Name: דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 16 s
Description: למדו מיקרו-הזרקה של אקטין מסומן בפלורסצנציה לתאים חיים ואסיפת תאי הדמיה לצמצום פוטובליצ'ינג. שיטה זו מאפשרת מדידות כמותיות של דינמיקת חלבוני השלד התאי בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיית כתמים פלורסנטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפיתוח של qFSM ממומן על ידי מענק NIH U01 GM06230.

<ol><li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy+%28FSM%29+of+microtubules+and+actin+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li>
<li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li>
<li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li>
<li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li>
<li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

גורמים מרכזיים הם קריטיים עבור קבלת בהצלחה רבב תמונות, speckles טוב אבל להתחיל ולסיים עם איכות של אקטין שכותרתו fluorescently שלך. יחס גבוה של תיוג צבען מונומר אקטין, להגדיר סביב 0.4-0.7 תבטיח speckles יופיעו בהיר בדידה, ואילו חלבון הנקרא עצמו צריך להיות מסיסים חינם של אגרגטים. לא פחות חשוב הוא נוהל microinjection. כדי להבטיח הומאוסטזיס תא נורמלי (הישרדות), התאים צריכים להיות מוזרק עם הלחץ זרימה נמוכה, מציגה ריכוז נמוך של חלבון הנקרא. זה דורש מידה מסוימת של מומחיות וניסיון טכני / ...

הזרקת חיץ (IB) 50 mM אשלגן גלוטמט 0.5 מ MgCl2 (נספח א &#39;2) חנות עד 2 שנים ב -20 ° C &nbsp; G-כליקול 2 מ&quot;מ טריס ⋅ Cl, pH 8.0 (נספח א &#39;2) 0.2 מ&quot;מ CaCl2 (נספח א &#39;2) הוסף רק לפני השימוש: 0.2 mM ATP (ראה מתכון mM 100) 0.5 2 mercaptoethanol mM חנות עד היום 1 ב 4 ° C

דימות של תא חי f-אקטין dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (fsm)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש של פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM) כדי ללכוד תמונות ברזולוציה גבוהה של אקטין הדינמיקה PtK1 תאים. היתרון הייחודי של FSM היא יכולתו ללכוד את התנועה קינטיקה מחזור (הרכבה / פירוק) של רשת ה-F-אקטין בתוך תאים חיים. טכניקה זו שימושית במיוחד הנובעות מדידות כמותית של ה-F-אקטין הדינמיקה כאשר יחד עם תוכנה ראייה ממוחשבת (qFSM). אנו מתארים את, מבחר microinjection ויזואליזציה של בדיקות אקטין פלואורסצנטי בתאים חיים. חשוב לציין, נהלים דומים החלים חזותי macomolecular מכלולים אחרים. FSM הוכח עבור microtubules, חוטים ביניים מתחמי הידבקות.

, מבחר microinjection, הדמיה של fluorescently שכותרתו F-אקטין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רבב (FSM).

דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)

בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש במיקרוסקופיית נקודות פלואורסצנטיות (Fluorescent Speckle Microscopy - FSM) לצילום תמונות ברזולוציה גבוהה של דינמיקת אקטין בתאי PtK1. ...ייחודי

