ב electroporation ברחם לשעבר vivo על ביטוי גנים בתאים עכבר גנגליון רשתית
24 בספטמבר 2009
כאן אנו מציגים שתי טכניקות מניפולציה ביטוי גנים בתאי הגנגליון ברשתית Murine (RGCs) על ידי בתוך הרחם ו לשעבר vivo Electroporation. טכניקות אלה מאפשרות לבחון כיצד שינויים בביטוי הגנים משפיעים על התפתחות RGC, הדרכה האקסון, ומאפיינים תפקודית.
ברחם, אלקטרופורציה של הרשתית מתחילה בחתך בטן על סכר מורדם בשלב E 13.5 עד 14.5 כדי לחשוף את השרשרת העוברית. ה-DNA מוזרק לרשתית אחת לכל עובר והראשים עוברים אלקטרופוטציה וגורמים ל-DNA להיקלט על ידי אבות RGC. ב-E 18.5 העוברים מועברים ו-GFP חיובי.
הקרנות רשתית וראייה מנותחות עבור אלקטרופורציה של רשתית X vivo. ראשי E 13.5 עד 14.5 מוצמדים לצד הגב כלפי מעלה בצלחת ו-DNA מוזרק לאזור הגבי ההיקפי של שתי הרשתית, ואחריו אלקטרופורציה. רשתית שלמה עוברת תרבית במשך 40 שעות, ולאחר מכן ציפוי של צמחי רשתית חיוביים GFP לבדיקות תרבית במבחנה.
היי, אני טים פטרוס מהמעבדה של ד"ר קרול מייסון במחלקה לפתולוגיה וביולוגיה של התא ומדעי המוח באוניברסיטת קולומביה. היום נראה לך כיצד להכניס גנים לרשתית השיקוף העוברית על ידי שימוש באלקטרופורציה של הרשתית ברחם ומחוץ לגוף. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור כיצד מניפולציה של ביטוי גנים ותאי גנגליון ברשתית משנה את מסלול ההקרנה שלהם במיוחד בכיאזמה האופטית.
אוקיי, בואו נתחיל. לפני שמנסים אלקטרופורציה של הרשתית ברחם, הכנה נכונה היא חיונית. אנא עיין בפרוטוקול הכתוב שלנו למידע מפורט על הכנת עיקור הרדמה של כלים ומכשור, הכנת תמיסות DNA להזרקה ותמיסות אנטי פטריות אנטיביוטיות לאחר הניתוח, הכנת אזור הניתוח וחימום התמיסות המתאימות.
יש להכין מיקרו פיפטות עדינות לפני הניתוח באמצעות מושך מיקרו אלקטרודות. שברו את הקצה כדי ליצור נקודה זוויתית לאלקטרופורציה ברחם ראשית הזריקו 0.15 מיליליטר מתערובת ההרדמה הבין-פריטונאלית לסכר שלב E 13.5 עד E 14.5. זה אמור לקחת שלוש עד שבע דקות עד שהסכר יהיה תחת הרדמה מלאה כדי לבדוק אם העכבר מורדם
צבטו את הכפה האחורית ובדקו אם יש חוסר תגובה במהלך המרווח שבו החיה נכנעת להרדמה. חותכים חתיכה קטנה ופיפטה חמישה מיקרוליטרים מתמיסת ה- DNA על הפרם. כופפו בוכנת חוט מתכת בזווית של 90 מעלות והכניסו אותה למיקרו פיפטה משוכה באמצעות הבוכנה, שאפו את תמיסת ה-DNA לתוך המיקרו פיפט.
כעת חשפו בניתוח את עוברי העכברים. אנא עיין בפרוטוקול JoVE של Wal Inus et al לטכניקה המתאימה. עכשיו אנחנו מוכנים לאלקטרופורציה.
הצעד הראשון הוא לכוון את הרשתית כראוי. לאחר מכן נזריק DNA לתוך הרשתית ואז נבצע מצעד חשמלי של הראש. אוקיי, בואו נתחיל.
אוקיי, הצעד הראשון הוא לכוון את הרשתית כך שהיא פונה כלפי מעלה כמו זו. לאחר מכן, בעזרת המיקרו-פיפטה, ננקב את דופן מי השפיר ובאופן אידיאלי נזריק את הדנ"א ישירות לרשתית. לאחר שניקבת דרך דופן הרחם, תלחץ על הבוכנה, שתוציא את ה-DNA לתוך הרשתית ותמשוך את הבוכנה.
