הפקת DNA של 0.22 מיקרומטר מסננים Sterivex ו כלוריד צסיום צפיפות צנטריפוגה Gradient

היי, אני ג'ודי מהמעבדה, סטיבן האלאם במחלקה למיקרוביולוגיה באימונולוגיה באוניברסיטת קולומביה הבריטית. היום נראה לכם הליך לחילוץ DNA גנומי, מרוכז מדגימות מי ים על מסנני STX של 0.2 מיקרון וטיהור של DNA זה על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות צזיום כלוריד. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי להשיג דנ"א סביבתי, כך שנוכל לחקור את המבנה, המגוון והמטבוליזם של הקהילה המיקרוביאלית בסביבות ימיות.

אז בואו נתחיל. התחל את הפרוטוקול הזה על ידי הפשרה על קרח, ערבוב של מסנני X שריכזת בעבר בביומסה פלנקטונית, טופל בליזה, בופר והקפיא לפשטות. כאן אנו מתארים את הנוהל לעיבוד פילטר בודד.

בפועל אנו ממליצים לעבד 15 מסננים או פחות בכל פעם. לאחר שהמסנן הופשר, התחל את הדגירה הראשונה מבין שתיים. אחד לליסה של התאים והסרת RNA ואחד לפירוק חלבונים.

לדגירה הראשונה, הוסף 100 מיקרוליטר ליזוזים, ו-20 מיקרוליטר RN a's a למסנן. אטמו מחדש את המסנן בבושם והשאירו אותו להסתובב בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לדגירה הבאה יש להוסיף למסנן 100 מיקרוליטר חלבון ace KN 100 מיקרוליטר 20% SDS.

אטום מחדש את המסנן באמצעות פרפיל והשאיר אותו להסתובב שעה עד שעתיים נוספות. הפעם ב-55 מעלות. השתמש במזרק של חמישה סמ"ק כדי להעביר את הליזאט ממסנן סטאקס לצינור בז של 15 מיליליטר.

שטפו את המסנן עם מאגר ליזה של מיליליטר אחד והוסיפו את נוזל השטיפה לליזאט בשפופרת הבז שלכם. כעת, לאחר שביצעתם ליזה ועיכלתם את התאים שלכם, אתם מוכנים לחלץ את הדנ"א שלהם. השלב הבא הוא להשתמש בשיטת פנול כלורופורם כדי לחלץ את ה-DNA מהליזאט שלך.

הוסף נפח שווה כשלושה מיליליטר של פנול כלורופורם, אלכוהול איזואמיל למערבולת צינור הליזאט. למשך 10 שניות לערבב היטב סובב את הצינור ב -2, 500 פעמים G למשך חמש דקות. במהלך הצנטריפוגה, תערובת הליזאט של פנול כלורופורם צריכה להיפרד לשתי שכבות.

שכבה אורגנית בתחתית המכילה את הפנול כלורופורם וחלבונים מהדגימה שלך. ושכבה מימית בדרך כלל למעלה, המורכבת ממי הדנ"א שלך ומולקולות הידרופיליות אחרות. העבירו את השכבה המימית המכילה את ה-DNA שלכם לתוך שפופרת פלקון חדשה של 15 מיליליטר לצינור זה, הוסיפו נפח שווה של מערבולת תערובת אלכוהול איזואמיל כלורופורם למשך 10 שניות.

שלב זה מסיר את כל הפנולים שנותרו מדגימת ה-DNA שלך. סובב אותו 2, 500 פעמים G למשך חמש דקות או עד שהשכבה המימית צלולה. העבירו את השכבה המימית לתוך שפופרת בז חדשה עם תווית והוסיפו מיליליטר אחד של TE ב-PH שמונה.

עכשיו יש לך את תמצית הדנ"א שלך. השלב הבא הוא לשטוף ולרכז את דגימת ה-DNA בצינור אולטרה-צנטריפוגה של אמזון בנפח 15 מיליליטר. העבר את דגימת ה-DNA שלך לתא המסנן של anon.

צינורות תיאון אולטרה צינור מורכבים ממסנן השומר על מולקולות במשקל מולקולרי מוגדר או מעליו, הטייט וצינור כדי לתפוס את הזרימה דרך המסנן. במקרה זה, המסנן שומר על סיבוב ה-DNA שלך ב-3, 500 פעמים G למשך 10 דקות. בדוק כדי לוודא שיש פחות ממיליליטר אחד של נוזל שנשמר במסנן Amon.

