Name: הכתמה של חלבונים עם גל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: למדו שיטת הכתמה לחלבונים בג'לים פוליאקרילאמיד באמצעות Coomassie Brilliant Blue G-250 ללא שימוש בממסים אורגניים או חומצה אצטית. פרוטוקול זה מספק ויזואליזציה ברורה של פסי חלבון לאחר אלקטרופורזה בדרך בטוחה ופשוטה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות סיוע טכני של אינס Racké.

חלק 1: הכנת התמיסה מכתים CBB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 60-80 מ&quot;ג CBB G-250 הם מומס 1 ליטר מים bidistilled על ידי ערבוב במשך 2-4 שעות. לבסוף, 3 מ&quot;ל של HCl מרוכזת מתווסף הפתרון כחול כהה עם ערבוב עוד דקה ומאוחסנים בחושך לשימוש מאוחר יותר. הפתרון יכול להיות מאוחסן במשך שבועות עד מספר חודשים מבלי לאבד את יעילות מכתים שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HCl מרוכז צריכים להיות מטופלים עם und הטיפול הרגיל המשמש מתחת למכסה המנוע קטר. הפתרון הסופי יהיה בסביבות ה-pH 2, ולכן יש להשתמש בכפפות וכל מגע עם העור יש להימנע. </li></ol> חלק 2: SDS-PAGE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquots הולמת של דגימות חלבון מעורבבים עם טעינת חיץ בריכוז הסופי של המאגר 1x הטעינה. אנו משתמשים למאגר העמסה עם 2x 125mm Tris/H3PO4 (pH 7.5 במהירות של 25 ° C), 2mm EDTA, SDS 4%, 200mm DTT, כחול bromophenol 0.02% ו 50% גליצרול. מאגרים נוספים טעינה עבור SDS-PAGE ניתן להשתמש גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות חלבון מחוממים על 5 דקות לפני הטעינה. בינתיים, תא אלקטרופורזה בג&#39;ל מוכן הריצה. אנו משתמשים NuPAGE precast 4-12% © Bis-טריס ג&#39;לים (Invitrogen) ב SureLock XCell ® Mini-Cell (Invitrogen) עם חיץ-MES חיץ פועל אבל כל ג&#39;ל אלקטרופורזה אחרים במערכת יכול לשמש היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות חלבון נטענים על ג&#39;ל אלקטרופורזה ו לרוץ 50 דק &#39;ב 220V. </li></ol> חלק 3: צביעה של הג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת ג&#39;ל הוא ג&#39;ל מפורקים הניח בתוך קופסה על הצעדים הבאים כביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ 100 מ&quot;ל מים bidistilled מתווסף הג&#39;ל ומחוממת במיקרוגל למשך 30 שניות. חימום צריך לעצור לפני רתיחה מתרחשת. הקופסה עם הג&#39;ל מושם אז 3-5 דקות על שייקר. צעד זה חוזר על עצמו פעמיים שטיפה עם מים מתוקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספיק פתרון CBB מכתים נוסף כדי לכסות את הג&#39;ל בתיבה תיבת מחומם במיקרוגל למשך 10 שניות. ללא רתיחה. הקופסה עם הג&#39;ל מושם אז בשביל לסיים את מכתים על שייקר. כבר לאחר דקה 1, להקות חלבון ניתן לצפות, אחרי 15-30 דקות. מכתים חזקה מספיק ברוב המקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפתרון הוא מכתים ניגרה ו 50-100 מ&quot;ל מים bidistilled נוסף כדי לקדם destain רקע תכלת ג&#39;ל על שייקר. המים יכולים להיות מוחלפים ע&quot;י מים מתוקים להמשך destaining במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הג&#39;ל ניתן לסרוק, לצלם או מיובשים עבור אחסון לטווח ארוך </li></ol> חלק 4: תוצאות נציג: ראה איור. 1 עבור ג&#39;ל מוכתם כראוי הנוהל המתואר. ראה איור. 2 עבור ג&#39;ל שלא נשטף מספיק זמן לפני מכתים ו SDS שיורית מעכב כתמים יעיל. שים לב כי נתיבי סמן (*) להכיל את אותה כמות של חלבונים סמן. <img src="/files/ftp_upload/1350/Fig1.png" alt="" /> איור. 1: ג&#39;ל נציג מוכתם לאחר טעינת דגימות של טיהור חלבון (*: סמן משקל מולקולרי). <img src="/files/ftp_upload/1350/Fig2.png" alt="" /> איור. 2: ג&#39;ל CBB מוכתם שלא נשטפו מספיק זמן לפני מכתים CBB. להקות חלבון להופיע חלש (לב * סמן נתיב מכיל את אותה כמות של חלבון כמו איור. 1).