ככזה, לאחר שהזרקת את ה-DNA, אתה אמור לראות את הצבע הירוק ממלא את מי השפיר וגם את הרשתית. אוקיי, עכשיו שעשינו את ההזרקה, אנחנו מוכנים לאלקטרופורציה. אז כדי להתפלל אלקטרו, אנחנו הולכים למקם את משוטי האלקטרופורציה סביב העובר עם ההנעה החיובית הצמודה לרשתית שהייתה במצעד אלקטרו.
וכשמוכן, משוט כף רגל דיכאוני וזה יעביר זרם לעובר. אתה רואה בועות שנוצרות על משוט מחבת המטען השלילי וזה מראה שהאלקטרופורציה הייתה מוצלחת. ותחזור על שלב זה עבור כל העוברים המוזרקים.
אז ככה אתה מסדר את הדנ"א לתוך רשתית עוברית אחת. אתה יכול לחזור על הליך זה עד כמה עוברים שתרצה. יש לזכור שככל שתבצעו יותר עוברים, כך גדל הסיכוי שהאם תפיל את העוברים.
לאחר המצעד החשמלי של העוברים, השתמש באצבעותיך כדי לעסות את השרשרת העוברית בחזרה לתוך הסכר ברגע שהעוברים חוזרים פנימה. יוצקים כשני מיליליטר מהתמיסה האנטיביוטית האנטי מיקוטית לחלל הבטן. השתמש בהמוסטט ובמלקחיים כדי לתפור את הצפק החל מקשר כפול בחלק הקדמי של החתך והמשך בתבנית תפר רציפה פשוטה עד לחלק האחורי של החתך.
השתמש בלולאה האחרונה כדי לקשור את התפר ולקצץ תפרים עודפים. לבסוף, מהדק את החתך סגור. לשם כך, הרם את העור בחלק הקדמי של החתך בעזרת מלקחיים קהים.
הקפידו להפריד את העור מהצפק. לאחר מכן, הנח את שיני המהדק סביב העור וכדי ללחוץ על המהדק, המשך להדק את החתך הסגור לקצה האחורי, מה שבדרך כלל דורש חמישה עד שבעה סיכות. לאחר שתסיים, הידוק, נגב את הפצע סביב הסיכות בעזרת כרית אלכוהול.
תן לסכר להתאושש על כרית החימום ולאחר מכן הנח אותה בכלוב חדש. כשהיא מתחילה להתעוות ולהתהפך, בדרך כלל לוקח לה בין 15 ל-90 דקות להתעורר כדי למזער את הכאב ואי הנוחות. אמהות מקבלות בופרנורפין עם ההתעוררות ובנקודות זמן מאוחרות יותר.
אם אי הנוחות ממשיכה למנוע התייבשות, הזריק לסכר מיליליטר מי מלח תת עוריים כשעתיים עד ארבע שעות לאחר הניתוח. לאחר 24 שעות לאחר הניתוח, הסכר אמור לחזור להתנהגות רגילה ולשתות ולאכול באופן קבוע. אנו נקצור את הרשתית האלקטרופוטרית ב-E 18.5 לניתוח.
לחלופין, אתה יכול לתת לסכר ללדת ולקצור את הרשתית בגילאים שלאחר הלידה לניתוח בגילאים מאוחרים יותר. לאחר הרדמת החיה, השתמש במספריים כדי לחתוך את העור והצפק מתחת לסיכות. כדי לחשוף את חלל הבטן וקרני הרחם, הסר עובר אלקטרופוט והצמיד את העובר דרך הגפיים לצלחת מנתחת, חתך את עור הבטן והצפק וחתוך את החלקים הצדדיים של כלוב הצלעות כדי לחשוף את הלב.
לאחר מכן, חודרים את החדר השמאלי בעזרת מחט הזלוף וחותכים את האטריום הימני בעזרת המספריים המיקרו. כעת התחל את הזלוף ואפשר ל-PFA לזרום במשך כ-60 עד 90 שניות. אם נעשה כהלכה, הדם צריך לצאת מהפרוזדור הימני והעובר צריך להיות חיוור.
לאחר סיום הזילוף, ערפו את ראש העובר ואספו ראשים ב-4% PF בבקבוקון חרוטי של 15 מיליליטר. חזור על הליך זה עבור כל העוברים האלקטרופוטיים וכל הסכרים. לאחר שתסיים לאסוף את כל העוברים, הקריבו את הסכר באמצעות נקע צוואר הרחם.
