Name: מסיק והכנת תסיסנית עוברים הקלטה אלקטרו ונהלים אחרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: למד כיצד לבצע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בעוברי Drosophila באמצעות ניתוח מבוקר עם דבק כירורגי. שיטה זו חושפת את מערכת העצבים והשרירים לחקר התפתחות נוירומוסקולרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

KB הוא נתמך על ידי NIH מענק GM54544.

חלק 1: ציוד ואספקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ לנתיחה טוב נדרש והניתוחים העובר; הגדלה 40X הוא הציע, עם עיניים חתיכות 25X כדי להגדיל הגדלה מקסימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים פיין (מספר 5) נדרשים עבור בחירה ידנית של עוברים devitellinization של עוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד ליצור ולשנות מחטים זכוכית עדין נדרשת. משך זכוכית מחטים נדרשים עבור הניתוח. אנחנו מעדיפים זכוכית מוצקה לנתיחה (האחרון יותר), אבל צינורות תקן קירות זכוכית עבה (קוטר חיצוני 1-1.5 מ&quot;מ) עובד גם כן. כמה אנשים משתמשים במחטים טונגסטן בסדר, electrolyzed כדי החדות הרצוי באמבט של 1M NaOH באמצעות סוללה 10 + Amp autotransformer. חידד לנתיחה מחטים טונגסטן נהנים כי הם עמידים יחסית לטווח ארוך. מחטים זכוכית חלולים (בדומה נוצר כתם אלקטרודות מהדק) מחוברים צינורות פלסטיק המשמשים במהלך לנתיחה עבור יניקה גירוש מלוחים, כמו גם במסירה מבוקרת של דבק. מגוון מושכי זכוכית זמינים עבור ייצור זכוכית מחטים. המחשב מתוכנתים מראש מושכי ניתן למשוך מגוון רחב של צורות וגדלים. בראון-Flaming מודלים (סאטר Instrument ושות) הם העדיפו נרחב. מיקרוסקופ המתחם (20-40X המטרה) צריכים להיות זמינים כדי לבדוק ולשנות אלקטרודות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני סוגים של פתרונות נפוצים אמבטיה הרקמות עובריים במהלך דיסקציה: 1) &quot;רגילה&quot; (יאן יאן, 1976a) או &quot;תקן שונה&quot; (Broadie, 2000) salines, המבוססת על פתרונות נפוץ במערכות הקלטה חוליות אחרים , ו 2) &quot;haemolymph דמוי&quot; (HL) salines (סטיוארט et al 1994), פשרה בין מלח רגיל הריכוזים יוניים נמדד haemolymph תסיסנית. יצוין, כי אף אחד salines אלה לחקות במדויק את ההרכב הכימי של haemolymph in vivo (Broadie, 2000). התקן מכיל מלח (מ&quot;מ): 135 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, 1.8 CaCl 2, 72 סוכרוז, 5 TES, pH 7.2. הניסויים מומלץ גם לשקול מלוחים חרקים מוכן מסחרית (Media חרקים למשל של שניידר), אשר אינו מתאים הקלטה אלקטרו אבל הסיכוי הטוב ביותר להגן על בריאות רקמות חשוף. </li></ol> חלק 2: קביעת העובר Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אוסף