Name: Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: למדו טכניקות מיקרו-הזרקה לחקר מיטוזה בעוברים סינסיציאליים של Drosophila melanogaster באמצעות הדמיה ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מאפשרת לחקור דינמיקת חלוקת תאים ותפקוד חלבונים מיטוטיים בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרוטוקול זה משמש כיום במעבדה שלנו שוכללה במרוצת השנים על ידי אנשים רבים, כולל בני הזוג דוד שארפ, Mijung קוון, פטריציה Sommi, Dhanya Cheerambathur. אנו מודים ד&quot;ר ביל סאליבן (UCSC), אשר סיפק לנו עצה מצוינת על מניפולציה ו microinjection מוקדם של עוברים תסיסנית כאשר עבודתנו במערכת זו היה להיות יזם (ref. 13). אנו מודים לכל חברי המעבדה Scholey. העבודה שלנו על מיטוזה ב תסיסנית נתמך על ידי NIH מענק GM55507.

מתכונים: מיץ ענבים צלחות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5.5g אגר bacto </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 14.5 גרם גלוקוז או דקסטרוז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 7.15 גרם סוכרוז </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 45 מ&quot;ל מיץ ענבים להתרכז (100% מיץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 204.5 מ&quot;ל H 2 0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 625 μl 10N NaOH </li></ul> מערבבים את כל החומרים, מיקרוגל עד רתיחה. הוסף 2.8 מ&quot;ל חומצה תערובת (תערובת חומצות: חומצה 20.9 מ&quot;ל propionic, 2.1 חומצה זרחתית מ&quot;ל, 27 מ&quot;ל H 2 0) מערבבים ויוצקים על 35 מ&quot;מ צלחות פטרי. בואו לחזק בטמפרטורת החדר למשך יום או יומיים. אם צלחות לא הולכים לשמש בקרוב, חותם עם parafilm ולשמור על 4 ° C (כדי לאפשר לאזן RT לפני השימוש). שמרים להדביק: ממיסים על כפית אחת של שמרים (Sigma YSC2, שמרים מ Saccharomyces cerevisiae סוג II) במים ליצירת עיסה סמיכה. מניחים כמות קטנה של זה על כל צלחת מיץ ענבים רק לפני השימוש. G-PEM חיץ: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 80 mM Na-צינורות, pH 6.9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 mM MgCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 mM EGTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 mM GTP </li></ul> הזרקת חיץ: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 150 מ&quot;מ K-Aspartate </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 mM K-פוספט </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 מ&quot;מ imidazole, pH 7.2 </li></ul> Heptane דבק: לגולל סרט דביק כפול מקום בבקבוק 100 מ&quot;ל, 50 מ&quot;ל להוסיף על heptane, החותם את הבקבוק, סלע במשך כמה ימים. בעת השימוש, להוסיף heptane אם הדבק סמיך מדי. התייבשות קאמרית: קח צלחת פטרי 100 מ&quot;מ, לשים חלק אחד של צלחת 35 מ&quot;מ בתוך לעשות &quot;שולחן&quot; ולהוסיף Drierite (סידן גופרתי anhydrous) סביבו, כך גובה Drierite אינו גבוה יותר מאשר &quot;שולחן&quot; ואת כיסוי. Coverslip עם עוברי יושם על &quot;שולחן&quot; זה התייבשות לפני הזריקה. זה רעיון טוב להשתמש לפחות חלק Drierite המציין ולשנות כשזה השתנה צבע. פרוטוקול: פרוטוקול זה יכול לשמש הזרקת מגיב כמעט כל מסיס לתוך העובר תסיסנית סינסיציאלי: לדוגמה, או חלבון פלואורסצנטי להסתכלות או מעכב חלבון מטרה או שניהם. התחלת הכל מוכן: 1 .- 2 עד 3 ימים לפני הניסוי, לעשות צלחות מיץ ענבים ולהקים להניח בכלוב: קחו בקבוק פלסטיק (6 גר &#39;, תחתית עגולה מ יישומית מדעי תסיסנית), לחתוך שני חורים קטנים (כ 1cm 2) משני צדי המתרס של בקבוק ולמלא עם פיסת צמר גפן (זה יאפשר זרימת אוויר), הקש על זבובים לתוך הבקבוק ומכסים עם צלחת מיץ ענבים. שמור על 25 ° C (או בטמפרטורת החדר), זבובים צריך להניח עוברים כ 10 ימים. 2 .- לפחות יום אחד לפני הניסוי למשוך מחטים להזרקה, אנו משתמשים מחט Kopf / פיפטה מודל חולץ 720 דק סיבי זכוכית חומה (World Precision מכשירים tw100f). עבור זריקה של טובולין ניאון, לשמור מחטים ב 4 ° C כדי למנוע הטמפרטורה הנגרמת פילמור את המחט. טובולין הכנה: הערה: כל לעבוד עם טובולין צריך להיעשות על 4 ° C כדי למנוע פילמור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח טובולין שכותרתו מהמקפיא והניח אותו על קרח למשך 5 עד 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל עם G-PEM חיץ (4 עד 10 לקפל תלוי בעוצמת חובה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בסל&quot;ד 13k ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 1-2 μl לתוך מחט. </li></ol> נוגדן או מעכב כימי: הכן מחטים כמו טובולין, באמצעות ריכוז המתאים (זה ייתכן שיהיה צורך לבדוק). הנוגדן יכול להיות חיץ הזרקה, G-PEM חיץ או PBS. אם עוד חיץ נדרשת, המאגר הזה יצטרך להיות מוזרק כביקורת על מנת לוודא חיץ זה לא גורם נזק משלה. הערה: מעכבי טובולין ו ניאון יכול להיות מעורב והזריקו יחד אם ריכוזי מאפשרים זאת. אחרת, להזריק את