שמור על ראשים ב-4% PFA למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס ולאחר מכן שטוף ב-PBS במשך מספר ימים לאחר שטיפה עם PBS, כעת אתה מוכן לבחון את הרשתית לביטוי מוצלח של GFP. ראשית הצמד את הראש בכלי דיסקציה כשהרשתית פונה כלפי מעלה וטבול ב- PBS. הסר את העור מסביב לרשתית כדי לחשוף את אפיתל פיגמנט הרשתית או RPE באמצעות מחט בגודל 26 וחצי.
לנקב את הרשתית הגחונית בצומת RPE של העדשה. לאחר מכן, הכנס קצה אחד של המספריים המיקרו לחור זה ובצע חתך אנכי דרך הרשתית הגחונית לדיסק האופטי. זה יאפשר לך לכוון את הרשתית כשאתה מוציא אותה.
הפרד את ה-RPE מהרשתית על ידי אחיזת ה-RPE בחתך הגחון עם זוג מלקחיים אחד. והשתמש בזוג מלקחיים נוסף כדי לקלף את ה-RPE הרחק מהרשתית, במיוחד בצומת עדשת ה-RPE שבו ה-RPE מחובר היטב. לאחר הסרת ה-RPE, אחוז בעדשה עם מלקחיים ומשוך למעלה והרחק משם.
כדי להסיר את העדשה, הסר בזהירות את הרשתית על ידי הנחת מלקחיים מתחת לרשתית וצבט את ראש עצב הראייה כדי לשחרר את הרשתית. לבסוף מעבירים את הרשתית ל- PBS מלא. ובכן, הקפד לעקוב מאיזו רשתית הגיעה, אילו ראשים חוזרים על השלבים הללו עבור הרשתית הנגדית ועבור כל שאר העוברים האלקטרופוטים, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לסרוק את כל הרשתית לאיתור רשתית חיובית ל-GFP, מה שיצביע על כך שהאלקטרופורציה הצליחה בעובר זה וניתן לעבד את הרשתית והמוח המתאים לניתוח נוסף.
הליך אלקטרופורציה של הרשתית ex vivo דורש מספר שלבי הכנה נוספים הנבדלים מאלקטרופורציה ברחם. אנא עיין בפרוטוקול הכתוב למידע מפורט על הכנה וחמצון של מדיום נטול סרום והכנת מנות תרבית ומבחני גבול. לאחר הרדמת החיה, חלל הבטן נפתח כפי שהודגם קודם לכן וכל השרשרת העוברית מוסרת ומונחת ב-D-M-E-M-F 12 על קרח.
לאחר מכן יש להמית את הסכר באמצעות פריקת צוואר הרחם. השתמש במספריים כדי לחתוך את דופן הרחם, ואז להוציא עוברים משק מי השפיר ולאסוף ב-D-M-E-M-F 12 ולשמור על קרח ניתן להשליך עוברים ערופי ראשים ולשמור במדיום DMEA על גופי קרח. לאחר מכן, השתמש בפיפטה לפה או בפיפטה בוכנה ומלא מיקרו פיפטה בכמות הרצויה של תמיסת DNA.
ואז העבר אחד. גשו לצלחת חיתוך עם PBS והצמידו את צד הגב של הראש כלפי מעלה. עברו לטווח החיתוך של הזריקות.
אוקיי, עכשיו אנחנו מוכנים ל-electroprate. אני הולך להזריק את הדנ"א לגב ההיקפי של הרשתית ואז להזריק את הראש. אוקיי, הנה אני מתחיל.
השלב הראשון הוא הסרת העור מעל הרשתית. כדי לעשות זאת, נשתמש בפינצטה רק כדי לקלף את העור. כעת אנו יכולים לראות את החלק הגבי של שתי הרשתית.
בשלב הבא אני הולך להזריק DNA ממש מתחת לשכבת אפיתל פיגמנט הרשתית בשתי הרשתית. כדי לעשות זאת, אני הולך להחזיק את האלקטרודה במצב כמעט אופקי ולנקב דרך ה-RPE בחלק הגבי ההיקפי ביותר של הרשתית. אתה אמור לראות את הצבע הירוק ממלא את חלל הרשתית ודולף החוצה לתמיסת PBS.
אוקיי, עכשיו הגיע הזמן לאלקטרופורציה. ראשית אתה פותח את הראש. עכשיו אנחנו הולכים לטרוף את המשוטים ואנחנו רוצים שהמשוט החיובי יהיה בצד הגחון של הראש.