ביצה אופטימלי, לשמור על הצעירים (&lt;7 ימים), זכר בריא זבובים הנקבה (20-40) על סירים הנחת טרי במשך 2-3 ימים. סירים הנחת כלל מורכב 100 מ&quot;ל כוסות פלסטיק (Tri-יוצקים) מחורר כדי לספק זרימת אוויר נאותה, המשתרעים על צלחת אגר 60 מ&quot;מ. צלחות אגר להכיל תפוחים או מיץ ענבים מוקשה עם אגר. קיימים מספר מתכונים, אך דוגמה אחת היא כדלקמן: 700 מ&quot;ל מים, 25-30 גרם אגר, 300 מ&quot;ל של מיץ להתרכז (ענבים או תפוח), 0.5g מתיל paraben (p-hydroxymethylbenzoate), סוכר 30G. החיטוי המים אגר, ובנפרד לרתיחה p-hydroxymethylbenzoate עם הסוכר ומיץ. מערבבים את אגר פתרונות מיץ במהירות לשפוך לתוך צלחות 60 מ&quot;מ, הסרת בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני איסוף ביצים, זבובים ניזונים עם הדבק שמרים (7 גרם שמרים האופה ב 9 מ&quot;ל מים המאוחסן ב 4 ° C) על צלחות טריים, השתנה לפחות פעמיים ביום במשך לפחות יומיים. ביום 3, סיר טוב צריך לייצר 100-200 ביצים לשעה. הנחת ביצה טובה יותר היא נצפתה על סיר שמרו על צידו עם אגר בצלחת שרוט. עוברים רבים יהיה מונח בתוך או ליד שריטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף מספר גדול של עוברים, בעדינות העברת עוברים מצלחת אגר לתוך סל באמצעות מכחול. סל יכול להתבצע עם צינור 15 מ&quot;ל או 50 צנטריפוגות. חותכים את תחתית עוזב פני השטח מספיק כדי ללכוד מסך (70 מיקרומטר רשת) בין המכסה העליון של הצינור. שוטפים את העוברים עם DH 2 0 והכניסו בצלחת פטרי של אקונומיקה 50% עד 100% טרי להסיר את סיסית החיצונית. לחלופין, ניתן לאסוף ביצים בנפרד באמצעות מלקחיים בסדר, dechorionated ידי הצבת אותם באופן ידני לתוך ירידה של אקונומיקה. De-chorionation יכול לקחת בין 30 שניות עד 2 דקות (אקונומיקה טרי הוא הרבה יותר מהר), ואת צריכה להיות במעקב תחת מיקרוסקופ לנתיחה. הסרת סיסית חושף את מבריק, שקוף קרום vitelline. ביצים Dechorionated יש לשטוף קצר, או להציב מלוחים, כמו אקונומיקה במהירות הורס רקמות devitellinized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה קריטי כדי בזהירות בשלב עוברי לגיל ההתפתחותי הרצוי. הגדיר תסיסנית בשלבים עובריים (1-17; קמפוס, אורטגה Hartenstein, 1985) אינם מועילים, כמו כל פיתוח neuromuscular תפקודית מתרחשת בשלב מאוחר או 16 שלב 17. כך, עוברים הם מבוימים על ידי שעות התפתחותי של 25 מעלות צלזיוס חממה humidified, שעות לאחר ההפריה או, בדרך כלל, לאחר הנחת ביצה (AEL). בתנאים אלה, embryogenesis נמשך 21 + / - 1 שעה בשעה 25 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצים מתוזמן הביצה שכבה (1-2 שעותים) כי הם בני כראוי נתפסים הבא קריטריונים מורפולוגיים. אחרי כביסה