פקטור מצופה צמיחה השמה ביד על Explants forebrain הגבי
30 בינואר 2007
וידאו זה מדגים שתי שיטות להכנת והצבת חרוזים, אשר היה מצופה גורם הגדילה, על explants של קליפת המוח המתפתח. חרוזים אלה יכולים לשמש כדי לעורר ביטוי גנים מוגבל מרחבית על פיתוח רקמות עצביות כגון explants forebrain. שיטות ניתנים לשימוש הן Affi-Gel חרוזים חרוזים acryllic הפרין.
אלו הם הסוג הראשון של החרוצים שבהם אשתמש. אלו הם חרוזי ג'ל כחולים. הם רכים.
לכן, עלי להשתמש בפיפט זכוכית מרוכזת בקצה של פיפט פה כדי להניח את החרו지를 על Xs. הסוג השני של חרוזים שאדגים הם חרוזי Heparin acrylic. אלו הם חרוזים מסוג קשיח, ואני אניח חרוזים אלו על explants של X באמצעות מחט טונגסטן. אלו הם צינורות הנימיות מזכוכית שאמיס תחילה באמצעות מבער בונסן.
לאחר מכן אני אמשוך אותם כדי ליצור חוד דק יותר. אני מחזיק את צינור הנימי במרכז הלהבה ומגלגל אותו בזמן שהצינור נמס. אני יכול להרגיש שהוא הופך לרך.
אני אגביה אותו מהלהבה ואז אמשוך אותו. אני עומד לחרוץ קו לרוחב צינור הקפילרה באמצעות עט זה עם חוד היהלום, כדי שאוכל לבצע חיתוך ישר ונקי. לאחר מכן, אבצע ליטוש בלהבה לקצוות כדי לנקות אותם.
אעביר את הקפילרה דרך הלהבה כדי להחליק את הקצה ולהקטין את הפתח, כך שהיא תוכל ללכוד חרוד במקום שהחרוד יעבור דרך הקפילרה. נקודה חשובה שצריך לשים לב אליה היא שאין להחזיק את צינור הקפילרה בלהבה זמן רב. מדובר למעשה במעבר מהיר מאוד, אחרת הוא ייסגר.
בדרך כלל אני מכין כמה כאלו, כיוון שבבנייה של רבים מהם הקצה נסגר על ידי הלהבה. קשה לשלוט בכך, לכן פשוט מכינים מספר יחידות. זוהי דוגמה לאחד שבו הקצה נסגר.
זהו דוגמה לפיפט תקין. שפפתי 250 µL של חרוזי agel למבחנה זו מסוג einor, ואני עומד לשטוף אותם חמש פעמים עם 1 mL של PBS כדי להסיר את תמיסת ה-azi שבה הם השרו. אמתן כமூן דקות כדי לאפשר לחרוזים לשקוע, ולאחר מכן אשאב את עודפי ה-PBS ואחזור על הפעולה ארבע פעמים נוספות.
החרוצים עדיין לא שקעו לחלוטין, כעת החרוצים שקעו ואני אשאב את ה-PBS העודף ואחזור על פעולה זו ארבע פעמים. ובסיום אוסיף 300 microliters של PBS ואתחיל לעבוד עם החרוצים. זוהי פיפטה רגילה (mouth pipette), אני פשוט אקח את הקפילרה שמשכתי ואדחף אותה פנימה עד לשליש מהגובה.
ראשית, מלאו את הפפיטות ב-PBS. בדרך כלל המילוי מתבצע באמצעות פעולת נימיות. כאן מופיע מכסה של צלחת תרבית של 30 מילימטר, ועליו הנחתי טיפה של חרוזים בכחול.
ולצדו טיפה קטנה של PBS. ובצלחית זו נמצאות טיפות של 5 µL של תמיסת חלבון. במקרה זה, מדובר ב-B and P four, אך ניתן להשתמש בחלבון לבחירה באמצעות פיפטה ידנית.
אני עומד להעביר חרוץ מהמעגל הכחול הזה, לשטוף אותו פעם אחת בטיפת PBS. לאחר מכן, אקח את החרוץ באמצעות פיפטה פיו (mouth pipette) ואניח אותו בטיפה של תמיסת חלבון, ואדגרו אותו בטמפרטורת החדר למשך כשעה או ב-4°C למשך מספר שעות. כפי שניתן לראות, יש כאן מאגר של חרוצים ב-PBS ועלי לבחור חרוצים בגודל המתאים.
אם הן קטנות מדי, הן פשוט יעברו דרך פיפטת הפה. הן צריכות פשוט להישאר בקצה. כעת אתם רואים שבחרתי שם מספר חרוצים, שלושה חרוצים גדולים ושלושה חרוצים קטנים.
