Name: הפקת DNA של 0.22 מיקרומטר מסננים Sterivex ו כלוריד צסיום צפיפות צנטריפוגה Gradient (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-18T05:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 14 s
Description: למדו לחלץ DNA גנומי ממסנני Sterivex בקוטר 0.22 מיקרומטר מדגימי פלנקטון ימי ולטהרו באמצעות מדרגת צפיפות כלוריד צסיום. שיטה זו מספקת DNA בעל משקל מולקולרי גבוה לניתוח קהילות מיקרוביאליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לקרן קנדית עבור חדשנות, פיתוח קולומביה הבריטית קרן ידע מדעי הלאומי וההנדסה מועצת המחקר (NSERC) של קנדה לתמיכה מחקרים מתמשכים על אזורים חמצן נמוכה של מים חופי האוקיינוס ​​הפתוח. JJW נתמכה על ידי מלגות של NSERC ו דאו נתמכה על ידי מלגות של NSERC, Killam ויסוד טולה מרכז מימנה עבור גיוון התפתחות חיידקים. SL נתמכה על ידי המרכז טולה היסוד במימון עבור גיוון התפתחות חיידקים.

הערה: כל ריאגנטים להשתמש בפרוטוקול זה aliquoted ממניות מעבדה לתוך קטן יותר במניות, עובד זה מאוד חשוב כדי למנוע זיהום לחצות של דגימות DNA שלך וזיהום של מניות מעבדה. כמו כן, כאשר pipetting, הקפד לשנות טיפים פיפטה עבור כל תוספת כדי למנוע זיהום לחצות. חלק ראשון: תמוגה תא עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין בפרוטוקול זה על ידי הפשרת מסננים Sterivex המכילים ביומסה planktonic מרוכז בעבר על הקרח. לשם הפשטות, כאן אנו מתארים את הליך עיבוד מסנן הפרט. בפועל, אנו ממליצים עיבוד 16 או מסננים פחות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסינון יש להפשיר, להתחיל את הראשון מבין שני incubations: אחד lyse התאים ולהסיר RNA, ואחד לשבור חלבונים. במשך הדגירה הראשונה, להוסיף 100 ליזוזים μl (125 מ&quot;ג בשנת 1000 TE μl) ו 20 מ&quot;ל RNase (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לסינון. Reseal את המסנן עם Parafilm ולהשאיר אותה לסובב בתנור הכלאה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך הדגירה הבאה, להוסיף 100 K proteinase μl 100 SDS ו 20% μl לסינון. Reseal באמצעות Parafilm ולהשאיר אותה לסובב 1-2 שעות בתנור הכלאה, הפעם על 55 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 5cc, העברת lysate מן לסנן Sterivex לתוך צינור פלקון 15 מ&quot;ל. יש לשטוף את המסנן עם חיץ 1 תמוגה מ&quot;ל ולהוסיף את נוזל lysate לשטוף בצינור שלך פלקון באמצעות מזרק 5cc. עכשיו שיש לך lysed ו מתעכל התאים שלך, אתה מוכן לחלץ DNA שלהם. </li></ol> חלק שני: הפקת DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב הבא הוא להשתמש בשיטת פנול, כלורופורם כדי לחלץ את ה-DNA מן lysate שלך. הוסף נפח שווה (כ 3ml) של פנול: כלורופורם: אלכוהול Isoamyl (רש&quot;ת) על הצינור lysate, והקפד לשנות טיפים פיפטה עבור כל תוספת כדי למנוע זיהום לחצות. וורטקס למשך 10 שניות כדי ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התחתית גרם 2500 במשך 5 דקות, כדי לוודא צנטריפוגה היא מאוזנת. במהלך צנטריפוגה, את התערובת פנול, כלורופורם, lysate צריך להפריד לשתי שכבות: שכבה אורגנית המכילה את כלורופורם פנול, וחלבונים מן המדגם שלך, על הקרקעית, שכבה מימית, אשר מורכב של הדנ&quot;א שלכם, מים אחרים מולקולות הידרופיליות יותר, על העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השכבה המימית (המכילים DNA שלך) לתוך צינור חדש פלקון 15 מ&quot;ל. היזהר שלא לגעת בממשק עם קצה הפיפטה (תמיד להשאיר כמות קטנה של השכבה המימית מאחור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי צינור חדש זה, להוסיף נפח שווה (כ 3mL) של כלורופורם: רשות העתיקות, והקפד לשנות טיפים פיפטה עבור כל תוספת כדי למנוע זיהום לחצות. וורטקס למשך 10 שניות. פעולה זו מסייעת להסיר כל פנול שנותרו דגימת DNA שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין על 2500 גרם במשך 5 דקות או עד שכבה מימית ברור. העברת שכבה מימית לתוך צינור חדש, Falcon שכותרתו ולהוסיף 1 מ&quot;ל של TE ב-pH 8.0, נזהר שלא לגעת בממשק עם קצה הפיפטה (תמיד להשאיר כמות קטנה של השכבה המימית מאחור). זו שכבה מימית המכילה תמצית ה-DNA שלך. </li></ol> חלק שלישי: ריכוז דנ&quot;א כביסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב הבא הוא לשטוף ולרכז את דגימת DNA בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל Amicon צנטריפוגות אולטרה. צינורות Amicon מורכב מסנן אשר שומרים על מולקולות או מעל משקל מולקולארי שצוין (retentate) ו צינור לתפוס את flow-through (תסנין). במקרה זה, מסנן שומר ה-DNA שלך (retentate). העברת תמצית ה-DNA שלך צעד 2.5 לתא מסנן צינור Amicon Ultra. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין על 3500 גרם במשך 10 דקות. ודא שיש פחות מ 1 מ&quot;ל של נוזל שמר במסנן Amicon. אם נשאר יותר retentate, למלא את המסנן עם TE ספין שוב. הקפד להשתמש טיפ פיפטה טרי בנוסף כל TE כדי למנוע זיהום לחצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הזרימה דרך, או תסנין, אל צינור אחר פלקון ולשמור אותו במקרר עד שתאשר המוצר הסופי שלך על ה-DNA ג&#39;ל (חלק רביעי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ 2 מ&quot;ל TE את מסנן Amicon ספין על 3500 גרם במשך 6 דקות, כדי לוודא להשתמש קצה פיפטה טריים עבור כל TE בנוסף, כדי למנוע זיהום לחצות. בריכת תסנין עם זה משלב 3.3 ולשמור במקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את ה-DNA עוד פעמיים עם TE עבור סכום כולל של שלושה שוטף (מוודא תמיד להשתמש טיפ פיפטה טרי), ושמירת תסנין בכל פעם (כמו צעדים לכל 3.3 ו -3.4). בשביל לשטוף האחרון, ספין מ&quot;ל עד 200-500 של שרידים retentate במסנן Amicon. הקלט את נפח סופי ולהעביר את retentate (המכילים DNA שלך) כדי צינור שכותרתו Eppendorf 1.5 מ&quot;ל. </li></ol> חלק רביעי: קביעת איכות DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את איכות דנ&quot;א להעריך את ריכוז ה-DNA על ידי ואוזל דגימות שלך על 0.8% ג&#39;ל agarose ג&#39;ל staעומד לבחינה עם 1ml ethidium ברומיד (EtBr) לילה. (היה זהיר מאוד בעת שימוש EtBr-זהו mutagen ידוע כמסרטן חשוד. הקפד להחליף כפפות לעתים קרובות למנוע העברת EtBr לשאר במעבדה על העור שלך.) טען את דגימות ה-DNA ליד סולמות, המהווים גודל ועוצמת סטנדרטים (ראה שלב הבא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסמטאות מספר הראשון, עומס סולמות עם להקות של משקולות מולקולרית בריכוזים שונים. אנו ממליצים על דפוס הטעינה הבאה: בסמטאות הראשונה והאחרונה (נתיבי החיצונית), עומס 10 μl של 50ng/μl של 1kb + או סולם 2log. ב נתיבים 2,3 ו - 4, 2 μl לטעון, μl 5 ו -10 μl, בהתאמה, הסולם λHindIII 50ng/μl. לבסוף, עומס 5 μl לכל נתיב של תמצית ה-DNA עם צבע עבור כל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרץ את הג&#39;ל על 15 וולט למשך כ 16 שעות (מומלץ לרוץ בין לילה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לצלם את הג&#39;ל באמצעות מערכת UV תיעוד ג&#39;ל. כדי לקבוע את טווח המשקל המולקולרי של הדנ&quot;א שלכם הריכוז שלה, השווה את להקות להקות מדגם של הסולמות. DNA באיכות טובה יהיה משקל מולקולרי גבוה (&gt; 36kb), ולהראות מעט עדויות של גז / השפלה. ראה איור 1. </li></ol> פרק חמישי: צנטריפוגה צזיום כלוריד Gradient <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם איכות ה-DNA הוא טוב כמות מספיקה, אתה יכול להמשיך לטהר את ה-DNA על ידי ביצוע צזיום כלוריד (CsCl) צנטריפוגה הדרגתי. שים לב, שלב זה הוא אופציונלי טיהור אינו הכרחי עבור כל היישומים במורד הזרם (לדוגמה, אם אתה רוצה ליצור ספריות fosmid אתה צריך לטהר, ואילו אם אתה פשוט רוצה לבצע ריאקציות PCR, טיהור אין צורך בדרך כלל). ראשית, התווית שפופרת אחת עבור צנטריפוגות מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי צינור כל צנטריפוגה, להוסיף 160 מ&quot;ג CsCl, 178 μl של הדנ&quot;א הגנומי. לאחר הוספת CsCl ו-DNA אל הצינור, מקום פיסה קטנה של parafilm על גבי הצינור בעדינות להפוך את צינור 1-20 פעמים על מנת לערבב את המרכיבים. אל תערבב ידי pipetting, אשר עלול לגרום הגז של ה-DNA. לאחר מכן, הוסף 10 μl של 10 מיקרוגרם / EtBr μl אל הצינור הזה לערבב אותו באותה דרך. (היה זהיר מאוד בעת שימוש EtBr-זהו mutagen ידוע כמסרטן חשוד. הקפד להחליף כפפות לעתים קרובות למנוע העברת EtBr לשאר במעבדה על העור שלך.