מיקרוסקופיית נקודות פלואורסצנטיות (Fluorescent speckle microscopy) משמשת לחקירת הדינמיקה של חלבוני שלד תא שונים בתאים חיים. בשימוש נכון, ניתן לבצע מדידות כמותיות של המהירות וקינטיקת התחלופה של חלבוני שלד התא. אנו מתחילים הליך זה על ידי הזרקה מיקרוסקופית של נפח קטן של actin המסומן בפלואורסצנציה לתוך תאים חיים.לאחר מכן נרכיב את תא הדמיה כדי להפחית את השפעות ה-photobleaching. ראשית, נניח שני מקטעי סרט דו-צדדי משני צדי המיקרו-סלייד, במקום שבו יונח זכוכית הכיסוי של התאים. לאחר מכן, נטפטף את מדיום ההדמיה לתוך התא על ידי הזרקת המדיום סמוך לאחד מהחריצים הפתוחים.לבסוף, כל ארבעת הצדדים נסגרים בעזרת valet. שלום, שמי ג'יימס לים מהמעבדה של גאלדן דוסר במחלקה לביולוגיה של התא במכון סקריפס למחקר (Scripps Research Institute). היום נדגים לכם פרוצדורה של מיקרוסקופיית נקודות פלואורסצנטיות (fluorescent speckle microscopy).אנו משתמשים בנוהל זה כדי לבחון את הדינמיקה של actin בתאי אפיתל נודדים. לכן, בואו נתחיל. מרכיב מרכזי להשגת סרטוני מיקרוסקופיית נקודות פלואורסצנטיות (fluorescent speckle microscopy) איכותיים הוא סימון נכון של actin באמצעות הפלואורופור שבחרתם; אנו ממליצים להשתמש בפלואורופורים מסוג Alexa ו-rhodamine, נגזרות של NHS ester המטרגטות שאריות ליזין חשופות על פני השטח של actin.חשוב שיחס הסימון יהיה גבוה, סביב 0.3 עד 0.7 צבעים למונומר של acton, כדי להבטיח שהנקודות (speckles) ייראו בהירות ונפרדות לפני אחסון לטווח ארוך. יש להבהיר את תמיסת ה-Acton המסומנת על ידי סבוב בצנטריפוגה ב-75,000 עד 80,000 ×g למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 °C. יש לאחסן Acton מסומן בתמיסת G buffer בטמפרטורה של 80- °C.הכינו מנות של 2 µL כדי למנוע הקפאה והפשרה חוזרות, שעלולות להוביל להיווצרות צברים בלתי מסיסים. כדי למנוע הלבנה פוטוכימית (photo bleaching) של הפלואורופורים, אין לחשוף את תמיסת האקטין המסומנת לאור ישיר למשך פרקי זמן ממושכים, ויש להשתמש באنبובות מיקרו-צנטריפוגה אטומות לאור לצורך אחסון לטווח ארוך. את התאים להזרקה מיקרוסקופית הניחו על לוחות כיסוי מזכוכית ריבועית שנשטפו בחומצה.ניתן להחיל ציפוי תשתית סטנדרטי על לוחות הכיסוי, דבר זה לא ישפיע על המיקרו-הזרקה. אחסן את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות בעוד האקטין מוכן, וזאת כדי לבחור תאים המתאימים למיקרו-הזרקה. עבור FSM, שקול את הקריטריונים הבאים.התאים צריכים להיות גדולים, בקוטר הגדול מ-50 micrometers, להיפרס באופן שטוח לאחר הזריעה ולהיצמד באופן טבעי למצעים. יועיל גם אם השטח של הציטופלזמה של התא תופס שטח הגדול מזה של הגרעין שלו. כמה מקווי תאים מתאימים כוללים PTK one, תאי ריאה של טריטון ונוירוני AIA.בהדגמה זו, נזריק PTK לתאי אפיתל. הבחירה הנכונה של מחטי המיקרו-הזרקה תלויה בגודל פתח הקצה. בדרך כלל, גדלי החורים יכולים להשתנות מ-0.5 micrometers ועד לגודל של שלושה micrometers.אנו ממליצים על גודל פתח אופטימלי שבין 0.5 ל-1 מיקרומטר. לצורך ההזרקה, ניתן לרכוש מחטי מיקרו-הזרקה או להכינן אותן באופן עצמאי. במידה וקיים מכשיר למשיכת מחטים מסחרי, אנו ממליצים למתחילים להכין מראש 10 עד 20 מחטים משוכות לפני תחילת הליך ההזרקה.