אז נניח את הראש בתוך המשוטים עם ההנעה החיובית על פני הגחון ונפעיל לחץ כדי לשמור על ההנעה יציבה כך. ועכשיו נערוך מצעד אלקטרו. אתם יכולים לראות את הבועות שנוצרות על ההנעה ועל החלק העליון של הראש.
וזהו. עכשיו נעביר את הראש לצלחת עם חציון. אז זהו עבור אלקטרופורציה של הרשתית ex vivo.
חזור על הליך זה עבור כמה עוברים ומצבי DNA שתרצה. עכשיו אנחנו הולכים להתכונן לתרבית הרשתית. לאחר השלמת כל ההכנות האלקטרו, הוסיפו כ-1.5 מיליליטר של תמיסת SFM מחומצנת לכלי ארבע בארות ושמרו אותה על קרח.
יש להזריק באר אחת לכל תמיסת DNA שונה. לאחר מכן, העבירו אחד אלקטרופורציה. גשו לצלחת חיתוך עם D-M-E-M-F 12 עם רשתית אחת פונה כלפי מעלה על רשתית הגחון או הצד שממול לאזור המטרה.
השתמש במלקחיים עדינים כדי לצבוט ולקרוע חור ב-RPE. השתמש בחור זה כנקודת התחלה כדי לקלף RPE לאחור מסביב לרשתית. אין לחתוך או לפגוע בעין מכיוון שהדבר יגרום לרשתית לקרוס על עצמה במהלך הדגירה.
לאחר הסרת ה-RPE השתמש במלקחיים כדי להוציא את הרשתית על ידי צביטה של עצב הראייה בבסיס הרשתית ולהשאיר את העדשה שלמה. מעבירים את הרשתית ל-SFM המחומצן בהיפוך צלחת ארבע בארות. עברו וחזרו על הסרת הרשתית עבור העין הנגדית.
השלם שלב זה עבור כל הראשים החשמליים ודגר את הרשתית ב-SFM המחומצן ב-37 מעלות צלזיוס למשך 40 עד 48 שעות. לאחר הדגירה של רשתית שלמה, העבירו את הרשתית מבאר אחת של SFM מחומצן למכסה צלחת פטרי עם D-M-E-M-F 12. באמצעות היקף חיתוך פלואורסצנטי, בחר רשתית אחת ודמיין חלק חיובי של GFP המבטא את הרשתית.
לאחר מכן, בעזרת מיקרו אזמל ומלקחיים, נתח והשליך את החלק החיובי של הרשתית שאינו GFP כך שיישאר רק נתח חיובי של GFP של הרשתית. זה מועיל לעבור ללא הרף בין אור פלואורסצנטי לרגיל לאורך כל הדיסקציה. כדי לבחור באופן ספציפי את הרשתית החיובית של GFP, העבירו את פיסת הרשתית החיובית של GFP לבאר עם G-M-E-M-F 12.
חזור על שלב זה עבור כל הרשתית מבאר אחת, עבור כל מצב DNA, השתמש בצלחת פטרי חדשה ובמדיום D-M-E-M-F 12 כדי לנתח את חלקי הרשתית החיוביים של GFP לתוך הרחבת רשתית קטנה יותר לציפוי. השתמש בטווח ניתוח כדי לחתוך את החתיכה הגדולה של הרשתית החיובית של GFP לאקספלן קטן יותר בעזרת אזמל מיקרו. ההרחבה צריכה להיות באורך וברוחב של כ-200 עד 300 מיקרומטר.
נתח רשתית חיובי אחד של GFP אמור לייצר כארבעה עד 10 GFP חיובי להסרת רשתית אסוף את כל האקספלן בבאר עם D-M-E-M-F 12. חזור על שלב זה עבור כל אזורי הרשתית החיוביים ל-GFP שנקצרים. לאחר הכנת כל אקספלן הרשתית החיובי של GFP הוסף 250 מיקרוליטר SFM קר בתוספת 0.4% מתיל צלולוז לכלי תרבית מצופים למינציה.
לאחר מכן, העבירו ארבעה עד שמונה אקספלן חיובי של GFP לצלחת התרבות והשתמשו במלקחיים כדי לסדר בעדינות את האקספלן X למצולע עם אקספלן x הממוקם באמצע הדרך בין המרכז לקצה המנה. קבע איזה צד של ה-X הוא שכבת ה-RGC. ניתן לעשות זאת על ידי חיפוש גבישי RPE, שיכולים לפעמים להישאר מחוברים לשכבת הרשתית החיצונית מה שמצביע על כך שהצד הנגדי הוא שכבת ה-RGC.
