקרופלואידיות פשוטות של נימת אקטין, בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרות לנטר במדויק חוטי אקטין בודדים בזמן אמת תוך חשיפתם ברצף לתמיסות חלבון שונות.

שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות

כאן, אנו מציגים שיטות להכנת מכלולי אקטין מעין דו-ממדיים (2D) שזורים, צולבים וגבישים נוזליים מחלבונים מטוהרים.

כוונון מצבי ההתכווצות והעיוות של מכלולים מבוססי אקטין פעילים במבחנה: מרשתות פעילות דו-ממדיות לטיפות גביש נוזלי

למדו מיקרו-הזרקה של אקטין מסומן בפלורסצנציה לתאים חיים ואסיפת תאי הדמיה לצמצום פוטובליצ'ינג. שיטה זו מאפשרת מדידות כמותיות של דינמיקת חלבוני השלד התאי בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיית כתמים פלורסנטית.

דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)

גלה סרטונים נוספים