<ol><li>Process for fast visualization of protein. US patent. , 6319720 (B1) (2001).</li>
<li>Solution for fast visualization of protein. US patent. , 2001046709 (A1) (2001).</li>
</ol>

אין אינטרסים מנוגדים. ההליך המתואר לעיל פורסם במקור ביישום הפטנט על ידי א.מ. Wondrak (ראה Ref.).

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלבים כביסה הם קריטיים עבור מכתים יעיל של חלבונים. זמן כביסה מופחת מתחת 2 דקות או נפח מופחתת של מים (&lt;50 מ&quot;ל) עלולה לגרום חיוור להקות חלבון כחול, ככל הנראה בשל כמויות גדולות יותר של SDS שאריות הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם החלבונים הם הולכים להיות מנותח על ידי ספקטרומטריית מסה, השלבים לחימום בתנור מיקרוגל יש דילג, זמן לרחצה של הג&#39;ל המורחבת כ 10 דקות בכל שלב וזמן מכתים הוארך עד עוצמת הלהקה חזקה מספיק . חימום התוצ...

<table><tbody><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td>ניתן להשתמש גם בכל CBB G-250 אחר</td></tr><tr><td>HCl רשמי</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל coomassie g-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

בשנת קלאסית מכתים פרוטוקולים חלבון באמצעות Coomassie מבריק כחול (CBB), פתרונות עם תוכן גבוה של ממיסים אורגניים רעילים דליקים (אתנול או מתנול 2-Propanol) וחומצה אצטית משמשים קיבעון, מכתים ו destaining של חלבונים בג&#39;ל SDS לאחר עמודים. כדי לזרז את ההליך, חימום הפתרון מכתים לתנור המיקרוגל לזמן קצר משמש לעתים קרובות. בדרך כלל גורמת התאדות של מתנול רעילים או מסוכנים, אתנול או 2-Propanol ועל ריח חזק של חומצה אצטית במעבדה אשר יש להימנע בשל שיקולי בטיחות. בפרוטוקול שפורסם במקור בשתי בקשות לפטנט על ידי א.מ. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), הרכב חלופה לפתרון מכתים מתואר בה שום אורגני ממס או חומצה משמש. CBB הוא מומס במים bidistilled (60-80mg ליטר CBB לכל G-250) ו - 35 מ&quot;מ HCl הוא הוסיף כמתחם רק השני בפתרון מכתים. Staning CBB של הג&#39;ל נעשה לאחר שטיפה SDS-PAGE וממצה של הג&#39;ל במים bidistilled. על ידי חימום במהלך ג&#39;ל רחצה ו מכתים שלבים, התהליך יכול להסתיים מהר ולא compunds רעילים או מסוכנים הם מתאדים. צביעה של החלבונים מתרחשת כבר בתוך דקה 1 אחרי חימום ג&#39;ל מכתים פתרון והיא מפותחת אחרי 15-30 דקות עם רקע כחול מעט כי הוא destained לחלוטין על ידי שטיפה ממושכת של הג&#39;ל מוכתמת במים bidistilled, מבלי להשפיע על חלבון מוכתם להקות.

פרוטוקול קצר מכתים חלבון עם Coomassie מבריק כחול (CBB) G-250 ב ג&#39;לים polyacrylamide מתואר ללא שימוש בממיסים אורגניים או חומצה אצטית כמו הנהלים מכתים קלאסית עם CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

בפרוטוקולים קלאסיים לצביעת חלבונים באמצעות Coomassie Brilliant Blue (CBB), תמיסות בעלות ריכוזים גבוהים של ממסים אורגניים רעילים ודליקים...

