Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

הליך זה מתחיל באיסוף עוברים על צלחות מיץ ענבים טריים 30 עד 60 דקות. לאחר הוצאת הצלחת מכלוב האגם, הרימו את העוברים בעזרת מברשת לחה והניחו אותם על סרט דביק כפול. מגלגלים בעדינות עובר אחד על הסרט בעזרת חצי פינצטה עד שהקוריון נפתח.

הרם את העובר והניח אותו בעדינות על הכיסוי. מחליקים מעל שכבת דבק האט. חזור על כך עד שיהיו לך מספיק עוברים.

לאחר התייבשות, העוברים מוכנים להזרקה. היי, אני אינגריד ברוס מושר מהמעבדה של ד"ר ג'ונתן סקאלי במחלקה לביולוגיה מולקולרית ותאית באוניברסיטת קליפורניה דייוויס. היום נראה לך הליך להזרקת מיקרו של עוברים סינציאלים של דרוזופילה.

אנו משתמשים בהליך זה כדי לחקור את תפקידם של מיקרו-טס ומנועים מבוססי מיטרלי במיטוזה. לדוגמה, אנו מזריקים מיקרו נוגדנים או מעכבים אחרים של חלבונים מיטוטיים ספציפיים. על ידי ניתוח השפעת המעכב על המיטוזה, אנו מסוגלים לקבוע את תפקוד חלבוני המטרה.

אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בהכנות יומיים-שלושה לפני הניסוי, הקימו את כלוב ההטלה על ידי חיתוך שני חורים קטנים בגודל של כסנטימטר אחד בריבוע משני צדי בקבוק פלסטיק. מלאו את החורים בחתיכת כותנה, ואפשרו לאוויר לזרום.

הקש את הזבובים לבקבוק ולאחר מכן כסה אותו בצלחת מיץ ענבים. עם שמרים, שמור את כלוב הרגליים בטמפרטורת החדר זבובים יטילו ביצים עד 10 ימים לפחות יום אחד לפני הניסוי. משוך מחטים להזרקה ושמור אותן בארבע מעלות צלזיוס.

ביום הניסוי הכינו וטענו את המחטים. ראשית, הוציאו את הטובולין המסומן מהמקפיא והניחו אותו על קרח למשך חמש עד 15 דקות. לאחר מכן, יש לדלל אותו עם מאגר GPEM ולאחר מכן לצנטריפוגה למשך 10 עד 15 דקות ב-13,000 סל"ד ארבע מעלות צלזיוס.

לבסוף, טען 1-2 מיקרוליטר לתוך המחט ושמור אותה על ארבע מעלות צלזיוס. למניעת פילמור המושרה על ידי טמפרטורה במחט. לפני הגדרת פתק הכיסוי, הכינו דבק הפטן על ידי רישום סרט דביק כפול והנחתו בבקבוק של 100 מיליליטר.

מוסיפים כ -50 מיליליטר הפטן, אוטמים את הבקבוק ומנענעים אותו למשך מספר ימים. לפני הכנת העוברים, הכינו תא התייבשות בו יוכנסו העוברים לפני ההזרקה. לשם כך, הכניסו חלק אחד של צלחת 35 מילימטר לתוך צלחת פטרי של 100 מילימטר כדי לגרום לשולחן להוסיף מייבש, נכון, שהוא סידן גופרתי נטול מים סביבו כך שגובה המייבש הימני לא יהיה גבוה מהשולחן והכיסוי.

כדי להתחיל בהכנת העוברים, ראשית, אספו אותם מכלוב האגם על ידי החלפת צלחת מיץ הענבים בשמרים כל שעה, יש לדמות את העוברים כשעתיים לאחר תחילת האיסוף. כדי להכין את פתק הכיסוי, הנח אותו בצד אחד של מיקרוסקופ, החלק והדבק את ארבע הפינות כלפי מטה כדי שלא יזוז. בעזרת אפליקטור עם קצה כותנה, הניחו שכבה אחת של דבק הפטן בקו על החלקת הכיסוי.