טובולין פלורסנט לחכות 5 עד 10 דקות לפני הזרקת מעכבי. בעת ביצוע הזרקה כפולה, להתחיל עם עוברי יותר, שכן עוברים פחות יתאושש כרגיל. העובר באוסף: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים מיץ ענבים חדש על צלחת הכלוב מונח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת אחרי שעה אחת, זהו האוסף הראשון של היום, ולעתים קרובות הוא לא כל כך טוב. זה יכול להיות מושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את הצלחת בכל שעה כדי לשמור על עוברי איסוף במשך שעה אחת. </li></ol> Coverslip הכנה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 50 x 22mm coverslip בצד אחד של המיקרוסקופ שקופית. Tape בארבע פינות לשקופית, כך שהוא לא זז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש כותנה היטה המוליך, לשים שכבה אחת של דבק heptane בשורה אחת על coverslip (דבק לא צריך להיות צמיגה ויש יבש כמה שניות, אחרת להוסיף heptane יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים חתיכתכפול סרט דביק בשקופית לעבר הצד של coverslip. </li></ol> העובר הכנה: הערה: עוברים צריך להיות צילמו כ 2 שעות לאחר תחילתו של האוסף, כך להתחיל את הצעדים הבאים לאפשר מספיק זמן כדי לסיים אותם בתוך מסגרת זמן זו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מכחול לח בזהירות להרים את העוברים מהצלחת מיץ הענבים ומניחים על נייר דבק כפול בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בחלק החיצוני של פינצטה, לגלגל את העוברים על הקלטת דביק כפול עד סיסית (הקרום החיצונית) שובר פתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי את העובר על ידי בעדינות מגלגלים אותו על סיסית כך שהוא נדבק פינצטה ולמקם אותו על הדבק heptane על coverslip עם הצד הארוך מקביל העובר לצד ארוכה של coverslip. הגדרת 10-20 עוברים בשורה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את coverslip ולמקם אותו בחדר התייבשות במשך 3 עד 8 דקות (זה תלוי לחות החדר ואת הסכום להיות מוזרק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים על חדר מתכת עם גריז ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את העוברים עם 700 שמן halocarbon כדי למנוע התייבשות נוספת. עוברים כעת מוכן להזרקה. </li></ol> העובר הזרקה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את העוברים תחת מטרה 16x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים הלאה, למצוא את המחט מבלי להזיז את מישור המוקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכז את המחט ולהעביר אותה מבלי להזיז אותה בכיוון x או y. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המחט אינה פתוחה, לשים את הקצה של coverslip בתחום של נוף, אבל לא איפה המחט תהיה, ולהפחית את המחט למישור מוקד זהה. בזהירות רבה להעביר את coverslip עד שהוא מגיע המחט בעדינות שובר אותו פתוח. אם המחט פתוחה, עבור לשלב 5. (מחטים ניתן לפתוח עם חומצה הידרופלואורית לפני מילוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את העוברים בתצוגה (אבל לא איפה המחט יהיה), להוריד את המחט לתוך השמן וודא שאתה להשיג טיפות נוזל נחמד המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות אבל בהתמדה להזיז את העובר לתוך המחט ולהזריק ירידה לתוך העובר ולעבור את העובר משם. (או בצע את ההוראות של מכשיר הזרקה שלך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל העוברים היו מזריקים, הם מוכנים לצורך השגחה על מיקרוסקופ confocal. </li></ol> דימות: תמונה העוברים על מיקרוסקופ confocal במטרה 60 או 100x: הערות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרווח הזמן על סדרת זמן לשגות צריך להיות שניות ספורות ביותר, מאז מיטוזה בעובר הוא מהיר מאוד, בהתאם לתהליך המדויק כדי להיחקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרת 3D או מטוס אחד ניתן לרכוש בהתאם בתהליך של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מהיר משחק מעכבי, העברת מ מיקרוסקופ הזרקה אל מיקרוסקופ הדמיה חייב להיות מהיר. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1382/1382fig1.jpg" alt="דמות 1" /> איור 1: לימוד מיטוזה בעובר תסיסנית סינסיציאלי. גרעינים בעובר מוקדם לעבור חטיבות מהיר ללא cytokinesis, במהלך 10 מחזורים באמצעות טופס 13 גרעינים monolayer על קליפת.. סכמטי של העובר המוקדם עם גרעינים על קליפת המוח. העובר יכול לבטא את ה-GFP ו / או RFP חלבונים שכותרתו וניתן microinjected עם חלבונים שכותרתו אחרים ו / או מעכבי. פקיעה ב זמן הדמיה של העובר מביע GFP-טובולין ו-RFP היסטון. מגרש ג ההפרדה מוט מוט במשך 11 מחזורים , 12 ו -13 בעובר סוג בר. אורך ציר מפגין תקופות של אורך איזומטרי ותקופות של התארכות, אשר עולות בקנה אחד מאוד לשחזור. Dynamics ד microtubules ציר. הזרקה של ריכוז נמוך של טובולין rhodamine מוביל speckles יצרו של טובולין כמה יחידות משנה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי ללמוד הדינמיקה microtubule.