אם נשאר עוד רטן טייט, מלא מחדש את המסנן ב-TE וסובב שוב. הסר את הזרימה או סינן לצינור בז אחר ושמור אותו במקרר עד שתאשר את המוצר הסופי שלך על ג'ל, הוסף שני מיליליטר מאגר TE למסנן אמזון וסובב במהירות של 3,500 פעמים G למשך שש דקות. הסר את המסנן כמו קודם.

שטפו את ה-DNA פעמיים נוספות עם TE בסך הכל שלוש כביסות, וחסכו את המסנן בכל פעם לסיבוב הכביסה האחרון עד שנשארים 200 עד 500 מיקרוליטר טייט במסנן Amon. שימו לב לנפח הסופי והעבירו לצינור עינור 1.5 מיליליטר מסומן. הכינו כמות של 70 מיקרוליטר מה-DNA המרוכז השטוף לשימוש כמלאי עבודה.

אחסן את מלאי העבודה במינוס 20 מעלות צלזיוס. הקפיאו את שאר הדנ"א במינוס 80 מעלות צלזיוס. בדוק את ריכוז ה- DNA ואת איכות המוצר הסופי שלך על ידי הפעלת הדגימות שלך על ג'ל ליד DNA.

סולמות המשמשים כתקני גודל ועוצמה מקימים ג'ל AROS של 0.8% בתוספת אתריום ברומיד להפעלה למשך הלילה. בנתיבים הראשונים העמסת סולמות עם רצועות במשקלים וריכוזים מולקולריים שונים, אנו ממליצים על דפוס הטעינה הבא. בשני הנתיבים הראשונים, טען 10 מיקרוליטר של קילו-בייט אחד בתוספת סולם בשלושת הנתיבים הבאים, טען שני מיקרוליטר, חמישה מיקרוליטר ו-10 מיקרוליטר בהתאמה של 50 ננוגרם למיקרוליטר למבדה H שלושה סולם.

לבסוף, טען חמישה מיקרוליטר לכל נתיב של דגימת תמצית DNA. הפעל את הג'ל ב -15 וולט למשך כ -16 שעות. צלם את הג'ל באמצעות מערכת תיעוד ג'ל UV כדי לקבוע את טווח המשקל המולקולרי של ה-DNA שלך ואת ריכוזו.

השווה את רצועות המדגם לרצועות הסולם. DNA באיכות טובה יהיה בעל משקל מולקולרי גבוה ויראה מעט עדויות לגזירה או השפלה. אם איכות ה- DNA טובה והכמות מספקת, המשך לטהר את ה- DNA על ידי ביצוע שיפוע צזיום כלוריד.

התווית הראשונה של צנטריפוגה, צינור צנטריפוגה אחד לכל דגימה לכל צינור צנטריפוגה, מוסיפים 160 מיליגרם צזיום כלוריד ו-178 מיקרוליטר DNA גנומי. מכסים את הצינור בחתיכת פרפיל קטנה והופכים בעדינות את הצינור 10 עד 20 פעמים על מנת לערבב את הרכיבים. אין לערבב על ידי פיפטינג שעלול לגרום לגזירה של ה-DNA.

לאחר מכן מוסיפים 10 מיקרוליטר ברומיד AUM לצינור ומערבבים שוב. וודאו כי הצינורות מאוזנים היטב לפני הצנטריפוגה וכי הפרשי המשקל בין הצינורות הם פחות ממיליגרם אחד. הכניסו את הצינורות לרוטור האולטרה-צנטריפוגה בעזרת מספריים בפינצטה.

לאחר מכן סגור את מכסה הרוטור והנח את הרוטור בתוך האולטרה-צנטריפוגה סגור. ואקום דלת האולטרה-צנטריפוגה יופעל ברגע שתסגור את הדלת. רוץ לילה בסך הכל 18 שעות ב-100,000 סל"ד ב-20 מעלות צלזיוס.

בסיום הצנטריפוגה, הוציאו את הצינורות מהרוטור בעזרת מספריים בפינצטה והניחו על המתלה. קח את הצינורות אל מתמיר האור הכחול, הרכיב את משקפי המסנן הענבר. לאחר מכן הפעל את האור הכחול וראה את רצועת ה-DNA שלך באמצעות מזרק ומחט סטרילית של סמ"ק אחד.