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי המשקל של כל הצינורות מאוזנים לפני צנטריפוגה כזה כי ההבדלים במשקל בין הצינורות הם פחות מ 1 מ&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינורות hemostat באמצעות הרוטור, לסגור את המכסה ומניחים את הרוטור בתוך ultracentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הדלת ultracentrifuge. אבק תחול ברגע שאתה סוגר את הדלת. הפעל לילה בסל&quot;ד 100,000 עבור 18 שעות ו 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר צנטריפוגה היא מוחלטת, להוציא את הצינורות מן הרוטור באמצעות hemostat מקום על מדף צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את ה-DNA transilluminator עם אור כחול, או אם זמין, להשתמש באור UV אורך גל ארוך, בחדר חשוך. לבשי זוג משקפיים ענבר מסנן כדי לראות את להקת ה-DNA. ראה תרשים 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 1cc מחט סטרילית (26G 5 / 8), להסיר את הלהקה DNA ולמקם אותו צינור Eppendorf 1.5ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעזור לשחזר את רוב הדנ&quot;א לכוד בתוך החלל מת המזרק, לשטוף את המזרק עם TE 100 μl ולהוסיף הפתרון שטפה את הצינור. הכן קנה אחד עם חיץ TE 100 μl לפי המדגם, כדי למנוע זיהום לחצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר EtBr מ-DNA, מוסיפים נפח שווה של מים רוויים butanol אל הצינור, להפוך את צינורות בעדינות 10-20 פעמים, צנטריפוגה בסל&quot;ד 10000 דקה 1 ולסלק את השכבה העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור כביסה עד לצבע שקוף butanol, 3 - 4 פעמים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 4 מ&quot;ל TE בצינור Amicon אולטרה צנטריפוגה ולהוסיף את פתרון ה-DNA מלמעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g 3500 בטמפרטורת החדר, עד נפח DNA מצטמצם μl כ 100-500 (בערך 6-7 דקות) וזורקים את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2ml TE כדי Amicon לסנן צנטריפוגות ב 3500 גרם במשך 6 דקות, כדי לוודא להשתמש קצה פיפטה טרי בנוסף לכל, כדי למנוע זיהום לחצות. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתרכז לנפח סופי של μl 50-100 על ידי צנטריפוגה נוספות במידת הצורך, ולהעביר את פתרון ה-DNA על מנת לסנן את צינור חדש Eppendorf 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl TE את מסנן Amicon ו פיפטה למעלה ולמטה לאורך שני הקרומים לסנן לשטוף את כל הדנ&quot;א הנותרים. הוספת פתרון זה הצינור ב 5.15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים YM-30 Microcon יחידת המסנן לתוך צינור Microcon ו prewash Microcon ידי הוספת מים autoclaved 200 μl ו centrifuging בסל&quot;ד 10000 במשך 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את פתרון ה-DNA מ 5.16 ל Microcon prewashed מנת להמשיך לרכז את ה-DNA. צנטריפוגה ב g 5000-10000 עבור 1-3 דקות. בדוק את כמות הנוזלעל צנטריפוגה מסנן וחזור עד לסכום של נוזל על המסנן מצטמצם μl כ 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את יחידת המסנן הפוך בצינור Microcon חדשים צנטריפוגות ב 1000 גרם במשך 3 דקות. הכמות האידיאלית של פתרון מרוכז הוא 50-60 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ורשום את ריכוז ה-DNA על Nanodrop ולבדוק את איכות שיא (יש 260nm). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת aliquot קטן של ה-DNA לצינור Eppendorf נקי לעבודה מניות להקפיא בטמפרטורה של מינוס 20. מעבירים את שאר ה-DNA כדי לנקות שנייה Eppendorf להקפיא בטמפרטורה של מינוס 80. </li></ol> נציג תוצאות: כאשר פרוטוקול זה הוא נעשה בצורה נכונה, אתה אמור לראות תמונה ג&#39;ל אחרי צעד 4.4 בקביעת איכות DNA דומה באיור 1. ריכוז ה-DNA של תמציות בפועל ישתנו בהתאם למקור של המדגם. לאחר שלב 5.7 ב צנטריפוגה שיפוע CsCl, הדנ&quot;א הגנומי מואר באור כחול צריך להיראות דומה איור 2. <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig1newer.png" alt="איור 1" /> באיור 1. 0.8% agarose תמונה ג&#39;ל אלקטרופורזה של דנ&quot;א משקל מולקולרי גבוה שנאספו מארבע במעמקי ב subarctic האוקיינוס ​​השקט (בשני עותקים), מוכתם הסוכן intercalating ethidium ברומיד (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל). הג&#39;ל היה לרוץ 15V עבור ~ 16hrs במאגר TBE 1X הג&#39;ל פועל. להקות לדוגמה הם באיכות טובה מראה מעט עדויות של הגז מכני (מראה להקות בודדות או מריחות בניגוד להקות מרובות) למרות תמציות 10m לשמור RNA כמה לשאת מעל (ראה למרוח בטווח Kb 0.5-2.0). <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. הלהקה הדנ&quot;א הגנומי מואר באור כחול לאחר צנטריפוגה שיפוע CsCl.

