Name: הקלטה של אלקטרו תסיסנית עובריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: למד הקלטות אלקטרופיזיולוגיות משרירים ונוירונים מוטוריים בזבובי פירות Drosophila. השיטה מאפשרת לחקור תהליכי סינפטוגנזה ותכונות חשמליות של מערכת העצבים המתפתחת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

KB הוא נתמך על ידי NIH מענק GM54544.

למחברים אין הצהרות לגבי ניגודי עניינים.

הקלטה אלקטרו מעוברים תסיסנית דורש מניפולציה דיסקציה ידנית. הבריאות של התכשיר, ואיכות הסוגר של הקלטות, תלוי על אחד להיות מסוגל במהירות בצורה מסודרת להכין את הרקמות עובריים שביר הקלטה, ולאחר מכן לבצע את הניסוי. הניסויים צריכים להיות בקיאים בשני חתכים עובריים מהדק electrophysiology תיקון לפני שתנסה להתמודד בעת ובעונה אחת. הקלטות ניתן לעשות זאת באחת הגרסאות של כמה &quot;שונה תקן&quot; או &quot;haemolymph דמו...

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

תסיסנית הוא מודל גנטי המוביל במחקר של פיתוח הן עובריים המוח תפקודית. באופן מסורתי, בתחומים אלה הם די מבודדים אחד מהשני, עם היסטוריה עצמאית במידה רבה קהילות מדעיות. עם זאת, הממשק בין שדות אלה נבדלים בדרך כלל התוכניות התפתחותית תפקודית הבסיסית רכישת נכסים איתות חשמלי הבחנה של סינפסות כימיות תפקודית במהלך השלבים האחרונים של הקמת מעגל עצבי. ממשק זה הוא אזור חשוב ביותר לחקירה. ב תסיסנית, אלה שלבים של התפתחות תפקודי להתרחש בתקופה של &lt;8 שעות (במהירות של 25 ° C) במהלך השליש האחרון של העובר. תקופה זו התפתחותי מאוחר נחשב ארוך סורר אל בשל חקירה בתצהיר של הציפורן, קשה אפידרמיס חדיר. מראש היה פריצת דרך ביישום של דבק מים polymerizing כירורגית כי ניתן להחיל באופן מקומי כדי לאפשר לציפורן לנתיחה מבוקר של עוברים בשלב מאוחר. עם חתך אורכי הגבי, העובר יכול להיות מונח שטוח, חשיפת עצבים בחוט הגחון ועל קיר שרירי הגוף חקירה ניסויית. Whole-cell-clamp תיקון טכניקות אז יכול להיות מועסק על מנת להקליט בנפרד נוירונים לזיהוי והשרירים סומטי. תצורות אלו הקלטה שימשו כדי לעקוב אחר המראה ההבשלה של זרמים יוניים התפשטות פוטנציאל פעולה בשני הנוירונים והשרירים. מוטנטים גנטיים המשפיעים אלה התכונות החשמליות כבר מאופיין לחשוף את ההרכב המולקולרי של תעלות יונים ומתחמים איתות קשור, ולהתחיל חקר המנגנונים המולקולריים של בידול פונקציונלי. דגש מיוחד כבר את הרכבה של קשרים סינפטיים, הן בפריפריה מערכת העצבים המרכזית. Glutamatergic neuromuscular צומת (NMJ) נגיש ביותר שילוב של דימות אופטי ורישום אלקטרו. אלקטרודה יניקה כוס משמש כדי לעורר את העצבים ההיקפית, עם הגירוי הנוכחי לצומת (EJC) הקלטות שנעשו בשריר מתח מהודק. תצורה זו הקלטה שימש בתרשים בידול פונקציונלי של הסינפסה, ולעקוב אחר המראה ההבשלה של נכסים presynaptic שחרור גלוטמט. בנוסף, תכונות postsynaptic ניתן assayed באופן עצמאי באמצעות iontophoretic או יישום בלחץ של גלוטמט ישירות על פני שרירים, כדי למדוד את המראה ואת ההבשלה של שדות קולטן הגלוטמט. לפיכך, גם אלמנטים טרום postsynaptic ניתן לנטר בנפרד או בשילוב במהלך synaptogenesis עובריים. מערכת זו הייתה בשימוש רב לבודד ולאפיין מוטציות גנטיות הפוגעות במבנה סינפסה העוברית, וכך לגלות את המנגנונים המולקולריים השולטים מפרט והבחנה של קשרים סינפסה ופונקציונלי תכונות האיתות הסינפטי.