הדבק לא צריך להיות צמיג ואמור להתייבש תוך מספר שניות. אם הוא סמיך מדי, הוסף עוד הפטן. לבסוף, הניחו חתיכת סרט דביק כפול על השקופית שליד הכיסוי.

החלק בעזרת מברשת לחה. הרם בזהירות את העוברים מצלחת מיץ הענבים והניח אותם על הסרט הדביק הכפול שעל השקופית. לאחר מכן, השתמש בחצי פינצטה כדי לגלגל את העוברים על הסרט הדביק הכפול עד שהקוריון נפתח.

הרם את העובר על ידי גלגולו בעדינות על הקוריאן כך שיידבק לפינצטה והניח אותו על דבק הפטן שעל המכסה. החליקו כשהצד הארוך של העובר מקביל לצד הארוך של החלקת הכיסוי. הניחו 10 עד 20 עוברים בשורה אחת.

הסר את החלקת הכיסוי והנח אותו בתא ההתייבשות למשך שלוש עד שמונה דקות. הזמן תלוי בלחות המקומית ובכמות שיש להזריק. לאחר מכן, הניחו את החלקת הכיסוי על תא מתכת עם שומן ואקום.

לבסוף, כסו את העוברים בשמן פחמן הילה כדי למנוע התייבשות נוספת. העוברים מוכנים כעת להזרקה. ראשית, מצא את העוברים תחת יעד של פי 16.

הרחיקו את העוברים ומצאו את המחט מבלי להזיז את מישור המוקד. מרכז את המחט והזז אותה למעלה מבלי להזיז אותה לכיוון X או Y. כדי לפתוח את המחט, הכניסו את קצה החלקת הכיסוי לשדה הראייה, אך לא היכן שהמחט תהיה.

ולהוריד את המחט לאותו מישור מוקד. הזז בזהירות רבה את החלקת הכיסוי עד שהיא פוגעת במחט ושוברת אותה בעדינות. הזיזו את המחט למעלה.

עכשיו הביאו את העוברים לעין. מורידים את המחט לתוך השמן, וכדי לוודא שמקבלים טיפות נוזליות יפות מהמחט. העבירו את העובר בהתמדה לתוך המחט, הזריקו טיפה לעובר ואז הרחיקו את העובר.

לאחר שכל העוברים הוזרקו, הם מוכנים לתצפית במיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרה של פי 60 או 100. עובר ביקורת צריך להיראות כמו זה שבסרט הזה. זהו עובר המבטא טובולין GFP והיסטון RFP שצולם עם מטרה של פי 100 במיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב.

הזמן הכולל המוצג הוא שמונה דקות. חלקות של מרחק מקוטב לקוטב ניתנות לשחזור ומהוות מדד אמין להצלחה בעוברי ביקורת. הם אמורים להיראות כמו אלה המוצגים כאן עבור מחזורים 11 עד 13.

בסרט זה מוצג עובר ביקורת נוסף. זה מבטא KLP 61 FGFP והוזרק עם r Domine tubulin. זה גם צולם עם מטרה של פי 100 על דיסק מסתובב, והזמן הכולל הוא שבע דקות.

סרט זה נרכש מיד לאחר מיקרו-הזרקה, והשיפוע בריכוז הטובולין r Domine נראה בבירור בתחילת הסרט. ניתן להשתמש בעוברים אלה כדי לחקור את העיכוב של Klp 61 F לאחר מיקרו-הזרקה של נוגדן Klp 61 F. אנו יכולים לראות את אובדן Klp 61 FGFP מהצירים

זה עתה הראינו לך כיצד להזריק מיקרו עוברים חתכים לדרוזופילס. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבצע בקרות, לתרגל תחילה הזרקת בופר או רוטין בלבד, ולוודא שהמיטוזה מתקדמת כרגיל דרך התא. ברגע שכל הזריקות שלך אמינות ואינן גורמות נזק, אתה יכול להזריק מעכב ולחקור את ההשפעה של העיכוב המסוים הזה.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.