אשתמש בחרוזים הגדולים יותר בניסוי. כעת אעביר חרוז גדול מטיפת ה-PBS אל טיפת תמיסת החלבון. כדי לעשות זאת, אמשוך בעדינות את לשוני לאחור מהפיפטית הפה.
זו אינה תנועת שאיבה, אלא פשוט הפעלת לחץ שלילי. לאחר מכן אעביר אותו ואחזיר את הלשון מעל הפיה. ראש הצינור, לא נשיפה, אלא פשוט הוספת לחץ חיובי כדי לדחוף את החרוז החוצה מהקצה.
כעת יש לי חמישה חרוצים בטיפת תמיסת החלבון, ואדגיר אותם בטמפרטורה של 4°C למספר שעות, או לחלופין בטמפרטורת החדר למשך חצי שעה עד שעה. זוהי צלחת התרבית המכילה את הממברנה הצפה במדיום יחד עם ה-eggplants שכבר דיסקתי. אשתמש בקצה הפיפטה שלי כדי לשאוב מעט מהמדיום.
אני עומד לשטוף את החרוצים בטיפה של מצע פעם אחת בלבד, מיד לפני שאני מניח את החרוץ על משטח ה-X. אלו הן מחטי התונגסטן שבהן אשתמש כדי להרים ולהניח את חרוצי האקריליק. זוהי מחט התונגסטן, והיא נמצאת כעת במחזיק שלה.
אלו הן פינצטות איכותיות, בזווית של 45 מעלות. אשתמש במחט טונגסטן בפינצטות כדי להרים חבב מתוך מאגר ה-PBS ולהעביר את החבב לטיפה של תמיסת חלבון.
בדומה למה שעשיתי עם חרוזי הג'ל. כמו עם חרוזי הג'ל, שטפתי את חרוזי האקריליים הללו חמש פעמים ב-PBS והעברתי טיפה לצלחת זו. לאחר מכן אשתמש במחט טונגסטן המוחזקת בפינצטה כדי להעביר חרוד לטיפה של חלבון ולהדגיר בדיוק כפי שעשיתי עם חרוזי הג'ל.
אם כך, מדובר בהרמה של חרוץ. אני מניח את ידי הימנית בחוזקה על השולחן, ומשתמש באצבע השמאלית כדי לייצב את המחט בזמן הירידה אל הנוזל; אני נוגע קלות בחרוץ בעזרת המחט ומרימ אותו באיטיות מהנוזל. לעיתים הוא נופל מהמחט, ובמקרה כזה פשוט חוזרים כדי להרים חרוץ אחר.
כעת, בידי השמאלית, אחזיק בפינצטה בזווית של 45 מעלות. כאשר הקצוות פונים כלפי מטה, אגע בחרוז ובמחט בנוזל. אשתמש בקצה הפינצטה כדי ללחוץ עליהם בעדינות כדי לשחררם.
כעת יש לי חמש חרוזי חלבון. בסדר, ביד ימין אני מחזיק את מחט הטונגסטן בתוך החרוד, וביד שמאל את הפינצטה שוב עם הקצה כלפי מטה, באותה דרך שבה דחפתי אותם מהארבעה, אעשה זאת שוב כאן על ה-x explan. יש להדגיר ב-37 °C והזמן תלוי במבחן הספציפי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים שתי שיטות להכנה ולהצבה של חרו지를 מצופים בגורם גדילה על אקספלאנטים של קליפת המוח (cerebral cortex) המתפתחת. חרוזים אלו יכולים להשרות ביטוי גנים מוגבל מרחבית ברקמה עצבית מתפתחת, כגון אקספלאנטים של המוח הקדמי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- ביטוי גנים
רקע
- ניתן להשתמש בחרוצים כדי להשפיע על ביטוי גנים ברקמות עצביות.
- סוגים שונים של חרוצים בעלי תכונות פיזיקליות משתנות המשפיעות על יישומם.
- הבנת שיטות אלו היא קריטית למחקר בתחום מדעי העצבים ההתפתחותיים.
- גורמי גדילה ממלאים תפקיד משמעותי בהתפתחות העצבית.
מטרת המחקר
- להדגים את ההכנה והיישום של חרוזיים מצופים בגורמי גדילה.
- להראות כיצד ניתן להשתמש בחרוזיים אלו על תרביות רקמה (explants) של קליפת המוח.
- לספק לחוקרים שיטות מעשיות להשראת ביטוי גנים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת חרוזי ג'ל כחולים באמצעות פיפטת זכוכית מרוכזת.
- יישום חרוזי אקריליים עם הפרין באמצעות מחט טונגסטן.
- התכת צינורות נימי זכוכית להצבה מדויקת של החרוזים.
- הדגמה של טכניקות עבור שני סוגי החרוזים.