<ol><li>Beja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+BAC+or+not+to+BAC%3A+marine+ecogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">To BAC or not to BAC: marine ecogenomics.</a> Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).</li>
<li>Beja, O., Suzuki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+oceans+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).</li>
<li>Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+rapid+method+for+the+direct+isolation+of+nucleic+acids+from+aquatic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).</li>
</ol>

תלוי כמה דוגמאות רבות להיות מעובד, זה יכול להיות הליך הזמן אינטנסיבית בשל שני צעדים הדגירה של שעה אחת, ואת שוטף חוזרות צעדים צנטריפוגה. עדיף לתכנן יומיים שלמים לצורך הליך זה להשאיר הרבה זמן. אם יש בעיות מקבל את נפח לחלץ הסופי בצינור Amicon להפחית עד 200 500μl במהלך ריכוז דנ&quot;א כביסה, לנסות עושה נוספים שוטף TE ו centrifugations (לחזור על חלק שלישי) עד נפח המתאימה שאריות. כמו כן, אם לחלץ את ריחות חריפה של כלורופורם, עדיף לעשות שוטף נוסף עד הריח מפחית כדי לוודא את כל כלורופורם הו...

A correction was made to "<a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 ml RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 &#956;l RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.

A correction was made to <a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>. A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.

Erratum: DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

<table><tbody><tr><td>מזרק 1 סמ"ק (מחט 26G5/8)</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 1 מ"ל (מחט 26G5/8)</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות Eppendorf בנפח 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>מבחנות 15 מ"ל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 5 סמ"ק</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>Amicon&amp;#174; מכשירי סינון צנטריפוגליים Ultra-4</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801096</td><td>גבול משקל מולקולרי נומינלי של 10,000</td></tr><tr><td>בוטנול</td><td>Fisher Scientific</td><td>A383-1</td><td>הפכו אותו לרווי במים (בוטנול:מים = 1:1)</td></tr><tr><td>רוטור צנטריפוגה, JA5.3 </td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה, Avanti&amp;#174; דלקת מוח ויזונה יפנית</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>369003</td><td></td></tr><tr><td>צזיום כלוריד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4036</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם:IAA (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25666-500ML</td><td></td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד (EtBr)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ml</td><td></td></tr><tr><td>אתילנדיאמיןטטרהחומצה אצטית, מלח הדיסודיום, דיהידרט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>תנור היברידיזציה</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10</td><td>37&amp;#x00B0;C &amp;amp; 55&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>בופר ליזיס</td><td></td><td></td><td>סוכרוז 0.75 M, EDTA בריכוז 40 mM, Tris בריכוז 50 mM (pH 8.3)</td></tr><tr><td>ליזוזים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-5G</td><td>125 מ"ג ב-1000 &amp;#x03BC;l TE</td></tr><tr><td>Microcon&amp;#174; יחידת סינון צנטריפוגלית Ultracel YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td>סף של 50 bp</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>פנול:כלורופורם:IAA (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617-500ML</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2539-100</td><td>10 &amp;#x03BC;ג'/מ"ל</td></tr><tr><td>מכשיר דימות בטוח&amp;#8482; טרנס-אילומינטור לאור כחול</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>סודיום דודציל סולפט (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td>20% SDS</td></tr><tr><td>מסנני Sterivex</td><td>Fisher Scientific</td><td>SVG010RS</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>בופר TE, pH 8.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma&amp;#174; בסיס</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>רוטור לאולטרסנטריפוגה, TLA 100</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>343847</td><td></td></tr><tr><td>מבחנת אולטרסנטריפוגה (7X20 מ"מ, PC)</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>מתקן מבחנות לצנטריפוגה אולטרה (Ultracentrifuge)</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>348302</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה, Optima&amp;#174; מקס</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הפקת dna של 0.22 מיקרומטר מסננים sterivex ו כלוריד צסיום צפיפות צנטריפוגה gradient