הקלטות אלקטרו מן<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים לאפשר ניתוח של שריר בפיתוח תכונות הנוירון חשמל, כמו גם אפיון של synaptogenesis תפקודית בצומת neuromuscular glutamatergic ו כולינרגית מרכזית וסינפסות GABAergic.

*Drosophila* היא מודל גנטי מוביל לחקר ההתפתחות העוברית ומדעי העצבים התפקודיים כאחד. באופן מסורתי, תחומים אלו הם למדי...

ניתן להשיג רישומים אלקטרופיזיולוגיים משרירים ומנוירונים מוטוריים מדופן הגוף של עובר oph שהוכן כראוי. ניתן לבצע רישומים משרירים 6, 7, 12 או 13 בקלות באמצעות תצורת רישום של תא שלם (whole cell recording), וניתן למדוד זרמי מיניאטורה בעוצמה רבה לאחר השגת אטם של giga ohm לצורך רישום מהצומת העצבי-שרירי. ניתן להשתמש באלקטרודת יניקה כדי למשוך עצב מוטורי בקרבת נקודת היציאה מה-CNS ולהעביר גרייה פרה-סינפטית בזמן שזרמי תא שלם נמדדים בשריר הפוסט-סינפטי.לחלופין, ניתן להשתמש בפיפט כדי להעביר מוליכים עצביים מעוררים ליד אלקטרודת ההקלטה באמצעות יונטופורזה או הזרקה בלחץ. שלום, אני טון מהמעבדה של דייב במחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת אילינוי בשיקגו. היום אראה לכם הקלטה אלקטרופיזיולוגית של צומת עצב-שריר בעוברים בשלב הסלאט ושל נוירונים מרכזיים.הליכים אלו משמשים אותנו כדי לחקור את התפקוד וההתפתחות של המערכת הנוירו-שרירית של joof. טכניקות אלו פותחו במקור על ידי Kendall Brody, עברו ל-David Fit Stone, ולאחר מכן אליי, והיום אעביר אותן אליכם.פרוצדורה זו דורשת כי העוברים ייאספו ויבוצעו בהם דיסקציות כראוי מראש. כדי לראות כיצד הדבר מבוצע, צפו בפרסום הנלווה של Brody Featherstone and Chen Electrophysiological. הקלטות מנוירונים ומשרירי עוברים של Jossa משתמשות בטכניקות סטנדרטיות של whole cell patch clamping. ראשית, העובר לאחר הדיסקציה מונח בתא הקלטה קטן מפלקסיגלס.אזור הקלטת הפיזיולוגיה מבודד חשמלית על ידי כלוב פאראדיי וממוקם על שולחן בעל שיכוך רעידות. התא נצפה תחת תאורה חולפת באמצעות מיקרוסקופ קומפוזיטי זקוף עם אופטיקת KY ועדשת שיקוע במים בעלת מרחק עבודה ארוך של 40x. הקלטות של העדשה מבוצעות בדרך כלל בטמפרטורה הנמוכה מטמפרטורת החדר, שכן ביצוע patch clamp לשרירי oph הופך לקשה יותר ככל שהטמפרטורה עולה.לאלקטרודת ההקלטה צריכה להיות התנגדות סופית של 5 עד 10 mega ohms, ועליה לעבור ליטוש תרמי עד לקוטר פנימי של כ-1 micrometer. קצות אלקטרודות ההקלטה ממולאים בתמיסה פיזיולוגית המכילה potassium chloride וסוכרוז. חוט הארקה של chloride silver מונח באמבט המכיל תמיסת saline סטנדרטית, המשמשת גם לדיסקציה של העובר.אותות מוגברים באמצעות מגבר patch clamp, מסוננים ונשמרים באופן דיגיטלי לצורך ניתוח מאוחר יותר. ניתן להשתמש בכל מערכת המתאימה לניסויי patch clamp, כגון ציוד ותוכנה אלו של axon. כעת ניתן לעורר ולהקליט תאים משלושה רקמות שונות במערכת העצבים העוברית: מהשרירים, מהנוירונים ב-NMJ ומהנוירונים המוטוריים המרכזיים.