תוצאות עיקריות
- הושגה הצבה מוצלחת של חרוצים על על גבי אקספלאנטים.
- שני סוגי החרוצים הודגמו ביעילות.
- ציפוי גורם הגדילה סייע להשראת ביטוי גנים.
- ניתן לשחזר את השיטות עבור מערכי ניסוי דומים.
מסקנות
- השיטות המוצגות יעילות למניפולציה של ביטוי גנים ברקמות עצביות.
- חוקרים יכולים להשתמש בטכניקות אלו למחקרים נוספים במדעי העצבים ההתפתחותיים.
- הבנת תכונות החרוצים חיונית ליישום אופטימלי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הספקה מבוקרת מרחבית של גורמי גדילה לאקספלנטים עצביים מאפשרת בחינה מדויקת של מסלולי איתות התפתחותיים, ובכך תומכת בתיקוף יעדים בשלבים מוקדמים בביולוגיה של מערכת העצבים. מיקום כמותי של חרוצים מצופים מקל על מחקרים מונחי-השערה של ביטוי גנים מקומי, ומפחית עמימות מכניסטית בניתוח מסלולים. גישה זו מחזקת את הביטחון החזוי עבור סריקות המשך ומחקר תרגומי במודלים של הפרעות התפתחותיות נוירולוגיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הובלה מקומית של מולקולות סיגנלינג כדי לנתח את תפקוד הנתיב ברקמה עצבית.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות מועמדות על ידי השראה של ביטוי גנים מוגבל מרחבית.
- מקל על הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד השפעותיהם של גורמי גדילה ספציפיים על התפתחות האקספלנט.
- משפר את הביטחון החזוי לקידום מטרות התפתחותיות-עצביות בפורטפוליו.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות של רקמות מושתלות (explants) עם מדרגי גורמי גדילה מוגדרים לצורך סריקת פנוטיפ בהמשך התהליך.
- מתקנן את מיקום החרו지를 ואת הדגירה כדי להבטיח תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור.
- מאפשר התרחבות של הבדיקה (scalability) ושימוש חוזר בפלטפורמה על ידי התאמת סוגי החרוזים וכלי המיקום.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות תרכובות בהקשרים ביולוגיים מבוקרי מרחב.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים של רבטילי (explants) in vitro לתהליכים התפתחותיים רלוונטיים למחלה לצורך רציפות תרגומית.
- מספקת בסיס לגילוי סמנים ביולוגיים (biomarkers) הקשורים לשינויים בביטוי גנתי מרחבי.
- מסייעת בקבלת החלטות על קידום מבוסס התאמת סיכונים על ידי הבהרת השפעות ספציפיות למסלולים במודלים פרה-קליניים.
- משפרת את הפחתת הסיכונים החזויה עבור אסטרטגיות טיפוליות בנוירו-התפתחות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו למיקום חרוצים משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ומגשרת בין בדיקת השערות, תיקוף מטרות ופיתוח בדיקות למחקר נוירוביולוגי.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך במניפולציה מונחית-השערה של מסלולי איתות בתרביות של רקמה עצבית (explants).
- סריקה: מספק מערכות ניתנות לשחזור ובקרת מרחב עבור בדיקות פנוטיפיות כמותיות.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה של ביטוי גנים מקומי והפעלה של מסלולים בתגובה להגשת גורמי גדילה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים במבחנה (in vitro) למודלים פרה-קליניים של הפרעות התפתחותיות נוירולוגיות, כאשר אלו עולים בקנה אחד עם מנגנוני המחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה מודולרית הניתנת להתאמה לגורמי גדילה ולמערכות רקמה שונות לשימוש חוזר בתוכניות מחקר שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בניתוח מסלולים.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה סטנדרטיים וניתנים לשחזור להכנה והצבה של חרוצים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go ואת יעילות ההון על ידי הבהרת הרלוונטיות של המטרה בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של מטרות ומסלולים נוירו-התפתחותיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות טכנית במיקרו-מניפולציה ובטיפול בתרביות אקספלאנטים.
- נדרשת גישה לכלים מיוחדים כגון פיפטות זכוכית דקות ומחטי טונגסטן.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת חרוצים והצבתם.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור סוגי אקספלאנטים שונים או פורמולציות שונות של גורמי גדילה.
- מגבלות מעשיות כוללות את בחירת גודל החרוץ ושמירה על שלמותו במהלך ההצבה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:45
Types of beads: Affi-Gel and Heparin Acrylic
1:13
Affi-Gel bead placement
14:32
Example of obtained results
11:27
Preparation of acrylic beads
1:18
Preparation of glass capillaries
3:47
Preparation of Affi-Gel beads
13:31
Acrylic bead placement on explant
9:32
Affi-Gel bead placement on explant