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

שיטה זו משמשת כדי לחלץ DNA גנומי מולקולרי גבוה משקל מביומסה planktonic התרכז 0.22 מסננים מיקרומטר Sterivex כי טופלו למאגר אחסון / תמוגה לארכיון ב -80 ° C, כדי לטהר את ה-DNA באמצעות שיפוע צפיפות צזיום כלוריד. פרוטוקול מתחיל עם שני שעה צעדים הדגירה לשחרר את ה-DNA מתאי ולהסיר RNA. בשלב הבא, בסדרה של פנול: כלורופורם ו כלורופורם עקירות מבוצעות ואחריו צנטריפוגה להסיר חלבונים בממברנה מרכיבי התא, אוסף של תמצית ה-DNA מימית, וכמה חילופי חיץ צעדים כדי לרחוץ לרכז את תמצית. חלק חמישי מתאר את טיהור אופציונלי באמצעות שיפוע צזיום כלוריד צפיפות. מומלץ לעבוד עם פחות מ 15 דגימות בעת ובעונה אחת, כדי למנוע בלבול ולכרות זמן פרוטוקול. סך כל הזמן הנדרש פרוטוקול זה תלוי במספר דגימות להיעקר. במשך 10-15 דגימות בהנחה צנטריפוגה ציוד מתאים זמין, בפרוטוקול זה כולה צריכה לקחת 3 ימים. ודא שיש לך את התנורים הכלאה מוגדר הטמפרטורה בתחילת התהליך.

אנו מתארים שיטה להפקת גבוה הדנ&quot;א הגנומי משקל מולקולרי מביומסה planktonic התרכז 0.22 מסננים מיקרומטר Sterivex, ואחריו צפיפות צזיום כלוריד צנטריפוגה שיפוע לטיהור.

הפקת DNA של 0.22 מיקרומטר מסננים Sterivex ו כלוריד צסיום צפיפות צנטריפוגה Gradient

שיטה זו משמשת למיצוי DNA גנומי בעל משקל מולקולרי גבוה מביומסה פלנקטונית שהרוכזה על מסנני Sterivex של 0.22 &mu;M אשר עברו...