באמצעות הכנת עובר זו, ניתן להקליט כל שריר עוברי ממרבית הניסויים. התמקדו בקבוצת ארבעת השרירים הבטניים האורכיים 6, 7, 12 ו-13, ובמיוחד בשריר שש בבטן הקדמית, A two עד three להקלטה מהשרירים הגביים. יש להדביק את העובר, כאשר הצד הגבי פונה מטה, ולבצע דיסקציה לאורך קו האמצע הבטני בעוברים צעירים.אין צורך בטיפול אנזימטי לפני הקלטת השריר. עם זאת, בעוברי שלבים מאוחרים יותר שבהם הקוטיקולה מפותחת, מתפתח גם נרתיק שריר לפני הקלטת ה-patch. יש להסיר נרתיק זה באמצעות טבילה קצרה ב-collagenase.מרבית ההקלטות מבוצעות בתצורת הקלטה של תא שלם (whole cell), שניתן להשיג בקלות ממצב של תא צמוד (cell attached) באמצעות יניקה קלה או זמזום חשמלי. זהו zap. זוהי גירוי חשמלי שנועד, כפי שידוע, לפרוץ את קרומי התא.בהגדרת תא שלם, התנגדויות האיטום (Seal resistances) בשריר הן בדרך כלל גבוהות מ-1 giga ohm. זרמי תא שלם מושגים בדרך כלל תוך פחות משלוש דקות לאחר היווצרות האיטום. ההתנגדות טורית עולה באופן ניכר ברוב המקרים, ותאים עלולים לפתח זרם דליפה מוגבר. עבור patch clamping, העוברים חייבים להיות בני 14 שעות לפחות; בשלבים התפתחותיים מוקדמים יותר.צימוד חשמלי נרחב בין שפורי שריר (myotubes) יהפוך את קיבוע המתח לבלתי מדויק לצורך ביצוע הקלטות patch clamp של סיבי שריר. פוטנציאלי אחזקה טיפוסיים הם בין 60- ל-80- מיליוולט, וניתן להשתמש בשיטות של קיבוע מתח (voltage clamp) וקיבוע זרם (current clamp). הקלטות whole cell מוצלחות ב-60- מיליוולט מלוות בזרמים סינפטיים ספונטניים חזקים הנעים בין כמה למאות של פיקו-אמפרים, כפי שמוצג כאן.ניתן לעורר זרמי NMJ גדולים על ידי גירוי של העצב המוטורי באמצעות אלקטרודות יניקה. אלקטרודות אלו ניתנות למשיכה ממגוון של אלקטרודות זכוכית ממולאות סיבים, ויש לבצע להן ליטוש באש כדי להשיג את התצורה הרצויה; השתמשו ביניקה עדינה בפיפטה כדי למשוך מקטע קטן של העצב המוטורי הסגמנטלי המתאים בקרבת נקודת היציאה מה-CNS. כדי ליצור אטימה הדוקה, גירוי קצר פועל בצורה הטובה ביותר בעוצמה שנקבעה ניסיונית, בדרך כלל בין 1 ל-5 volts. גירוי מהימן מושג על ידי קביעת עוצמת הגירוי ב-1 עד 2 volts מעל הסף שנקבע ניסיונית.ניתן להפעיל קולטני גלוטמט פוסט-סינפטיים ב-NMJ על ידי יישום של הנוירוטרנסמיטר גלוטמט. מולקולות טעונות, כגון גלוטמט, יכולות להיות מועברות ל-NMJ באמצעות יונטופורזה. פיפטות בעלות התנגדות גבוהה משמשות למיפוי הקולטנים, ופיפטות בעלות התנגדות נמוכה יותר משמשות להערכת התגובה הכוללת של קולטני הגלוטמט. פיפטות יונופוריות נטענות עם תמיסת L-glutamate בריכוז 100 millimolar.לשחרור L glutamate, השתמש בפולס קצר של זרם שלילי עם זרם גיבוי חיובי קטן למניעת דליפה; ניתן להחדיר glutamate, או כל מולקולה לא טעונה אחרת, ל-NMJ גם באמצעות הזרקה בלחץ (pressure ejection). עבור הזרקה בלחץ, השתמש ב-1 עד 2 millimolar של glutamate והפעל כוח דחיפה של 5 עד 10 PSI על הפפיטה, באמצעות pico spritzer.