<ol><li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+dynamics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle dynamics in Drosophila.</a> Int Rev Cytol. 259, 139-172 (2007).</li>
<li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+system+in+Drosophila%3A+a+fly+geneticist%27s+Swiss+army+knife%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34, 1-15 (2002).</li>
<li>Morris, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+methods+for+analyzing+the+functions+of+kinesins+in+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microinjection methods for analyzing the functions of kinesins in early embryos.</a> Methods Mol Biol. 164, 163-172 (2001).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Sommi, P., Cheerambathur, D. K., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-5-dependent+poleward+flux+and+spindle+length+control+in+Drosophila+embryo+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinesin-5-dependent poleward flux and spindle length control in Drosophila embryo mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20, 1749-1762 (2009).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Kwon, M., Mogilner, A., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+anaphase+B%3A+role+of+three+mitotic+motors+in+a+switch+from+poleward+flux+to+spindle+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Model for anaphase B: role of three mitotic motors in a switch from poleward flux to spindle elongation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15938-15943 (2004).</li>
<li>Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+flux+and+sliding+in+mitotic+spindles+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule flux and sliding in mitotic spindles of Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 13, 3967-3975 (2002).</li>
<li>Cheerambathur, D. K., Brust-Mascher, I., Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+partitioning+of+mitotic+kinesin-5+crosslinkers+between+microtubule-bound+and+freely+diffusing+states%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic partitioning of mitotic kinesin-5 crosslinkers between microtubule-bound and freely diffusing states.</a> J Cell Biol. 182, 421-428 (2008).</li>
<li>Cheerambathur, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+an+anaphase+B+switch%3A+predicted+role+for+a+microtubule+catastrophe+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of an anaphase B switch: predicted role for a microtubule catastrophe gradient.</a> J Cell Biol. 177, 995-1004 (2007).</li>
<li>Kwon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromokinesin%2C+KLP3A%2C+dives+mitotic+spindle+pole+separation+during+prometaphase+and+anaphase+and+facilitates+chromatid+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The chromokinesin, KLP3A, dives mitotic spindle pole separation during prometaphase and anaphase and facilitates chromatid motility.</a> Mol Biol Cell. 15, 219-233 (2004).</li>
<li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+coordination+of+three+mitotic+motors+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional coordination of three mitotic motors in Drosophila embryos.</a> Mol Biol Cell. 11, 241-253 (2000).</li>
<li>Sharp, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bipolar+kinesin%2C+KLP61F%2C+cross-links+microtubules+within+interpolar+microtubule+bundles+of+Drosophila+embryonic+mitotic+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles.</a> J Cell Biol. 144, 125-138 (1999).</li>
<li>Sharp, D. J., Rogers, G. C., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+dynein+is+required+for+poleward+chromosome+movement+during+mitosis+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic dynein is required for poleward chromosome movement during mitosis in Drosophila embryos.</a> Nat Cell Biol. 2, 922-930 (2000).</li>
<li>Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+microtubule-sliding+motors+position+mitotic+centrosomes+in+Drosophila+early+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos.</a> Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M., Desai, A., Bulinski, J. C., Salmon, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy%2C+a+method+to+visualize+the+dynamics+of+protein+assemblies+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy, a method to visualize the dynamics of protein assemblies in living cells.</a> Curr Biol. 8, 1227-1230 (1998).</li>
</ol>