שלום, אני ג'ודי מהמעבדה של סטיבן הלם במחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה באוניברסיטת הבריטיש קולומביה. היום נדגים לכם פרוצדורה למיצוי DNA גנומי, המרוכז מדגימות מי ים על מסנני STX של 0.2 מיקרון, וטיהור של DNA זה באמצעות סנטריפוגציה במדרג צפיפות של צסיום כלוריד. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתנו כדי להפיק DNA סביבתי, על מנת שנוכל לחקור את מבנה הקהילה המיקרובית, את הגיוון ואת המטבוליזם בסביבות ימיות.בואו נתחיל. התחילו את הפרוטוקול על ידי הפשרה על קרח של סדרת מסננים שריכזתם מבעודם עם ביומסה פלנקטונית, טיפלתם בחוצץ ליזיס והקפאתם לצורך פשטות. כאן אנו מתארים את ההליך לעיבוד של מסנן בודד.בפועל, אנו ממליצים לעבד 15 מסננים או פחות בכל פעם. לאחר שהמסנן הופשר, התחילו את הדגירה הראשונה מבין שתיים: אחת לליזיס של התאים ולהסרת RNA, ואחת לפירוק חלבונים.עבור הדגירה הראשונה, הוסיפו למסנן 100 µL ליזוזים ו-20 µL RN a's a. אטמו שוב את המסנן באמצעות הפרפיום והשאירו אותו להסתובב בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. עבור הדגירה הבאה, הוסיפו למסנן 100 µL protein ace KN ו-100 µL 20%SDS.אטמו שוב את המסנן באמצעות פראפיל והשאירו אותו להסתובב שעה עד שעתיים נוספות. הפעם בטמפרטורה של 55 מעלות. השתמשו במזרק של 5 cc כדי להעביר את הליזאט מהמסנן מסוג Stax לפקעת פלקון של 15 מיליליטר.שטפו את המסנן עם 1 mL של בופר ליזיס והוסיפו את נוזל השטיפה לליזט בתוך פפאלקון. כעת, לאחר שביצעתם ליזיס ועיכול של התאים, אתם מוכנים להוציא את ה-DNA שלהם. השלב הבא הוא שימוש בשיטת הפנול-כלורופורם כדי להוציא את ה-DNA מהליזט.הוסיפו לנבובת הליזאט נפח שווה, כ-three milliliters, של phenol chloroform ו-isoamyl alcohol. ערבבו ב-vortex למשך 10 שניות, ולאחר מכן סובבו את הנבובת ב-2,500 ×g למשך חמש דקות. במהלך הסנטריפוגציה, תערובת הליזאט עם ה-phenol chloroform צריכה להיפרד לשתי שכבות.שכבה אורגנית בתחתית המכילה את הפנול, הכלורופורמה והחלבונים מהדגימה שלכם. ושכבה מימית, בדרך כלל למעלה, המורכבת מה-DNA שלכם, מים ומולקולות הידרופיליות יותר. העבירו את השכבה המימית המכילה את ה-DNA שלכם לשפופרת פלקון (Falcon) חדשה בנפח 15 מיליליטר. לשפופרת זו, הוסיפו נפח שווה של תערובת כלורופורמה ואיסואמיל אלכוהול וערבבו במכשיר וורטקס (vortex) למשך 10 שניות.שלב זה מסיר שאריות פנול מדגימת ה-DNA. סבבו בנ centrifuge במהירות של 2,500 ×g למשך חמש דקות או עד שהשכבה המימית תהיה שקופה. העבירו את השכבה המימית לפלסנקי (falcon tube) חד ומסומן והוסיפו 1 mL של TE ב-pH 8.כעת יש ברשותכם את תמצית ה-DNA. השלב הבא הוא שטיפה וריכוז של דגימת ה-DNA בתוך מבחנה לאולטרה-צנטריפוגה של Amazon בנפח 15 מיליליטר. העבירו את דגימת ה-DNA לתא הסינון של anon.שפופרות Ultra tube theon מורכבות ממסנן העוצר מולקולות במשקל מולקולרי מסוים ומעלה, מהפיה ושפופרת לאיסוף התסנין. במקרה זה, המסנן עוצר את ה-DNA שלכם בספינ של 3,500 ×g למשך 10 דקות. ודאו שנותרה פחות מ-1 ml של נוזל במסנן Amon.אם נותר עוד חומר עצור (retentate), מלאו שוב את המסנן ב-TE וסובבו שוב. העבירו את התסננת (filtrate) או את הנוזל שעבר סינון למבחנת פאלקון אחרת ושמרו אותה במקרר עד לאישור המוצר הסופי על ג'ל; הוסיפו 2 mL של תמיסת TE למסנן וסובבו במהירות של 3,500 ×g למשך שש דקות. הסירו את התסננת כפי שנעשה קודם לכן.שטפו את ה-DNA פעמיים נוספות עם TE לסך של שלושה שטיפות, כאשר בכל פעם שומרים את התסננין עד לסבב הצנטריפוגה האחרון, עד שנותרו 200 עד 500 microliters של Tate במסנן ה-Amon. רשמו את הנפח הסופי והעבירו למבחנה עם מכסה (einor tube) של 1.5 milliliter המסומנת בתווית. הכינו אליקוט של 70 microliter של ה-DNA המרוכז והשטוף לשימוש כמלאי עבודה.יש לשמור את מלאי העבודה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. את יתרת ה-DNA יש להקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. יש לבדוק את ריכוז ה-DNA ואת איכות המוצר הסופי על ידי הרצת הדגימות על ג'ל לצד DNA.סולמות המשמשים כסטנדרטים לגודל ובעוצמה הוכנו על ג'ל 0.8%AROS בתוספת atherium bromide להרצה במהלך הלילה. במספר הנתיבים הראשונים טוענים סולמות עם פסים בעלי משקלים מולקולריים וריכוזים שונים; אנו ממליצים על דפוס הטענה זה: בשני הנתיבים הראשונים, טוענים 10 microliters של one kilobyte plus ladder; בשלושת הנתיבים הבאים, טוענים בהתאמה 2 microliters, 5 microliters ו-10 microliters של 50 nanograms per microliter Lambda H three ladder.