זרמי NMJ המעוררים על ידי גריית עצב או יישום של גלוטמט ב-60- מיליוולט הם בדרך כלל 1500 עד 2000 פיקו-אמפר. ניתן לזהות באופן פרטני נוירונים עובריים רבים על בסיס מיקום הסומה ומורפולוגיית ההקרנה. רוב ההקלטות הניסיוניות התמקדו בקבוצה של חמישה נוירונים גבייים שטחיים בתוך חבל העצבים הבטני העוברי.כדי לבצע הקלטה מנוירונים אלה, יש להסיר את מעטפת הנוירומה של חוט העצבים הגבאי (ventral nerve cord) באמצעות טיפול מוקדי קצר בפרוטאז; גופי התאים משוחררים מהמעטפת על ידי הזרקת 0.5% עד 1% פרוטאז. במהלך ההקלטה, השתמש בפפיפט פאץ' (patch pipette) בעל קוטר גדול כדי לשאוב את חומר המעטפת אל תוך הפפיפט המכיל את הפרוטאז. ניתן להשתמש בפעולת פה עדינה כדי לשאוב את המעטפת פנימה והחוצה מהפפיפט באופן חוזר. לאחר דקה עד שתי דקות, המעטפת תיקרע.התאים חשופים כעת לביצוע whole cell patch clamping. פרדיגמת הקלטה זו אינה דורשת סירקולציה או חימום של תמיסת המלח. תמיסת המלח החיצונית להקלטה בהכנה זו שונה מזו המשמשת להקלטה משרירים.ניתן למלא את פיפטת ה-patch ב-Lucifer yellow כדי להדמיות מאוחרות של המיקום והמורפולוגיה של תא ה-patch. כאן מוצג נוירון מוטורי מרכזי שספג Lucifer yellow והודמיה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. רישומי voltage clamp של תא שלם מבוצעים בפוטנציאלי החזקה של 60- millivolts בטמפרטורה של 18 °C.ניתן לבצע גם הקלטות בשיטת current clamp. ניתן לגרות נוירונים באמצעות המולי ההעצבים acetylcholine או gaba. אלו מוחלים על גוף התא (soma) באמצעות יונטופורזה או הזרקה בלחץ, בדומה להקלטה מסינפסות עצביות (njs).לאחר שנוצר חיבור של תא שלם (whole cell), נצפים תחילה זרמים ספונטניים. זהו נתון גולמי של דקה אחת שהתקבל משריר אורכי ונטרלי עוברי שששתו נבחנו בשיטת patch clamp ב-60- מילי-וולט ללא גרייה. תכשיר בריא מראה בדרך כלל פעילות סינפטית ספונטנית חזקה, המיוצגת כאן על ידי רבות מהסטיות של הזרם כלפי מטה.להלן נתונים מאותו שריר, כאשר הגירוי הופעל באמצעות פיפטת יניקה על העצב המוטורי המוביל לאותו שריר. הדבר הוביל למספר סטיות כלפי מטה של הזרם, המייצגות זרמים צומתים מעוררים (evoked junctional currents) או e jcs. אלו נתונים מאותו שריר שעבר גירוי באמצעות 1 millimolar גלוטמט שהופעל באמצעות הזרקה בלחץ (pressure ejection).הגלוטמט פותח רספטורים המובילים להסטות גדולות כלפי מטה. בזרם מוצגים שני עקומות המייצגות שני יישומים עוקבים של גלוטמט. הרגשתי לכם כיצד לבצע רישום אלקטרופיזיולוגי מעוברים בשלבים מאוחרים של Xenopus; רישום אלקטרופיזיולוגי משתמש בדרך כלל בטכניקות סטנדרטיות של patch clamping, אותן לא נפרט כאן לעומק.באופן אידיאלי, כל מי שמעוניין להקליט מבריונים המרוככים שלך כבר למד טכניקות של patch clamp באמצעות דגם פשוט יותר. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