נרחב DH 2 O, הביצים dechorionated ממוקמות בצלחת תרבות פלסטיק (תחת DH 2 O) לצורך צפייה. בימוי נכון ניתן לאשר קריטריונים מורפולוגיים באמצעות האור המוחזר עם מיקרוסקופ דיסקציה (קמפוס, אורטגה Hartenstein, 1985). בוגר בשלב מאוחר עוברי (22-24h AEL) על סף הבקיעה מוכרים בדרך כלל על ידי פילוח לציפורן, קנה הנשימה מנופח. עוברים יכול להיות גם genotyped באמצעות GFP balancers ו מיקרוסקופ פלואורסצנטי דיסקציה עם מסננים מתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לנתיחה, עוברים dechorionated ו התפתחותית מבוים מחוברים (צד הגב למעלה) על coverslip תחת טיפת מלח (ראה שלב 1.5). עוברים יוסרו מן הקרום vitelline על ידי ניקוב הממברנה סמוך לקצה הקדמי או האחורי עם micropipette כוס או מחט טונגסטן, ולאחר מכן לשחרר בעדינות את העובר מן הממברנה. לקראת לנתיחה, העובר צריך להיות ממוקם על coverslip עם את פני השטח הגבי (צד הגב עד לנתיחה יחשוף את מערכת העצבים ואת הגחון neuromusculature לניסויים. עם זאת, ברור העובר יכול להיות ממוקם בדרכים אחרות כדי להקל את הגישה אחרים רקמות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים בשלב מוקדם (&lt;16 שעות AEL) לצרף ישירות לנקות זכוכית או זכוכית מצופה polylysine (poly-L-ליזין hydrobromide; Broadie ו בייט, 1993a, b). עוברים מבוגרים יותר (&gt; 16 שעות AEL), לאחר היווצרות לציפורן, חייב להיות דבוק, באופן אידיאלי Sylgard מצופה (Dow Corning) coverslips. דבק מים polymerizing כירורגי או וטרינרי cyanoacrylate משמש (Broadie ו בייט, 1993c, ד). דבק מועברת באמצעות פיפטה אלקטרודה זכוכית קטנה (10-20 קצה הפנימי מיקרומטר קוטר) מחוברת צינורית גומי עם הזרם דבק בשליטת לחץ פה. יש להקפיד במהלך הלידה דבק, כמו דבק polymerizes במהירות על קשר עם מי מלח. שים לב גם כי הדבקה לא יכול להתבצע ללא מלח או נמוך ריכוזי יון divalent, כמו דבק דורש יונים divalent כדי לפלמר. כמויות קטנות של דבק משמשים הראשון בתוקף לצרף את הראש והזנב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סיום של העובר מודבקות coverslip, מבצעים חתך לאורך קו האמצע הגב עם אלקטרודות זכוכית או מחט טונגסטן חידד. זה נעשה קל יותר בעדינות על ידי ניקוב את קו החתך לפני ביצוע החתך הסופי. הצדדים של החתך מחוברים אז coverslip עם דבק יותר, בעדינות כדי להפיץ את שטוח העובר. איברים פנימיים, כולל המעי, גופים שומן, אופציונלי, קנה הנשימה יוסרו מכן על ידי יניקה בעזרת פיפטה זכוכית המחובר בצינור גומי (Broadie בייט ו 1993a-c). העובר כעת אמור להיות מצורף שטוח coverslip, האפידרמיס למטה עם הגחון מערכת העצבים המרכזית, העצבים ההיקפיים, השרירים ואת סומטיים חשוף לניסויים. </li></ol>