לבסוף, טענו חמישה µL של דגימת תמצית DNA לכל נתיב. הריצו את הג'ל במתח של 15 volts למשך כ-16 שעות. צלמו את הג'ל באמצעות מערכת תיעוד ג'ל UV כדי לקבוע את טווח המשקל המולקולרי של ה-DNA ואת ריכוזו.השוו את פסי הדגימה לפסי הסולם. DNA באיכות טובה יהיה בעל משקל מולקולרי גבוה ויציג סימנים מועטים של גזירה או דגרדציה. אם איכות ה-DNA טובה והכמות מספיקה, המשיכו לטיהור ה-DNA על ידי ביצוע גרדיאנט של cesium chloride.בשלב הראשון של הסריפוגציה, יש לסמן מבחנה אחת לכל דגימה. לכל מבחנה, הוסיפו 160 milligrams של cesium chloride ו-178 microliters של genomic DNA. כסו את המבחנה בחתיכה קטנה של פילם והפו אותה בעדינות 10 עד 20 פעמים כדי לערבב את הרכיבים. אין לערבב באמצעות פיפט, שכן הדבר עלול לגרום לשבירה של ה-DNA.לאחר מכן, הוסיפו 10 µL של AUM bromide למבחנה וערבבו שוב. ודאו שהמבחנות מאוזנות היטב לפני הסנטריפוגציה ושההבדלים במשקל בין המבחנות הם פחות מ-1 mg. העבירו את המבחנות לרוטור של האולטרסנטריפוגה באמצעות פינצטה.לאחר מכן, סגרו את מכסה הרוטור והניחו את הרוטור בתוך האולטרה-צנטריפוגה וסגרו אותה. ואקום ייcreated בדלת האולטרה-צנטריפוגה מיד עם סגירת הדלת. הפעילו את המכשיר למשך הלילה, לסך הכל 18 שעות, במהירות של 100,000 RPM ובטמפרטורה של 20 °C.בסיום הסרכזגה, הוציאו את המבחנות מהרוטור באמצעות פינצטה ומספריים והניחו אותן על מעמד. העבירו את המבחנות למכשיר הטרנס-לומינטור (transluminator) עם אור כחול, והנחו את משקפי המסנן הענבריים. לאחר מכן, הדליקו את האור הכחול ואתרו את פס ה-DNA באמצעות מזרק סטרילי של 1 cc עם מחט.הסר את פס ה-DNA והנח אותו בתוך מבחנה של 1.5 מיליליטר כדי לסייע בהשבה של מרב ה-DNA הכלוא בחלל המת במזרק. שטוף את המזרק עם 100 µL TE והוסף את תמיסת השטיפה למבחנה. הכן מבחנה אחת עם 100 µL של באפר TE לכל דגימה כדי למנוע זיהום צולב.להסרת AUM bromide מה-DNA, הוסיפו לשפופרת נפח שווה של מים רוויים בבוטנול. הפכו את השפופרות בעדינות, 10 עד 20 פעמים, סבבו בצנטריפוגה במהירות של 10,000 RPM למשך דקה אחת והשליכו את השכבה העליונה. חזרו על השטיפה כ-3 עד 4 פעמים נוספות, עד שצבע הבוטנול יהיה שקוף.העבירו ארבעה מיליליטרים של TE למבחנה עבור אולטרה-צנטריפוגה מסוג ancon והוסיפו את תמיסת ה-DNA מהצנטריפוגה לעיל ב-3,500 ×g בטמפרטורת החדר עד שנפח ה-DNA יצטמצם לכ-100 עד 500 מיקרוליטרים, והשליכו את הנוזל שעבר סינון. הוסיפו שני מיליליטרים של TE למסנן Amazon וסובבו בצנטריפוגה ב-3,500 ×g למשך שש דקות. חזרו על הפעולה פעמיים, לסך הכל שלושה שטיפות עם TE. רכזו לנפח סופי של 50 עד 100 מיקרוליטרים באמצעות צנטריפוגה נוספת במידת הצורך.העבירו את תמיסת ה-DNA מהמסנן לשפופרת EINOR חדשה בנפח 1.5 מיליליטר. הוסיפו 40 µL של TE למסנן ובצעו שאיבה ופליטה (pipette up and down) לאורך שתי ממברנות המסנן כדי לשטוף את שאריות ה-DNA. הוסיפו תמיסה זו לשפופרת המכילה את ה-DNA המרוכז.הנח יחידת סינון MicroCon YM 30 לתוך מבחנה של MicroCon ובצע שטיפה מקדימה של ה-MicroCon על ידי הוספת 200 microliters של מים שעברו אוטוקלאב וסבוב בצנטריפוגה במהירות של 10,000 RPM למשך שבע דקות. הוסף את תמיסת ה-DNA ל-MicroCon שעבר שטיפה מקדימה; כדי לרכז את ה-DNA עוד יותר, סבב בצנטריפוגה ב-5,000 עד 10,000 times G למשך דקה אחת עד שלוש דקות. בדוק את כמות הנוזל על המסנן וחזור על הסבוב בצנטריפוגה עד שכמות הנוזל על המסנן תצטמצם לכ-50 microliters.הניחו את יחידת הסינון באופן הפוך בתוך נבובת MicroCon חדשה וסבבו בצנטריפוגה ב-1000 ×g למשך שלוש דקות. הכמות האידיאלית של התמיסה המרוכזת היא 50 עד 60 µL. העבירו את דגימת ה-DNA לנבובת einor חדשה בנפח 1.5 mL.מדוד את ריכוז ה-DNA באמצעות NanoDrop ובדוק את איכות השיא. גרף של בליעות עבור DNA נקי אמור להראות שיא ברור ב-260 ננומטר. הקפא את שארית ה-DNA בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס.כאשר פרוטוקול זה מבוצע נכון, עליכם לראות תמונת ג'ל הדומה לאיור 1; ריכוז ה-DNA בפועל של התמציות ישתנה בהתאם למקור הדגימה. כאשר פרוטוקול זה מבוצע נכון, עליכם לראות בבירור פס DNA במרכז המבחנה. כפי שמוצג באיור 2, הדגמנו כעת כיצד להפיק genomic DNA ממסנני sterex ולטהר אותו באמצעות מדרג צפיפות של caesium chloride.בעת ביצוע הליך זה, חשוב לוודא לפני התחלת העבודה שכל הרכיבים והחומרים המתכלים הדרושים נמצאים בהישג יד. שנית, תכננו לפחות שלושה ימי עבודה מלאים כדי להבטיח זמן מספיק להשלמת ההליך בצורה קפדנית. זהו כל השלב.תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.