בצד ה-RGC יש בדרך כלל גם פסולת סלולרית שיכולה לסייע בהסבר הנכון עם שכבת ה-RGC למטה. השתמש במלקחיים כדי ללחוץ בחוזקה על מרכז האקספלן כך שהוא יידבק להחלקת כיסוי הזכוכית על בסיס צלחת התרבות. לאחר ציפוי כל אקספליין X על צלחת תרבית מעבירים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
צמחי רשתית X מציגים צמיחת אקסונים בשפע לאחר 24 שעות וניתן להשתמש בהם לבדיקות מבחנה רבות, ולאחר מכן לתקן עם 4% PFA למשך 30 דקות. וכתם חיסוני לבדיקת הגבול. העבר את ההסבר החיובי של 4G FP למנה שהוכנה לבדיקת הגבול.
סדר את ה-X explants בקו ישר המתקרב לגבול הפלואורסצנטי עם המצע המעניין שלך. תחת מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי, השתמש במלקחיים כדי לצלחת את ה-EXPLAN כך שהם יהיו במרחק של כ-50 עד 150 מיקרומטר מהגבול הפלואורסצנטי. לסירוגין בין שני ערוצי הפלואורסצנט כדי לדמיין את הרקע הירוק ואת הגבול האדום.
לאחר מכן דגרו כלים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות, מה שמאפשר מספיק זמן לאקסוני RGC להגיע למצע הגבול. לאחר מכן ניתן לתקן את X explan ב-4% PFA למשך 30 דקות ולאחר מכן צביעה חיסונית. בעקבות אלקטרופורציה של רשתית הרחם.
ניתן להכין תושבות חור רשתית כדי לדמיין R GCs חיוביים של GFP ברשתית ושלמים למחצה. ניתן להכין מערכות ראייה להמחשת אקסונים חיוביים של GFP בכל עצב הראייה, כיאזמה אופטית ודרכי הראייה. לחלופין, ניתן לבצע קטעי קריו קדמיים דרך מסלול הרשתית וה-RGC כדי לדמיין ולנתח גופי תאי RGC חיוביים ל-GFP ברשתית ובאקסונים בכיאזמה ובמערכת עצב הראייה.
כל האקסונים ברשתית מוצגים עם צביעה נוירופילמנטית. בנוסף ברחם, ניתן להשתמש באלקטרופורציה כדי לחקור מיקוד אקסון RGC בגרעין הגן הצדדי LGN על ידי קצירת גורים ב-P 4 עד P 10. ב-P שמונה אקסונים חיוביים GFP נראים ב-LGN עם תעלה אדומה CTB LOR 5 94 מוזרקת לרשתית המקבילה ו-CT bor 6 47 תעלה כחולה לתוך הרשתית הנגדית כדי לסמן את כל הקרנת ה-RGC לאחר אלקטרופורציה וציפוי ex vivo של שתלי רשתית.
תת-קבוצה של אקסוני RGC RGFP חיוביים וניתן לדמיין אותם בבירור הן בהספק נמוך והן בהספק גבוה יותר כפי שניתן לראות בתמונות העליונות והתחתונות בהתאמה. ניתן לנתח את התגובה של אקסונים חיוביים של GFP על ידי ציפוי XS בסמוך לגבולות של מצעים שונים המוצגים כאן בכחול. זה עתה הראינו לך כיצד להכניס גנים לרשתית שיקוף עוברית על ידי שימוש באלקטרופורציה של הרשתית ברחם ומחוץ לגוף.
בעוד שמיקדנו את הניתוח שלנו בהנחיית אקסונים של הכיאזמה האופטית, טכניקה זו יכולה להועיל לאלה החוקרים התמיינות RGC, מורפולוגיה דנדריטית ותכונות אלקטרופיזיולוגיות של תאי גנגליון ברשתית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור למזער את הנזק לרשתית בעת הזרקת ה-DNA ולשמור תמיד על לחות העוברים עם PBS לאורך כל הניסוי. אז זהו.
תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקות למניפולציה של ביטוי גנים בתאי גנגליון ברשתית עכבריים (RGCs) באמצעות אלקטרופורציה in utero ו-ex vivo. שיטות אלו מאפשרות לחוקרים לחקור את ההשפעה של שינויים בביטוי גנים על התפתחות RGCs ותכונות תפקודיות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירו-מדע
- גנטיקה
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- תאי גנגליון ברשתית חיוניים לעיבוד חזותי.