כדי להתחיל את ההליך, ממיסים Kumasi Brilliant Blue או CBG two 50 בליטר אחד של מים מזוקקים פעמיים על ידי ערבוב למשך שעתיים עד ארבע שעות. לאחר מכן, מוסיפים חומצה כלורית לתמיסה הכחולה הכהה תוך ערבוב למשך דקה נוספת, ואת התמיסה מאחסנים בחושך לשימוש מאוחר יותר. לאחר הכנת דגימות החלבון וביצוע STS page, מפרקים את קסטת הג'ל ומניחים את הג'ל בקופסה לשלושה שלבי שטיפה עוקבים עם מים מזוקקים פעמיים.לאחר שלב השטיפה השלישי, מחליפים את המים בכמות מספקת של תמיסת צביעה CBB כדי לכסות את הג'ל בתוך הקופסה. מחממים את הקופסה במיקרוגל למשך 10 שניות, ולאחר מכן מניחים את הקופסה עם הג'ל על שייקר. להשלמת הצביעה, ניתן להבחין בפסיי חלבון לאחר דקה אחת.שלום, אני אמרי לורנס ממתקן לביטוי וניקוי חלבונים ב-Emberin Heidelberg. היום נראה לכם פרוטוקול לצביעת חלבונים ב-Coomassie Brilliant Blue G 250 בג'לים של אקרילאמיד. בניגוד לשיטות צביעה קלאסיות, הפרוטוקול שלנו אינו משתמש בממסים אורגניים או בחומצה אצטית.אנו משתמשים בפרוטוקול זה כדי לנתח את החלבונים שלנו לאחר כל שלב של טיהור. אז בואו נתחיל. כדי להכין את תמיסת הצביעה ב-CBB, ממיסים 60 עד 80 מיליגרם של CBB בליטר אחד של מים מזוקקים פעמיים על ידי ערבוב למשך שתי עד ארבע שעות.לאחר המסת ה-CBV, העבירו את התמיסה למכתש. בתוך המכתש, הוסיפו בזהירות שלושה מיליליטרים של חומצה כלורית רכזת

staining-proteins-gels-with-coomassie-g-250-without-organic-solvent

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בעקבות ההפרדה על ידי שיטות electrophoretic, חלבונים בג'ל ניתן להבחין באמצעות שיטות צביעה שונות. הכתמה של חלבונים עם Coomassie כחול, מכתים כסף, SYPRO אורנג', SYPRO רובי הם הפגינו וידאו.

מכתים חלבונים ג&#39;ל

וידאו זה יהיה פופולרי colloidal Coomassie G-250 פרוטוקול מכתים פי...

מהיר רגיש Colloidal Coomassie G-250 מכתים עבור חלבונים ג&#39;ל polyacrylamide

שימוש glycosidases ספציפי להסיר סוכרים מן גליקופרוטאינים ואחריו SDS-PAGE היא שיטה ערך כדי לזהות שינויים glycan על דגימות חלבון היא בחירה טובה עבור מחקרים glycobiology הראשונית. השינויים הבאים deglycosylation ניתן לאתר כמו משמרות ניידות ג'ל או מכתים עם ריאגנטים רגיש glycan.

זיהוי ואפיון של חלבונים באמצעות glycosylation ספציפי אנדו ו exoglycosidases

בסרטון זה, אנו מדגימים הליך לצביעה משולבת של כחול וכסף Alcian של שברי oligosaccharide glycosaminoglycan sulfated. טכניקת צביעה משולבת זו מגדילה באופן משמעותי את רצועות פולימרי הגליקוזאמינוגליקן באורכים שונים בג'לים פוליאקרילאמידים.