השלב הבא הוא לדלל את ה-acton המסומן עם בופר הזרקה קר מאוד (בטמפרטורת קרח). יש לשמור את כל תמיסות העבודה על קרח. ריכוז ההזרקה האידיאלי, שהוא הריכוז הסופי של ה-acton שנטען למחט, הוא בין 0.5 ל-1 µg/µL.בהתבסס על יחס סימון של 40% של D לעומס מונומר אקטין, טפטפו 0.5 עד מיליליטר אחד של תמיסת האקטין המדוללת. בעזרת מחט של מיקרו-מזרק, העבירו בזהירות את תמיסת האקטין. השתדלו להימנע מבועות.במידה וישנן בועות, ניתן להסירן בקלות על ידי שאיבת עודפי נוזלים המקיפים את הבועה. ודאו שתמיסת ה-Acton נחה באופן מלא בקצה המחט. לא צריכים להיות עודפי תמיסה באף נקודה לאורך הנימי של המחט, כיוון שהדבר עלול להפריע לזרימת ההזרקה.המחט הטעונה מוכנה כעת לחיבור למחזיק ההזרקה עבור מיקרו-הזרקה. הוצא את התאים מהאינקובטור והנח את זכוכית הכיסוי על במה של המיקרוסקופ. כדי להתחיל בהליך המיקרו-הזרקה, העבר את המחט הטעונה אל המיקרוסקופ.חברו בזהירות את המחט למחזיק המזרק, תוך הימנעות ממגע בקצה המחט. מקמו את המחזיק כך שהמחט תהיה בזווית של 35 עד 50 מעלות לבסיס במה של המיקרוסקופ. הורידו את קצה המחט עד שייגע קלות במשטח התמיכה.כעת ממקמים את קצה המחט כך שיהיה בדיוק מעל מרכז העדשה. אם קצה המחט מיושר עם העדשה, תראו הילה בהירה דרך העינית. זוהי נקודת הסיום של קצה המחט.הזזה איטית של המחט מצד לצד עשויה לסייע באיתור טוב יותר של ההילה. בעת הניווט, וודאו שקצה המחט נמצא גבוה מעל התאים שלכם. כדי למנוע שבירה של קצה המחט, כוונו את ה-Z.Focus במיקרוסקופ עד שהתאים שלכם ייראו בבירור.לאחר מכן, הורד לאט את קצה המחט תוך כדי בקרת המיקוד עד שההילה תצטמצם בהדרגה ובסוף תתכנס אל קצה המחט. ניתן גם לחפש את גוף המחט, שיטיל צללים קווים. הורדת המחט תגדיר בהדרגה את גוף המחט.ייתכן שיהיה צורך בביצוע התאמות קלות של טבעת הפאזה כדי לשפר את הניגודיות; כעת both קצה המחט והתאים שלך צריכים להיות גלויים בבירור. בעת בחירת תאים להזרקה, יש לבחור תאים ששפתם החופשית פונה לקצה המחט. פעולה זו תבטיח שהשיפוע היורד של התא, מהנקודה העבה ביותר שבה נמצא הגרעין ועד לנקודה הדקה ביותר של הקצה המוביל, יפגוש את קצה המחט במקום לרוץ במקביל לו.כוון את לחץ המחט ל-0.3 עד 0.8 PSI. הלחץ הקבוע שיופעל יביא לזרימה רציפה של תמיסת ה-acton. לאחר שבחרת תא להזרקה, מקם את המחט כך שהחוד יהיה לצד גרעין התא; הורד לאט וכוון מחדש את מיקום המחט עד שהחוד ילחץ על התא.הורד את המחט בהדרגה עד שקצהה יחדור את הממברנה. אם המחט חדרה את הממברנה באופן מלא, התא ייראה בהיר יותר. ברגע שתראה שינוי זה, הרם את המחט עד שהיא לא תהיה במגע עם התא.תהליך הדקירה וההזרקה בפועל יארך בין 0.5 לשתי שניות. כאשר הפעולה מבוצעת נכון, צורת התא תיראה ללא שינוי. כדי למזער את העקה על התאים, הגבילו כל סשן של מיקרו-הזרקה ל-20 עד 45 דקות לכל היותר.לעיתים ייתכן שלא תבחינו בשינויים בתא בעת ההזרקה והתא לא יהפוך לבהיר יותר. דבר זה מעיד על כך שייתכן שקצה המחט סתום. ניתן לבחון זאת על ידי לחיצה על כפתור הניקוי (clean), אם הוא זמין במזרק הטרנס-אינז'קטור (trans injector) שברשותכם.