פרוטוקול זה היא פשוטה יחסית, עם זאת, כל צעד דורשת תרגול כדי לוודא את העוברים שאינם פגומים. ניסויים בקרה קפדנית תמיד צריך להיעשות כדי להבטיח תוצאות אמינות עוברים שהושגו. דרך טובה להתחיל זאת היא על ידי microinjecting טובולין חיץ או rhodamine לעוברי לשלוט בהבעת GFP-טובולין לוודא כי מיטוזה התמורה בדרך כלל דרך מחזורי כל העובר על פני השטח (מחזורים 10 עד 13). בשנת עוברים בקרת אתה לא צריך לצפות כל חיבורים פיזיים בין spindles אשר לעתים תוצאה של התייבשות יותר מדי, כך נמוך יותר זמן התייבשות....

microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

פרוטוקול זה מתאר את השימוש של העובר תסיסנית melanogaster סינסיציאלי ללימוד מיטוזה 1. תסיסנית יש גנטיקה שימושי עם רצף הגנום, וזה יכול להישמר בקלות מניפולציות. מוטנטים mitotic רבים קיימים, וזבובים מהונדס המבטא פונקציונלי fluorescently (GFP למשל) - חלבונים mitotic מתויג כבר והם שנוצר. ביטוי גנים ממוקד אפשרי באמצעות מערכת GAL4/UAS 2. העובר תסיסנית מוקדם מבצעת mitoses מרובים במהירות רבה (משך מחזור התא, ≈ 10 דקות). זה גם מתאים הדמיה מיטוזה, כי במהלך מחזורי 10-13, גרעינים לחלק במהירות סינכרוני בלי להתערב cytokinesis על פני השטח של העובר בשכבה יחידה רק מתחת לקליפת המוח. גרעינים אלה במהירות לחלק מן הסתם להשתמש במכונות mitotic כמו תאים אחרים, אבל הם אופטימיזציה עבור מהירות, המחסום הוא האמין בדרך כלל לא להיות מחמירים, המאפשרים לימוד של חלבונים mitotic שחסרונו יגרום מחזור התא בתאי מעצר עם מחסום חזק . עוברים לבטא חלבונים GFP שכותרתו או microinjected עם חלבונים שכותרתו fluorescently ניתן הדמיה בקלות לעקוב אחר הדינמיקה חיים (איור 1). בנוסף, עוברים ניתן microinjected עם פונקציית חסימת נוגדנים או מעכבי חלבונים ספציפיים כדי לחקור את ההשפעה של אובדן או ההפרעות בתפקוד שלהם 3. ריאגנטים אלה יכולים לפזר לאורך העובר, והגיע spindles רבים לייצר שיפוע של ריכוז מעכב, אשר בתוצאות פונים שיפוע של ליקויים דומים סדרה allelic של מוטציות. באופן אידיאלי, אם חלבון המטרה היא שכותרתו fluorescently, שיפוע של עיכוב ניתן דמיינו ישירות 4. ההנחה היא כי הפנוטיפ החזקים ניתן להשוות פנוטיפ ריק, אם כי קשה רשמית לשלול את האפשרות כי הנוגדנים יש תופעות הדומיננטי במקרים נדירים, בקרות מחמירות כל כך פרשנות זהירה חייב להיות מיושם. הרחק הזריקה, תפקוד החלבון הוא רק איבד חלקית ומאפשר פונקציות אחרות של חלבון המטרה להיות ברור.