צביעת כסף של גליקוזאמינוגליקנים סולפטים: שיטת צביעה להדמיה של גליקוזאמינוגליקנים סולפטים בג'לים פוליאקרילאמיד

על מנת לחקור באופן מקיף את המגוון של גליקנים מקושרים O, הליך חדש לסילוק β רדוקטיבי בתוך הג'ל, בשילוב עם פרמתילציה ושיטת חלוקת פאזה מהירה, מיושם לניתוח גליקנים מקושרים O המשתחררים ישירות מגליקופרוטאינים שנפתרו על ידי SDS-PAGE וניתנים לניתוח גליקומי לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה.

השתפר בג&#39;ל Sulfo-glycomics β-ביעור עבור מקיף O צמוד וReductive ידי ספקטרומטריית מסה

כאן, אנו מציגים דו-ממדית בג'ל (2DE) בשילוב עם ספקטרומטר מסה (MS) להפריד ולזהות פרוטאום רקמת גידול בבלוטת יותרת המוח האנושי, אשר מציג תבנית לשחזור וטוב 2DE. חלבונים רבים שנצפו במקום כל 2DE בעת ניתוח סרטן מורכב פרוטאום עם השימוש של MS רגישות גבוהה.

אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל בשילוב עם שיטות ספקטרומטר מסה על ניתוח של רקמת גידול בבלוטת יותרת המוח האנושי פרוטאום

הארכיטקטורה של מתחמי חלבון חיוני לתפקוד שלהם. שילוב של טכניקות שונות המוני spectrometric הוכיח עוצמה ללמוד ההרכבה שלהם. אנחנו מספקים פרוטוקולים cross-linking כימי, יליד ספקטרומטר מסה ולהראות כמה שיטות משלימות אלה לעזור להבהיר את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון הרכבות.

שילוב cross-linking כימי ספקטרומטר מסה של מתחמי חלבון שלם ללמוד את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון להרכבות

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט חלוקה לרמות של פלורסנט חדש מכתים טכניקה לגילוי חלבון סה בג'לים לזיהוי. הפרוטוקול מנצל בדיקה קרינה פלואורסצנטית ספציפיים יון כסף מדליק, אשר מגלה Ag+-חלבון מכלולי ומונע הגבלות מסוימות של כתמי כסף הדפסות כסף מסורתי.

צביעת כסף פלורסנט של חלבונים בג'לים לזיהוי

פרוטוקול זה מתמקד בזיהוי של חלבונים התאגד כדי אינוזיטול פוספטים או פוספופנוסיידים. היא משתמשת בכרומטוזיקה באמצעות מלחי הביוטיטול או פוספופנוסידים הנמצאים בדרך streptavidin לחרוזים או חרוזי מגנטים. אינוזיטול פוספט או פוספוליזיסיטייז מחייב חלבונים מזוהים על ידי בלוק מערבי או ספקטרומטריה מאסיבית.

זיהוי של אינוזיטול פוספט או זרחן אינטראקציה חלבונים על-ידי כרומטוגרפיה של אהדה מצמידים לאבן חשופה מערבית או ספקטרומטר המסה

פרוטוקול זה מתאר את החילוץ והדמיון של חלבונים מצטברים ומסיסים מ Escherichia coli לאחר טיפול עם מיקרוביאלית פרוטאוטוקסית. בעקבות הליך זה מאפשרת השוואה איכותית של היווצרות צבירה של חלבון ב- vivo בזני חיידקים שונים ו/או בין טיפולים.

מיצוי והדמיה של אגרגטים חלבון לאחר טיפול של Escherichia coli עם מתח פרוטאוטוקסי

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניתוח של סופרקומפלקסים נשימתיים כאשר רק כמויות קטנות של דגימות זמינות.

בידוד מיטוכונדריה לניתוח סופר-קומפלקס מיטוכונדריאלי מדגימות רקמה קטנה ותרביות תאים 

למדו שיטת הכתמה לחלבונים בג'לים פוליאקרילאמיד באמצעות Coomassie Brilliant Blue G-250 ללא שימוש בממסים אורגניים או חומצה אצטית. פרוטוקול זה מספק ויזואליזציה ברורה של פסי חלבון לאחר אלקטרופורזה בדרך בטוחה ופשוטה.

הכתמה של חלבונים עם ג'ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

גלה סרטונים נוספים