אם קצה המחט פתוח, הדבר יגביר משמעותית את זרימת הלחץ הקבוע, שניתן לראותה כאדוות ופיזור של פסולת סמוכה. אם קצה המחט סתום, ניתן להחדיר מחט מיקרו-הזרקה חדשה או לנסות לשבור את קצה המחט על ידי הורדה עדינה של המחט עד שקצה המחט נלחץ אל מול הזכוכית של כיסוי הלבידה (cover slip), ובכך לגרום לשבירת קצהו של התום.שטח השבירה לא יעלה על חמישית משטח חוד המחט,וזהו חלק המחט המתחיל להתכנס לכדי נקודה עם סיום המיקרו-הזרקה. החליפו את מצע התרבית בצלחת במצע טרי ומחומם מראש כדי להסיר כל שארית פלואורסצנטית. לאחר החלפת המצע, אפשרו לתאים להתאושש במשך 30 דקות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C לפני הדימוי.פעולה זו תאפשר לאקטין להשתלב ברשת שלד התא הקיימת בזמן שהתאים מתאוששים באינקובטור; התחילו בהרכבת תא הדמיה. ראשית, חממו מראש את מדיום ההדמיה באמבט מים של 37 °C. לאחר מכן, הפשיתו אליקוט של 15 µL של oxa erase בטמפרטורת החדר.הוספת RA למדיום בשלב מאוחר יותר תפחית משמעותית את השפעות הדהייה הפוטוכימית (photobleaching). עטיפת ה-oxa erase בנייר אלומיניום תבטיח שהתרכובת הרגישה לאור תהיה מוגנת מאור. חממו מראש את חומר האיטום VAP על לוח חימום המכוון לטמפרטורה נמוכה; אין לחמם יתר על המידה או לשרוף את ה-vap, שכן הוא יאבד מיעילותו כחומר איטום.נגבו למסחית מיקרוסקופית בעזרת נייר Kim wipe ספוג באתנול טהור כדי לנקות ולהסיר שאריות קטנות. הניחו שתי רצועות שוות של סרט דביק דו-צדדי באורך 2.5 centimeters אחת על השנייה, באמצעות משטח שטוח ונקי כגון למסחית מיקרוסקופית נוספת. השתמשו במשטח זה כדי להוציא בועות אוויר כלואות וליצור מישור שטוח לחלוטין.בשלב הבא, השתמשו בלהב תער כדי לחתוך שני פסים ישרים לאורך הציר הארוך של הסרט, כך שרוחבו של כל פס יהיה 0.5 סנטימטרים. בעזרת פינצטה, הניחו כל פס לאורך הקצוות הארוכים של תגית המיקרוסקופ, כך ששני פסי הסרט ייצרו מרווח במרכז התגית. לחצו בעדינות על הסרט כדי ליצור איטום טוב עם הזכוכית.רצועות סרט דביק אלו ישמשו כמרווחים בין הזכוכית של השקופית לבין הזכוכית של כיסוי השקופית. בדקו את השסתום כדי לוודא שהחומר נמס לחלוטין. לפני שתתחילו בשלב הבא, הוציאו את מדיה הדימוג שחוממה מראש.הוסיפו 15 µL של oxy rays לכל 500 µL של מצע. קפלו נייר ניקוי כימי (chem wipe) לצורת משולש כדי ליצור שלושה קצוות חדים. משולש זה ישמש בהמשך לניגוב של לביבית הכיסוי (cover slip).הוציאו את התאים מהאינקובטור באמצעות פינצטה. הרימו במהירות פינה אחת של לבידה המכסה (cover slip). הניחו את הלבידה על נייר ניגוב (Kim wipe) כאשר צד התאים פונה כלפי מעלה ואינו נוגע ברקמה, והשתמשו בנייר הניגוב המקופל כדי לנגב שני צדדים נגדיים של הלבידה ליצירת משטח חצי-יבש.לאחר מכן, הרים פינה של זכוכית הכיסוי באמצעות פינצטה והנח אותה על למסחית המיקרוסקופ כך שהמשטחים היבשים יהיו מיושרים לשני פסי הסרט. שים לב שכעת ישנם שני צדדים סגורים ושני חריצים פתוחים. טפטף באיטיות 200 µL מתמיסת ה-RA של מדיום הדימוג קרוב לאחד הפתחים.חשוב להימנע מהחדרת בועות אוויר. התמיסה צריכה להישאב אל תוך התא שהורכב כעת באמצעות כוחות קפילריים, ובכך להטביע את התאים שלך באופן מלא בתמיסה. בעזרת מקלון צמר גפן, טפלו בארבעת הפינות של לביב הכיסוי עם vap מומס כדי לקבע ולייצב את לביב הכיסוי במהירות.ניתן להבחין כי ה-VAP מתייבש תוך שניות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, החל מהצדדים הסגורים, מרחו פס דק של VAP באמצעות מקל צמרגב בתנועה המדמה משיכת מכחול. חזרו על הפעולה עבור הצדדים הפתוחים.