פרוטוקול זה מתאר את השימוש microinjection הדמיה ברזולוציה גבוהה של<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; העובר סינסיציאלי ללמוד מיטוזה.

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בעובר סינציטיאלי של Drosophila melanogaster למחקר של מיטוזה. ל-Drosophila גנטיקה שימושית עם רצף...

הליך זה מתחיל באיסוף עוברים מלוחות מיץ ענבים טריים לאחר 30 עד 60 דקות. לאחר הוצאת הלוח מכלוב האגם, אספו את העוברים בעזרת מברשת לחה והניחו אותם על סרט דביק כפול. גלגלו בעדינות עובר אחד על הסרט באמצעות חצי מפינצטה עד לפריצת הקוריון.הרימו את העובר והניחו אותו בעדינות על כיסוי הזריקה. החליקו מעליו שכבה של דבק het. חזרו על פעולה זו עד שיהיו בידיכם מספיק עוברים.לאחר הדהידרציה, העוברים מוכנים להזרקה. שלום, אני אינגריד ברוס מושר מהמעבדה של ד"ר Jonathan Sculley במחלקה לביולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת קליפורניה דייוויס. היום נדגים לכם פרוצדורה להזרקה מיקרוסקופית לעוברים סינציטליים של דרוסופילה.אנו משתמשים בהליך זה כדי לחקור את תפקידם של המיקרוטובולים ומנועים מבוססי קינזין במטוזה. לדוגמה, אנו מזריקים במיקרו-הזרקה נוגדנים או מעכבים אחרים של חלבונים מיטוטיים ספציפיים. באמצעות ניתוח השפעת המעכב על המיטוזה, אנו יכולים לקבוע את תפקוד חלבוני המטרה.אם כך, נתחיל. כדי להתחיל בהכנות יומיים עד שלושה ימים לפני הניסוי, הכינו את כלוב ההטלה על ידי חיתוך שני חורים קטנים של כסנטימטר רבוע בצדדים מנוגדים של בקבוק פלסטיק. מלאו את החורים בפיסת צמר גפן, באופן המאפשר זרימת אוויר.הקישו את הזבובים לתוך הבקבוק ולאחר מכן כסו אותו עם פלטת מיץ ענבים. עבור שמרים, שמרו את כלוב הרגליים בטמפרטורת החדר; הזבובים יטילו ביצים למשך עד 10 ימים, לפחות יום אחד לפני הניסוי. שלפו מחטים להזרקה ושמרו אותן בטמפרטורה של 4 °C.ביום הניסוי, יש להכין ולהטעין את המחטים. ראשית, הוציאו את ה-tubulin המסומן מהמקפיא והניחו אותו על קרח למשך חמש עד 15 דקות. לאחר מכן, דללו אותו עם GPEM buffer וסובבו אותו בצנטריפוגה למשך 10 עד 15 דקות במהירות של 13,000 RPM בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לבסוף, טענו מיקרוליטר אחד עד שניים למחט ושמרו אותה בטמפרטורה של 4 °C, כדי למנוע פולימריזציה במחט שנגרמת מהטמפרטורה. לפני התקנת לבי 유리 (cover slip), הכינו דבק הפטאן על ידי גלגול סרט דביק דו-צדדי והנחתו בבקבוק של 100 mL.הוסיפו כ-50 milliliters של heptane, אטמו את הבקבוק ונערנו אותו בעדינות במשך מספר ימים. לפני הכנת העוברים, הכינו תא דהידרציה שבו ימוצבו העוברים לפני ההזרקה. לשם כך, הניחו צלחת של 35 millimeter בתוך Petri dish של 100 millimeter כדי ליצור מעין שולחן, והוסיפו סביבו חומר מייבש, שהוא anhydrous calcium sulfate, כך שגובה החומר המייבש לא יעלה על גובה השולחן, וכסו את המכל.כדי להתחיל בהכנת העוברים, ראשית, אספו אותם מכלוב האגם על ידי החלפת פלטת מיץ הענבים עם השמרים מדי שעה; יש לצלם את העוברים כשעתיים לאחר תחילת האיסוף. להכנת הזכוכית למחסה, הניחו אותה על צד אחד של זכוכית מיקרוסקופ, והדביקו את ארבע הפינות בעזרת סרט דביק כדי למנוע תזוזה. בעזרת מקלוני צמר גפן, מרחו שכבה אחת של דבק heptane בקו על גבי הזכוכית למחסה.