electrophysiological-recording-in-the-drosophila-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים את נוהל בידוד המוח כולו מן הבוגרים תסיסנית כהכנה ההקלטה מתא עצב בודד באמצעות תא רגיל הטכנולוגיה כולו. זה כולל תמונות של תאים GFP ונוירונים שכותרתו שנצפו במהלך ההקלטה.

תא הקלטות שלמות של המוח של מבוגרים תסיסנית

כאן אנו מתארים שיטות אלקטרו למדידת בשידור סינפטי בצומת neuromuscular של הזחל תסיסנית. שחרור עורר היא יזמה באופן מלאכותי על ידי המרצת הנוירונים אקסונים מוטוריים, והעברת דרך NMJ ניתן למדוד התגובה postsynaptic עורר בשריר.

שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית

טכניקה זו חושפת את neuromusculature עובריים תסיסנית עבור אימונוהיסטוכימיה או הקלטה אלקטרו. זה שימושי לחקר אירועי מוקדם בהתפתחות neuromuscular או ביצוע electrophysiology ב מוטנטים שאינם יכולים לבקוע.

מסיק והכנת תסיסנית עוברים הקלטה אלקטרו ונהלים אחרים

מערכת סיבים הענק הוא מעגל עצבי פשוטה של...

הקלטות אלקטרו מתוך מסלול של סיבים ענק ד melanogaster</em

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לרישום אלקטרופיזיולוגי של פעילות קולטני אור בעין של דרוזופילה משותקת, המאפשר מדידה מדויקת של שינויי מתח בתגובה לגירויי אור.

רישום אלקטרופיזיולוגי של תגובות מתח של פוטורצפטורים ברשתית דרוזופילה לגירויי אור

הסרטון מדגים רישום חוץ-תאי של פעילות עצבית ממערכת העצבים המרכזית (CNS) של זחלי דרוזופילה. מערכת העצבים המרכזית הטרנסקטיבית ממוקמת בתא הקלטה, והפעילות החשמלית לעצב יורד נרשמת כדי לקבוע את תדר הירי הבסיסי. לאחר מכן מוצג סוכן בדיקה, והשינוי בתדירות הירי נרשם כדי לקבוע את ההשפעה המעוררת או המעכבת של הסוכן.

רישום חוץ-תאי של פעילות חשמלית במערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה

פרוטוקול זה מתאר הקלטה תאית מתגובות פוטנציאל הפעולה שנורו על ידי נוירונים טעם labellar בדרוזופילה.

הקלטת אלקטרו מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Labellar טעם Sensilla

מיקרואלקטרודות חדות מאפשרות אפיון אלקטרופיזיולוגי מדויק של תפוקת קולטני האור והאינטרנוירונים החזותיים בדרוזופילה חיה. כאן אנו מראים כיצד להשתמש בשיטה זו כדי להקליט תגובות מתח באיכות גבוהה של תאים בודדים לגירוי אור מבוקר. שיטה זו אידיאלית לחקר עיבוד מידע עצבי בעיניים של תרכובות חרקים.

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים<em&gt; In vivo</em

כל תא הקלטות של תסיסנית melanogaster photoreceptors לאפשר מדידה של ספונטני בליטות כהה, בליטות קוונטיות, תגובות מאקרוסקופיות לאור, ואת המתח הנוכחי היחסים בתנאים שונים. בשילוב עם ד melanogaster כלים מניפולציה גנטית, שיטה זו מאפשרת את המחקר של inositol- השומן ליפיד המסלול נתיב היעד שלה, ערוץ TRP.

שיטה אלקטרו-קולית לקולקציית מתח מלא<em&gt; תסיסנית</em&gt; פוטורספטורים

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי להקליט את הפעילות החשמלית יורד של מערכת העצבים המרכזית דרוזופילה melanogaster כדי לאפשר את עלות-יעיל ונוח בדיקה של סוכנים תרופתי, מוטציות גנטיות של חלבונים עצבית, ו/או את התפקיד של מסלולים פיזיולוגיים נחקרו.

הקלטה אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מערכת העצבים המרכזית השלישית-לחלל דרוזופילה Melanogaster

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את העיצוב ואת הביצועים של ניסויים vivo ב Drosophila ילה melanogaster כדי להעריך את ההשלכות הפונקציונליות של משתנים גנים נדירים הקשורים למחלות האדם.

במחקר פונקציונלי Vivo של מחלות-הקשורים משתנים אנושיים נדירים באמצעות Drosophila ילה

למד הקלטות אלקטרופיזיולוגיות משרירים ונוירונים מוטוריים בזבובי פירות Drosophila. השיטה מאפשרת לחקור תהליכי סינפטוגנזה ותכונות חשמליות של מערכת העצבים המתפתחת.

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

גלה סרטונים נוספים

הקלטה של אלקטרו תסיסנית עובריים