dna-extraction-from-022-m-sterivex-filters-cesium-chloride-density

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מתודולוגיה לבודד משקל מולקולרי גבוה גבוה DNA הגנומי איכות מהקהילה חיידקים בקרקע מתואר.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

DNA-איזוטופ יציב חיטוט היא שיטת טיפוח עצמאית לזהות ולאפיין הקהילות פעיל של מיקרואורגניזמים המסוגלים ניצול מצעים ספציפיים. הטמעת מצע מועשר באיזוטופ הכבד מוביל התאגדות של אטומים שכותרתו לתוך ביומסה של חיידקים. שיפוע ultracentrifugation צפיפות מאחזר DNA שכותרתו עבור ניתוחים מולקולריים במורד הזרם.

DNA-איזוטופ יציב גשוש (ה-DNA SIP)

אנו מספקים פרוטוקול משופר לחילוץ משקל מולקולרי גבוה DNA של חיידקים מחצלות hypersaline. תאים מיקרוביאלית מופרדים המטריצה ​​מחצלת לפני מיצוי DNA וטיהור. זה משפר את הריכוז, איכות, גודל של ה-DNA. הפרוטוקול ניתן להשתמש בדגימות עקשן אחרים.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל של מאטס מיקרוביאלית

סרטון זה מתאר את הטכניקה של חילוץ שלפוחיות חוץ-תאיות מרקמות טריות או קפואות. ניתן להשתמש בשלפוחיות החוץ תאיות המבודדות לניתוח נוסף כדי לחשוף את תפקידיהן המשמעותיים בפתוגנזה של מחלות.

מיצוי שלפוחית חוץ-תאית: טכניקה לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות מדגימות רקמות שלמות באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית

סרטון זה מדגים את שיטת הטיהור מבוססת צפיפות גרדיאנט אולטרה-צנטריפוגה לבידוד תת-אוכלוסיות של שלפוחיות חוץ-תאיות המתאימות למחקרי אפיון.

טיהור תת-אוכלוסיות של שלפוחיות חוץ-תאיות: טכניקה לטיהור תת-אוכלוסיות של שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות אולטרה-צנטריפוגה של שיפוע צפיפות

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לבודד שלפוחית חוץ-תאית קטנה (EVs) של כל הרקמות, כולל דגימות המוח ואת הגידול. שיטה זו מציעה שיטה לשחזור כדי לחלץ EVs מרקמות מוצק עבור נוסף במורד הזרם ניתוחים.

מיצוי של שלפוחית חוץ-תאית מרקמות כל

חיידקים מפרישים שלפוחיות חוץ-תאיות בגודל ננומטר (EVs) הנושאות מולקולות ביולוגיות ביו-אקטיביות. מחקר EV מתמקד בהבנת הביוגנזה שלהם, תפקידם באינטראקציות ובמחלות בין מיקרובים למיקרובים ולמיקרובים מארחים, כמו גם ביישומים הטיפוליים הפוטנציאליים שלהם. זרימת עבודה לבידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים מחיידקים שונים מוצגת כדי להקל על סטנדרטיזציה של מחקר EV.

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

הפרוטוקול הנוכחי מספק תיאורים מדוקדקים לבידוד, ריכוז ואפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות מתרביות ציאנובקטריאליות. כמו כן נדונו גישות לטיהור בועיות מתרבויות בקני מידה שונים, פשרות בין מתודולוגיות ושיקולים לעבודה עם דוגמאות שטח.

בידוד ואפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות ציאנובקטריאליות

מחקר זה מתאר שיטה לבידוד וטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות (BEVs) המועשרות מצואת אדם באמצעות צנטריפוגת שיפוע צפיפות (DGC), מזהה את המאפיינים הפיזיים של BEV ממורפולוגיה, גודל חלקיקים וריכוז, ודן ביישומים האפשריים של גישת DGC במחקר קליני ומדעי.

בידוד וטיהור שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות מצואת אדם באמצעות צנטריפוגת שיפוע צפיפות

כאן, אנו מציגים טכניקה פשוטה להערכת עמידות אנטי-מיקרוביאלית סביבתית (AMR) על-ידי שיפור שיעור הדנ"א החוץ תאי בעל משקל מולקולרי נמוך. טיפול קודם עם 20%-30% PEG ו-1.2 M NaCl מאפשר זיהוי של גנים AMR גנומיים ואופקיים. הפרוטוקול משאיל את עצמו לתהליך ללא ערכה עם אופטימיזציה נוספת.

מיצוי משופר של DNA במשקל מולקולרי נמוך משפכים להערכה מקיפה של עמידות מיקרוביאלית 

למדו לחלץ DNA גנומי ממסנני Sterivex בקוטר 0.22 מיקרומטר מדגימי פלנקטון ימי ולטהרו באמצעות מדרגת צפיפות כלוריד צסיום. שיטה זו מספקת DNA בעל משקל מולקולרי גבוה לניתוח קהילות מיקרוביאליות.

הפקת DNA של 0.22 מיקרומטר מסננים Sterivex ו כלוריד צסיום צפיפות צנטריפוגה Gradient

גלה סרטונים נוספים