בנו בהדרגה את שכבת ה-vap, תוך חיזוק האיטום על ידי חזרה על שלבי הציפוי. יש להגביל את ה-VAP לשוליים ולהשאיר את מרכז הזכוכית המכסה נקייה. לאחר איטום שולי הזכוכית המכסה, נקה בעדינות את החלק המרכזי של הזכוכית המכסה באמצעות מקלון צמר גפן טבול ב-DD H2O כדי להסיר שאריות של מצע.היזהרו לא למעוך את התאים. חזרו על שלב ניקוי זה עם אתנול טהור. כעת יש לכם תא דימות סגור לחלוטין שעבר אופטימיזציה לדימות נקודות פלואורסצנטיות (fluorescent speckle imaging).שימוש במארז אטום לחלוטין ימנע מהדגימות הצמחיות שלכם לעבור פוטובליצ'ינג מהיר. התאים בתא הסגור לחלוטין מוכנים כעת לדימוג. אנו משתמשים במיקרוסקופ שדה רחב הפוך עם מנורת כספית, מאיר אפי, מסננים מתאימים ועדשת שמן (oil immersion plan).תמונות בעדשות אפוכרומטיות נלכדות באמצעות מצלמת CCD מקוררת עם פיקסלים של 6.7 micron ותוכנה לרכישת תמונות. חממו מראש אתבמתו של המיקרוסקופ ל-37 degrees. הניחו את תא ההדמיה והמתינו 10 עד 15 דקות להתייצבות הטמפרטורה לפני ההדמיה.לאחר שהטמפרטורה התייצבה, בצעו מיקוד של התאים במיקרוסקופ שדה בהיר (brightfield) ואז אתרו את התאים שהוזרקו באמצעות מעבר להגדרות הפלואורסצנציה המתאימות. השתדלו לצמצם את זמן החשיפה לפלואורסצנציה כדי להפחית פוטובליצ'ינג (photobleaching). חפשו תאים מוזרקים בעלי קצוות מובילים מעוקלים ובריאים.תאים שסבלו מהזרקת יתר יאופיינו בקצוות נסוגים ומשוננים הדומים ל-phylo podia רבים. אין לצלם תאים אלו. הגדרות הרכישה יהיו תלויות בסוג התא, באיכות ה-acton המסומן ובמרכיבי המיקרוסקופ.עם זאת, הגדרות החשיפה לא יעלו על שתי שניות, ויש להגדיר את מרווח הזמן בין הפריימים לבין חמש ל-10 שניות. ניתן להעלות את הגדרות ה-Gain במצלמה כדי להגביר את יחס האות לרעש. במאפייני speckle אידיאליים, כל speckle צריך להיות מרוחק בכשני קטרי speckle מה-speckle השכן לו.עבור תאים אפיתליאליים, רשת האקטין הנקודית תיראה הומוגנית, כאשר הנקודות מפוזרות במרווחים שווים. יש להתאים את הגדרות החשיפה כדי להשיג את התמונות הנקודיות האיכותיות ביותר.המפתח להשגת סרטוני ספקל (speckle) איכותיים הוא שמירה על הפוקוס. דבר זה חשוב במיוחד עבור ניתוח לאחר-הסרט הכולל מדידות של זרימת ספקל ותחלופה (turnover). לפיכך, איכות הניתוח הכמותי תהיה תלויה בנעילת הפוקוס לאורך כל משך צילום ה-time lapse.אסטרטגיות שונות לשמירה על המיקוד מפורטות בטקסט; בהדגמה זו נשתמש במערכת ה-Nikon Perfect focus. להלן דוגמאות שונות של תאים שהוחדרו במיקרו-אינז'קציה. הפאנל השמאלי מציג תא שהוחדר במיקרו-אינז'קציה עם תמונת נקודות (speckle image) בריכוז נמוך.הפאנל האמצעי מציג תמונה של נצנצים (speckle) בתא שהוזרק בריכוז גבוה מדי, והפאנל הימני מציג תא שהוזרק באופן אופטימלי עבור FSM עם תמונת נצנצים טובה. כעת הצגנו לכם כיצד לבצע מיקרו-הזרקה של acton המסומן פלואורסצנטית לתאי אפיתל לצורך מיקרוסקופיית נצנצים פלואורסצנטית.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שאיכות ה-acton המסומן, כמו גם טכניקת המיקרו-הזרקה, יקבעו את האיכות הכללית של תמונות ה-speckle. זהו כל התהליך, ובהצלחה בניסוייכם.