בימוי מדויק של עוברים הוא קריטי עקב ההבשלה המהירה של מאפיינים פונקציונליים במשך תקופה של רק כמה שעות. מספר נושאים לסבך זה הזמני. ראשית, רוב החוקרים להשתמש ביצה מתוזמן מטילה על עוברי הבמה, אבל הפעם ההטלה יכול להשתנות מאוד מן החי חיים בתנאים שונים (Broadie et al. 1992). בפרט, נשים בדיאטה מוגבלת נוטים לשמור על הביציות המופרות לתקופות ממושכות לפני הנחת. זה קריטי, ולכן הנקבות &quot;צלול&quot; על ידי האכלה בדיאטה שמרים עשיר לפחות 2 ימים לפני איסוף ביצים (Broadie et al. 1992). יתר על כן,...

<table><tbody><tr><td>כלובים לאסוף עוברים</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 (עבור צלחית 60 mm; גדלים אחרים זמינים)</td><td>ניתן להכין כלובים באופן עצמאי באמצעות ביקרים בעלי שלושה פיות מנוקבים, כפי שמוצג בסרטון</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>זמין מחברות שונות</td><td>דבק כירורגי נצמד טוב יותר לכיסויי זכוכית מצופים ב-sylgard</td></tr><tr><td>צינורית זכוכית דקה, קוטר חיצוני 1.0-1.5 mm</td><td>שונות</td><td></td><td>למשיכה למחטים דקות מזכוכית עבור דיסקציה ולצינורות להגשת דבק</td></tr><tr><td>צינור פלסטיק, לחיבור לפיפטת זכוכית עבור שאיבה באמצעות הפה והחלת דבק</td><td>Tygon</td><td></td><td>הקוטר הפנימי של הצינור צריך להתאים לקוטר החיצוני של הזכוכית.</td></tr></tbody></table>

מסיק והכנת תסיסנית עוברים הקלטה אלקטרו ונהלים אחרים

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

תסיסנית הוא מודל גנטי המוביל במחקר של פיתוח הן עובריים המוח תפקודית. באופן מסורתי, בתחומים אלה הם די מבודדים אחד מהשני, עם היסטוריה עצמאית במידה רבה קהילות מדעיות. עם זאת, הממשק בין שדות אלה נבדלים בדרך כלל התוכניות התפתחותית תפקודית הבסיסית רכישת נכסים איתות חשמלי הבחנה של סינפסות כימיות תפקודית במהלך השלבים האחרונים של הקמת מעגל עצבי. ממשק זה הוא אזור חשוב ביותר לחקירה. ב תסיסנית, אלה שלבים של התפתחות תפקודי להתרחש בתקופה של &lt;8 שעות (במהירות של 25 ° C) במהלך השליש האחרון של העובר. תקופה זו התפתחותי מאוחר נחשב ארוך סורר אל בשל חקירה בתצהיר של הציפורן, קשה אפידרמיס חדיר. מראש היה פריצת דרך ביישום של דבק מים polymerizing כירורגית כי ניתן להחיל באופן מקומי כדי לאפשר לציפורן לנתיחה מבוקר של עוברים בשלב מאוחר. עם חתך אורכי הגבי, העובר יכול להיות מונח שטוח, חשיפת עצבים בחוט הגחון ועל קיר שרירי הגוף חקירה ניסויית. מערכת זו הייתה בשימוש רב לבודד ולאפיין מוטציות גנטיות הפוגעות במבנה סינפסה העוברית, וכך לגלות את המנגנונים המולקולריים השולטים מפרט והבחנה של קשרים סינפסה ופונקציונלי תכונות האיתות הסינפטי.

טכניקה זו חושפת את neuromusculature עובריים תסיסנית עבור אימונוהיסטוכימיה או הקלטה אלקטרו. זה שימושי לחקר אירועי מוקדם בהתפתחות neuromuscular או ביצוע electrophysiology ב מוטנטים שאינם יכולים לבקוע.

Drosophila היא מודל גנטי מוביל לחקר ההתפתחות העוברית והנוירוביולוגיה הפונקציונלית כאחד. באופן מסורתי, תחומים אלו הם למדי...