- הבנת ביטוי גנים ב-RGCs יכולה לחשוף תובנות לגבי התפתחותם.
- אלקטרופורציה היא שיטה המשמשת להכנסת DNA לתאים.
- מחקר זה מתמקד בטכניקות החלות על מודלים עכבריים.
מטרת המחקר
- להדגים שיטות למניפולציה גנטית ב-RGCs.
- להעריך את ההשפעות של שינויים בביטוי גנים על התנהגות RGCs.
- לספק פרוטוקול לחוקרים בתחום.
שיטות ששימשו
- אלקטרופורציה in utero של תאי רשתית עובריים.
- אלקטרופורציה ex vivo של שתלי רשתית מתורבתים.
- הזרקת פתרונות DNA לתוך הרשתית.
- ניתוח של התפתחות הרשתית ושל קרני ראייה.
תוצאות עיקריות
- הכנסה מוצלחת של DNA לתאים מבשרים של RGCs.
- תצפית על ביטוי GFP המעיד על אלקטרופורציה מוצלחת.
- ניתוח של מבנה הרשתית ונתיבי הקרנה.
- הדגמה של השפעות מניפולציה של ביטוי גנים על RGCs.
מסקנות
- הטכניקות המוצגות יעילות למניפולציה גנטית ב-RGCs.
- שיטות אלו יכולות לקדם את ההבנה של התפתחות הרשתית.
- מחקרים עתידיים יכולים לבנות על פרוטוקולים אלו למחקר נוסף.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Efficient gene manipulation in retinal ganglion cells (RGCs) is critical for de-risking early discovery in neuro-ophthalmic research and for clarifying gene function in neural circuit development. The described in utero and ex vivo electroporation techniques enable targeted genetic perturbation in murine RGCs, supporting predictive confidence in pathway analysis and mechanistic studies. These capabilities directly impact target validation and translational continuity for neurodevelopmental and vision-related therapeutic pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in RGC differentiation and axon guidance.
- Supports mechanistic de-risking by allowing gene misexpression or downregulation in a controlled in vivo context.
- Facilitates functional target validation through observation of axon projections and pathway decisions.
- Provides a platform for hypothesis-driven studies on neural development and connectivity.
Screening & Assay Development
- Prepares validated RGC systems for downstream in vitro assays and substrate response studies.
- Delivers reproducible and quantifiable outputs via GFP expression and axon growth measurements.
- Enables scalable preparation of retinal explants for compound or guidance cue screening.
- Supports assay standardization by isolating gene-specific effects in otherwise wild-type backgrounds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying axon targeting and synaptic organization.
- Maintains translational continuity from gene perturbation to phenotypic readouts in neural circuits.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by linking gene function to developmental outcomes.
- Provides mechanistic insights that can be leveraged for biomarker identification in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
These electroporation methods position gene function studies at the intersection of early discovery and preclinical model development, bridging in vivo validation with in vitro mechanistic assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on gene roles in RGC development and axon projection.
- Screening: Enables preparation of explants for quantitative axon growth and substrate response assays.
- Analytics: Provides measurable outputs such as GFP expression and axon trajectory mapping for comparative analysis.
- Translational Research: Connects gene perturbation to functional outcomes relevant to visual system disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for gene manipulation across multiple neural development studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene function and neural pathway mapping.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable gene delivery in RGCs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by clarifying mechanistic underpinnings of neural development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets and pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic microsurgery and retinal dissection.
- Demands access to electroporation equipment and fluorescence imaging infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptation may be needed for different developmental stages or genetic backgrounds.
- Careful handling is essential to minimize tissue damage and ensure embryo viability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:07
Introduction
1:46
In utero Retinal Electroporation - Injecting and Electroporating DNA into E14.5 Murine Retinae in vivo
8:40
In utero Retinal Electroporation - Retrieval of Electroporated Retina at E18.5
12:34
Ex vivo Retinal Electroporation - Injecting and Electroporating DNA into E14.5 Murine Retinae in vitro
18:49
Ex vivo Retinal Electroporation - Harvesting and Plating of GFP+ Retinal Explants (2 days post-electroporation)
23:33
Representative Results from in utero and ex vivo Retinal Electroporations
25:23
Conclusion