הסר את רצועת ה-DNA ולאחר מכן הנח אותה בצינור עינור של 1.5 מיליליטר כדי לעזור לשחזר את רוב ה-DNA הכלוא בחלל המת במזרק. שוטפים את המזרק עם 100 מיקרוליטר te ומוסיפים את תמיסת השטיפה לצינור. הכן צינור אחד עם מאגר של 100 מיקרוליטר לכל דגימה על מנת למנוע זיהום צולב.

כדי להסיר AUM ברומיד מה-DNA, הוסף נפח שווה של בוטנול רווי מים לצינור. הפוך את הצינורות בעדינות, 10 עד 20 פעמים צנטריפוגה ב -10, 000 סל"ד למשך דקה אחת והשליך את השכבה העליונה. חזור על הכביסה כשלוש עד ארבע פעמים נוספות עד שצבע הבוטנול שקוף.

מניחים ארבעה מיליליטר TE בצינור אולטרה-צנטריפוגה אנקון ומוסיפים את תמיסת ה-DNA מעל הצנטריפוגה ב-3, 500 פעמים G בטמפרטורת החדר עד שנפח ה-DNA מצטמצם לכ-100 עד 500 מיקרוליטר ומשליכים את הזרימה. הוסף שני מיליליטר TE למסנן ולצנטריפוגה של אמזון ב-3,500 פעמים G למשך שש דקות. חזור על הפעולה פעמיים בסך הכל שלוש כביסות עם תרכיז te לנפח סופי של 50 עד 100 מיקרוליטר על ידי צנטריפוגה נוספת לפי הצורך.

ולהעביר את תמיסת ה-DNA על המסנן לצינור איינור חדש של 1.5 מיליליטר. הוסף 40 מיקרוליטר te למסנן theon ופיפטה למעלה ולמטה לאורך שני ממברנות המסנן כדי לשטוף את כל ה-DNA שנותר. הוסף תמיסה זו לצינור ה- DNA המרוכז.

הנח יחידת מסנן MicroCon YM 30 לצינור MicroCon ושטוף מראש את ה-MicroCon על ידי הוספת 200 מיקרוליטר מי חיטוי וצנטריפוגה ב-10,000 סל"ד למשך שבע דקות. הוסף את תמיסת ה-DNA ל-MicroCon שנשטף מראש על מנת לרכז עוד יותר את צנטריפוגת ה-DNA ב-5,000 עד 10,000 פעמים G למשך דקה עד שלוש דקות. בדוק את כמות הנוזל על המסנן וחזור על הצנטריפוגה עד שכמות הנוזל על המסנן מופחתת לכ-50 מיקרוליטר.

הנח את יחידת המסנן הפוכה בצינור MicroCon חדש וצנטריפוגה ב-1000 פעמים G למשך שלוש דקות. הכמות האידיאלית של תמיסה מרוכזת היא 50 עד 60 מיקרוליטר. העבירו את דגימת הדנ"א שלכם לשפופרת איינור חדשה בנפח 1.5 מיליליטר.

מדוד את ריכוז ה-DNA ב-NanoDrop ובדוק את איכות השיא. גרף של ספיגה לדנ"א נקי צריך להיות בעל שיא ברור של 260 ננומטר. הקפיאו את שאר הדנ"א בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס.

כאשר פרוטוקול זה נעשה כהלכה, אתה אמור לראות תמונת ג'ל הדומה לאיור 1 ריכוז ה-DNA בפועל של תמציות ישתנה בהתאם למקור הדגימה. כאשר הפרוטוקול הזה נעשה כהלכה, אתם אמורים לראות בבירור רצועת דנ"א באמצע הצינור. כמו באיור 2, זה עתה הראינו לכם כיצד לחלץ DNA גנומי ממסנני סטרקס ולטהר אותו באמצעות שיפוע צפיפות צזיום כלוריד.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לבדוק לפני שתתחיל שיש לך את כל הריאגנטים הדרושים והפריטים המתכלים. ושנית, תכננו לפחות שלושה ימים מלאים כדי לאפשר מספיק זמן להשלים את ההליך בזהירות. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.