live-cell-imaging-f-actin-dynamics-via-fluorescent-speckle-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה נועד להדריך את הקורא בפעולה של כוח אטומי משולב אופטי מיקרוסקופ הדמיה לגירוי מכני של תאים חיים בתרבות. פרוטוקול צעד אחר צעד מוצג. נתונים נציג קבוצה שמראה תא חי בתגובה לגירוי מכני מוצג.

תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

הדמיה מיקרוסקופית של תאים אנדותל לחיות להביע GFP-אקטין מאפשר אפיון של שינויים דינמיים מבנים cytoskeletal. שלא כמו טכניקות להשתמש דגימות קבוע, שיטה זו מספקת הערכה מפורטת של השינויים הזמני cytoskeleton אקטין בתאי אותו לפני, במהלך ואחרי גירויים פיזיים, תרופתי, או דלקתיים שונים.

עיון cytoskeleton אקטין ב לתאי אנדותל חיים הבעת GFP-אקטין

מידע מרחבי-זמני על חלבונים דינמיים בתוך תאים חיים הוא חיוני להבנת הביולוגיה. סוג של מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה הנקראת מיקרוסקופ תאורה תלת-ממדי מהיר (f3D-SIM) חושף מידע ייחודי על טבעת Z הציטוקינטית בחיידקים: הן המראה דמוי החרוז והן הדינמיקה המהירה של FtsZ בתוך הטבעת.

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

התפלגות מרחבית ודינמיקה זמנית של חלבוני קרום פלזמה ושומנים היא נושא חם בביולוגיה. כאן נושא זה מטופל על ידי ניתוח תנודות תמונה מרחבי-זמני המספק מבחינה רעיונית את אותן כמויות פיזיקליות של מעקב אחר חלקיקים בודדים, אך הוא משתמש בתוויות מולקולריות קטנות ובהגדרות מיקרוסקופיה סטנדרטיות.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

כדי לחקור מהירויות זרימה וכיווניות של אקטין חוטי בסינפסה האימונולוגית של תאי T, הדמיה ברזולוציה גבוהה של תאים חיים משולבת עם פלואורסצנציה של השתקפות פנימית כוללת ומכומתת עם ספקטרוסקופיה של מתאם תמונה מרחבית-זמנית.

קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים

אנו מציגים פרוטוקול עבור היישום של interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופי (iPALM), שיטה מיקרוסקופית 3 ממדי מולקולה בודדת לוקליזציה סופר רזולוציה, אל ההדמיה של שלד התא יקטין בתאי יונקים חסידים. גישה זו מאפשרת הדמיה מבוססת אור של תכונות מבניות ננו שאחרת נותרו לא פתורים על ידי מיקרוסקופיה אופטית-מוגבל עקיפה קונבנציונלית.

תלת מימדי סופר רזולוציה מיקרוסקופית של סיבים F- אקטין ידי interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופית (iPALM)

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה ומאפשר הפריט החזותי כמותית של היווצרות מורכבות של חלבונים מוקש, המבוססת על העברת האנרגיה תהודה פורסטר, ואורך חיים פלורסצנטיות הדמיה במיקרוסקופ.

להמחיש מוקש תאיים סחר על-ידי קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ

נתאר כמה מיקרו - photomanipulation טכניקות כגון FRAP photoactivation לאפשר קביעת פרמטרים תנועתיות ואת הדינמיקות ייתכן של חלבונים בתוך מעביר תאים. ניסיוני הקריאות הבאות כוללות דינמיקה subcellular מחזור של הרגולטורים תנועתיות או של שלד התא המשמש כבסיס של אקטין.

בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

כדי להתקדם, קונוסים צמיחה חייבים להפעיל כוחות משיכה נגד הסביבה החיצונית. דור כוחות המתיחה תלוי בדינמיקת אקטין ובצימוד מצמד. המחקר הנוכחי מתאר שיטות לניתוח דינמיקת אקטין, צימוד מצמד וכוחות משיכה להתקדמות חרוט הצמיחה.

ניתוחים של אקטין דינמיקה, מצמד צימוד וכוח המתיחה לקידום קונוס צמיחה

אנו מציגים פרוטוקולים לבדיקות מיקרופלואידיות פשוטות של נימת אקטין, בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרות לנטר במדויק חוטי אקטין בודדים בזמן אמת תוך חשיפתם ברצף לתמיסות חלבון שונות.

שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות

כאן, אנו מציגים שיטות להכנת מכלולי אקטין מעין דו-ממדיים (2D) שזורים, צולבים וגבישים נוזליים מחלבונים מטוהרים.

כוונון מצבי ההתכווצות והעיוות של מכלולים מבוססי אקטין פעילים במבחנה: מרשתות פעילות דו-ממדיות לטיפות גביש נוזלי

למדו מיקרו-הזרקה של אקטין מסומן בפלורסצנציה לתאים חיים ואסיפת תאי הדמיה לצמצום פוטובליצ'ינג. שיטה זו מאפשרת מדידות כמותיות של דינמיקת חלבוני השלד התאי בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיית כתמים פלורסנטית.

דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)

גלה סרטונים נוספים