הדבק לא צריך להיות צמיגי ועליו להתייבש תוך שניות ספורות. אם הוא סמיך מדי, יש להוסיף heptane. לבסוף, הצמד פיסת סרט דביק דו-צדדי לשקף לצד כיסוי הזכוכית.החלק בעזרת מברשת לחה. הרם בזהירות את העוברים ממעטחת מיץ הענבים והנח אותם על הסרט הדביק הדו-צדדי שעל הזכוכית. לאחר מכן, השתמש בחצי של פינצטה כדי לגלגל את העוברים על הסרט הדביק עד לפריצת הקוריון.הרימו את העובר על ידי גלגול עדין שלו על פני ה-Corian כך שיידבק לפינצטה, והניחו אותו על דבק ההפטאן שעל הזכוכית של מכסה המבחנה. החליקו את העובר כך שהצד הארוך שלו יהיה מקביל לצד הארוך של הזכוכית. הניחו 10 עד 20 עוברים בשורה אחת.הסיר את מכסיות הזכוכית והנח אותה בתא דהידרציה למשך שלוש עד שמונה דקות. הזמן תלוי בלחות המקומית ובכמות להזרקה. לאחר מכן, הנח את מכסיות הזכוכית על תא מתכת עם גריז ואקום.לבסוף, כסו את העוברים בשמן הלוקארבון (halocarbon oil) כדי למנוע התייבשות נוספת. העוברים מוכנים כעת להזרקה. ראשית, אתרו את העוברים תחת עדשה של 16x.הרחיקו את העוברים ואתרו את המחט מבלי לשנות את מישור המיקוד. מרכזו את המחט והניעו אותה כלפי מעלה מבלי להזיזה בציר ה-X או ה-Y. כדי לפתוח את המחט, הניחו את קצה זכוכית הכיסוי בתוך שדה הראייה, אך לא במיקום שבו תהיה המחט.הנמיקו את המחט לאותו מישור מוקד. הזיזו בזהירות רבה את זכוכית הכיסוי עד שתפגע במחט ותשבור אותה בעדינות. הרימו את המחט למעלה.כעת הגבירו את העוברים לשדה הראייה. הורידו את המחט אל תוך השמן, וודאו שמתקבלים טיפות נוזל יפות מקצה המחט. העבירו את העובר ביציבות לעבר המחט, הזריקו טיפה לתוך העובר, ולאחר מכן הרחיקו את העובר.לאחר שכל העוברים הוזרקו, הם מוכנים לתצפית במיקרוסקופ קונפוקאלי עם עדשה של 60 או 100 x. עובר ביקורת אמור להיראות כמו זה שבסרטון זה. זהו עובר המבטא GFP tubulin ו-RFP histone, שצולם בעדשה של 100 x במיקרוסקופ קונפוקאלי מסוג spinning disc.הזמן הכולל המוצג הוא שמונה דקות. גרפים של המרחק מקוטב לקוטב הם בעלי הדירות גבוהה ומהווים מדד אמין להצלחה בעוברים של קבוצת הביקורת. עליהם להיראות כפי שמוצג כאן עבור מחזורים 11 עד 13.בסרטון זה מוצג עובר ביקורת נוסף. עובר זה מבטא KLP 61 FGFP והוזרק עם r Domine tubulin. גם תמונה זו צולמה באמצעות עדשה פי 100 במיקרוסקופ קונפוקלי עם דיסקה מסתובבת (spinning disc confocal), והזמן הכולל הוא שבע דקות.סרטון זה הוקלט מיד לאחר מיקרו-הזרקה, והמדרג בריכוז של r Domine tubulin נראה בבירור בתחילת הסרטון. ניתן להשתמש בעובריים אלה כדי לחקור את עיכובו של Klp 61 F לאחר מיקרו-הזרקה של נוגדן ל-Klp 61 F. ניתן לראות את אובדנו של Klp 61 FGFP מהכישורים.הרגע הדגמנו כיצד לבצע מיקרו-הזרקה לעוברי דרוסופילה בשלב החיתוך. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבצע בקרות, להתאמן תחילה על הזרקה של בופר או רוטין לבדם, ולוודא שהמיטוזה נמשכת כסדרה דרך השלב התאי. ברגע שכל ההזרקות שלכם יהיו אמינות ולא יגרמו לנזק, תוכלו להזריק מעכב ולבחון את ההשפעה של עיכוב ספציפי זה.זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.