כדי לבצע רישומים אלקטרופיזיולוגיים בעוברים של דרוזופילה, יש ראשית לאסוף אותם, לסנכרן אותם ולבצע להם דיסקציה; דיסקציה מבוקרת מתאפשרת באמצעות דבק כירורגי פולימרי על בסיס מים, המייצב את העוברים על סלייד כיסוי. לאחר מכן, האיברים הפנימיים מוסרים מהעוברים המיוצבים כדי לחשוף את מערכת העצבים המרכזית (CNS) הגחונית, את העצבים ההיקפיים ואת השרירים הסומטיים. שלום, אני דייב פדרסטון מהמחלקה למדעי הביולוגיה כאן באוניברסיטה של אילינוי בשיקגו.שלום, אני טון מהמעבדה של דייב פדרסטון במחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת אילינוי בשיקגו. היום נראה לכם כיצד לאסוף ולבצע דיסקציה ידנית של עוברים בשלבים מאוחרים של Joof. אנו משתמשים בהליך מעבדה כללי זה כדי להתכונן לבדיקת אלטרנטיבה חשמלית של התפתחות ותפקוד המערכת העצבית-שרירית של joof, שאראה לכם במצגת Jo Ova קרובה.בואו נתחיל. פרוטוקול זה מתחיל באיסוף עוברים, הליך נפוץ המשמש במגוון ניסויי joof, אותו נסקור כעת. הקימו תערובת של 20 עד 40 זבובים זכרים ונקבות צעירים בכלי הטלה.שכנו אותם בתא לח ובטמפרטורה של 25 degrees Celsius. כדי להעריך במדויק את שלב ההתפתחות של העובר, יש לשמור על טמפרטורה ולחות עקביות. למרות שניתן להשיג כלי הרטבה מסחריים, ניתן להכינם מכלי פלסטיק מחוררים בעובי 100 mil המותאמים לפלטות apple auger בקוטר 60 millimeter.ניתן למצוא את המתכון למצע התפוח (appl

harvesting-preparing-drosophila-embryos-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים את הכנת תרבויות עצבי ראשוני midgastrula עוברים שלב תסיסנית. צפיות של תרבויות לחיות להראות תאים 1 שעה לאחר ציפוי הנוירונים הבדיל אחרי 2 ימים של גידול בינוני ביקרבונט מבוססי מוגדר. הנוירונים הם להתרגש חשמלית וליצור קשרים סינפטיים.

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

שיטה פשוטה, זולה, יעילה של הכנת עוברים תסיסנית לניתוח לחיות הדמיה מוצג. פרוטוקול שלנו מספק לחות חילוף הגזים ולא לדחוס את העובר תסיסנית. שיטה זו מתאימה עבור הדמיה GFP מבוססי לחיות עוברים תסיסנית באמצעות מיקרוסקופ stereomicroscope או תרכובת זקוף.

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

אנו מתארים תהליך להטבעת קיבעון, חתך, הדמיה של שלב...

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

כאן אנו מתארים שלם הר...

הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

מטרת פרוטוקול זה היא לספק גישה פשוטה וזולה לאיסוף עוברים תסיסנית בקנה מידה בינוני (0.5-1 גרם) והכנת תמציות חלבון שניתן להשתמש ביישומים proteomic במורד הזרם, כגון זיקה טיהור ספקטרומטריית מסה (AP-MS ).

הכנה בינונית של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים

עבודה זו מתאר פרוטוקול עבור הדור של רזולוציה גבוהה בחיי עיר ויטמינצ'יק ספריות מ מבוים בחוזקה gastrulation קדם דרוזופילה melanogaster עוברי.

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

אנו מתארים שיטה עבור מעקב נסיגה של הנוירונים המנוע העובריים מוטוריים באמצעות צבעי פלורסנט ליפופילית.

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

התכווצות אקטומיוזין ממלאת תפקיד חשוב במורפוגנזה של תאים ורקמות. עם זאת, זה מאתגר לתפעל התכווצות actomyosin in vivo בחריפות. פרוטוקול זה מתאר מערכת אופטוגנטית המעכבת במהירות את התכווצות האקטומיוזין בתיווך Rho1 בעוברי דרוזופילה , וחושפת את האובדן המיידי של מתח אפיתל לאחר השבתת אקטומיוזין in vivo.

עיכוב אופטוגנטי של התכווצות אקטומיוזין בתיווך Rho1 יחד עם מדידת מתח אפיתל בעוברי דרוזופילה

למד כיצד לבצע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בעוברי Drosophila באמצעות ניתוח מבוקר עם דבק כירורגי. שיטה זו חושפת את מערכת העצבים והשרירים לחקר התפתחות נוירומוסקולרית.

מסיק והכנת תסיסנית עוברים הקלטה אלקטרו ונהלים אחרים

גלה סרטונים נוספים