microinjection-techniques-for-studying-mitosis-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Kinetochore שם SAC יוזם האות שלה ניטור הפרדה mitotic של chromatids אחותו. השיטה מתוארת לדמיין את גיוס מחזור של אחד החלבונים kinetochore ותיאום עם תנועה...

לימוד מחסום mitotic ידי הממחישות התנהגות חלבון דינמי Kinetochore ו Motion כרומוזום חיים<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברים סינסיציאלי

בשל גודלם הגדול וארגונם הפשוט יחסית, תאי אחות דרוזופילה מתאימים באופן אידיאלי למחקרי הדמיה של תאים חיים. סרטון זה מתאר שיטת מיקרו-הזרקה להעברת תרכובות אקסוגניות לתוך התאים, והפרוטוקול המוצג מדגים את ההליך עם בדיקות אוליגונוקלאוטיד פלואורסצנטיות הנקראות משואות מולקולריות (MBs) המשמשות להדמיית תעתיקי mRNA אנדוגניים.

מיקרו-הזרקה של תאי אחות דרוזופילה: שיטה להעברה תוך-תאית

סרטון זה מתאר כיצד לבצע מיקרו-הזרקות המעבירות ריאגנטים לעוברי דרוזופילה חיים. חוקרים יכולים להשתמש בשיטה זו כדי להציג תרכובות אקסוגניות כמו חומצות גרעין וחלבונים בשלבים המוקדמים של התפתחות העובר. הפרוטוקול המוצג מדגים כיצד להגדיר ולבצע את ההליך להזרקה של כל מגיב מסיס - כאן, חלבון פלואורסצנטי לניסויי הדמיה חיים.

מיקרו-הזרקה של עוברי דרוזופילה חיים: מסירה מוקדמת של ריאגנטים לעובר המתפתח

אנו מציגים טכניקה לסימון תאי עצב בודדים במערכת העצבים המרכזית (CNS)...

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור ויזואליזציה, זיהוי, ניתוח ומעקב של סחר האנטי-מסוגגני mRNA בחיים Drosophila ילה מלאנוסטר תא ביצה באמצעות משואות מולקולריות, מיקרוסקופיה דיסק מסתובב, וניתוח קוד פתוח תוכנה.

חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

המטרה של פרוטוקול זה היא להזריק רודמין מצומד אקטין כדורי לתוך עוברים Drosophila ואת התמונה הרכבה מוט actin תוך גרעיני בעקבות עומס חום.

הדמיה מוטות Actin תוך-גרעיניים בחום חי הדגישו עוברי דרוזופילה

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

מאמר זה לוקח את הטרנסגנזה בתיווך אינטגראז phiC31 בדרוזופילה כדוגמה ומציג פרוטוקול אופטימלי למיקרו-הזרקה עוברית, צעד מכריע ליצירת זבובים טרנסגניים.

מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה חיה של החלוקה הא-סימטרית של תאי גזע של קו הנבט (GSCs) בנישת השחלות של דרוזופילה. אנו משתמשים בקו טרנסגני המבטא בכל מקום היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של חלבון הספקטרוזום Par-1.

הדמיה חיה מורחבת של נישות תאי גזע נקבות Drosophila melanogaster

פרוטוקולים אלו מתארים כיצד לאפיין את הארגון ותפקוד החסימה של צמתקי מחיצה מקופלים באפיתל העוברי של דרוזופילה.

ניסויי צביעת חיסון וחדירת צבע להגדרת חלבוני צומת ספטט מקופלים בליבה באפיתל עוברי של דרוזופילה

למדו טכניקות מיקרו-הזרקה לחקר מיטוזה בעוברים סינסיציאליים של Drosophila melanogaster באמצעות הדמיה ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מאפשרת לחקור דינמיקת חלוקת תאים ותפקוד חלבונים מיטוטיים בביולוגיה התפתחותית.

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

גלה סרטונים נוספים