נורמליזציה נולד עבור טומוגרפיה Fluorescence הקרנה אופטית עבור הדמיה בלב שלם
2 ביוני 2009
אנו מציעים גישה מנורמל נולד עבור טומוגרפיה הקרנה אופטי (BnOPT) אשר מהווה את מאפייני הקליטה של דגימות צילמו להשיג מדויק כמותי שחזורים הקרינה טומוגרפית. אנו משתמשים באלגוריתם המוצע לשחזר את התפלגות הקרינה בדיקה מולקולרית בתוך איברי חיה קטנה.
על מנת לבצע טומוגרפיה של היטל אופטי מנורמל (normalized born optical projection tomography), מקבעים תחילה את הדגימה ומטמיעים אותה בתוך גליל של agarose. לאחר מכן מסובבים את הדגימה סביב ציר אנכי ומאירים אותה באופן אחיד באורך גל עירור, ואת התמסירות מודדים באמצעות אופטיקה מתאימה ל-C, CD. האות הפלורסצנטי באורך גל נמדד במצב של תאורה חוצה (transillumination mode).
התמונות הפלואורסצנטיות ותמונות הבליעה שנרכשו משמשות לקביעת יחס ה-born הנורמליזציה ולשחזור התפלגות הפלואורופורים בתוך הדגימה. שלום, שמי קלאודיה נאונו ואני עובדת במרכזים לביולוגיה של מערכות בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס, בית הספר לרפואה של הרווארד. אני דניאל רקי מהמכון לדמיון ביולוגי ורפואי באוניברסיטה הטכנית של מינכן ובמרכז AI מינכן.
אני ז'יזל פידו. אני המנהלת של יחידת הניסויים כאן ב-C-M-I-C-S-B, בית החולים הכללי של מסצ'וסטס, בית הספר לרפואה של הרווארד. היום נדגים לכם פרוצדורה לדימות איבר שלם ex vivo בזמן אמת תוך שימוש בגישת Born normalized עבור טומוגרפיה של הקרנה אופטית.
אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את פיזורן של גששים מולקולריים פלואורסצנטיים באיברים חלולים. אז בואו נתחיל. סרטון זה יסביר את הפרוצדורה לשימוש בטומוגרפיה של הקרנה אופטית (optical projection tomography) לצילום רקמות או איברים שהוכנו, ובסרטון נלווה.
אנו מסבירים כיצד להשתמש במערכת זו לביצוע דימות בשיטת time-lapse של זבוב הדרוזופילה בשלבי התפתחותו. טכניקת הדימוי התלת-ממדי של טומוגרפיה בהקרנה אופטית (optical projection tomography) דורשת שילוב ייחודי של אופטיקה ובמה מסתובבת. בחלק זה של הסרטון, יפורט הליך הדימוי.
בתחילה, מקור האור הראשי משמש הן למדידות הארה והן למדידות בליעה, וכדי לספק עירור פלואורסצנטי עבור מדידות פלואורסצנציה, מקור האור הראשי מסונן תחילה באמצעות מסנן הפרעה בעל פס מעבר צר. לאחר מכן, האור עובר דרך סט של מסנני צפיפות ניטרלית קבועים ומשתנים. אלו משולבים עם תריס אוטומטי כדי לשלוט בכמות האור הפוגעת בדגימה ולשמור עליה ברמה נמוכה מספיק כדי למנוע פוטו-בליץ (photo bleaching).
הארה אחידה של הדגימה מושגת באמצעות מרחיב אלומה (beam expander) ועדשת טלסקופ גלאן משולבת עם עדשת מפזרת. לבסוף, נעשה שימוש במסנני הפרעה (interference filters) בעלי פס תדר צר כדי לנקות אופטית את אור מקור העירור. הדגימה טבולה בתמיסת הבהרה (clearing solution) ומוחזקת במקומה לצורך הדמיה בתוך צינור זכוכית.
הדגימה מסובבת סביב הציר האנכי שלה באמצעות במת סיבוב במהירות גבוהה עם דיוק מוחלט של 0.05 מעלות. שלושה בקרים ידניים נפרדים מאפשרים להטות את הציר האנכי של הדגימה ולכוון אותו במישור האורתוגונלי שלו. אות הבליעה נרכש בתאורה חולפת (trans illumination) ומזוהה באופן ישיר על ידי מצלמת CCD.
האות הפלואורסצנטי מסונן דרך מסנן הפרעה בעל מעבר פס צר, המשולב עם מסנן מעבר ארוך, ולאחר מכן נאסף באמצעות עדשה טלצנטרית. עדשות טלצנטריות מציעות את היתרון של אספקת תכונות ייחודיות ההופכות אותן לאידיאליות עבור טומוגרפיה של הקרנה אופטית.
נוכחותו של מפתח צמצם הממוקם בתוך מכלול העדשה בנקודת המוקד של העדשה היא קריטית. הדבר מבטיח שהתמונה תנוע במקביל לציר האופטי. כך נמנעת עיוות פרספקטיבה ותתקבל הגדלה שווה על פני מישורי מוקד רבים בתוך עומק הטלקצנטריות.
קטע הווידאו הבא מתאר טכניקה להכנת דגימות. לאחר מכן יוצג המתודולוגיה המשמשת לדימות. הכנת רקמת הדגימה או האיבר לדימות טומוגרפי מבוססת על דהידרטציה של הדגימה באמצעות אתנול, המונעת התכווצות אסימטרית.
תהליך זה אורך מספר ימים עד להשלמתו. בסרטון זה מכינים לב של עכבר, אך ניתן להחיל את הפרוטוקול על כל רקמה או איבר. נדגים את שיטת דימוי הפלואורסצנציה שלנו באמצעות לב של בעל חיים שעבר אוטם מבוקר.
במילים אחרות, אובדן אספקת דם המוביל לנמק רקמתי ברור מראש. לעכבר הוזרק pro since six 80, חיישן פלואורסצנטי לא פעיל המדווח על פעילות cathepsin בשריר הלב העובר ריפוי. הרדימו את העכבר לצורך פרפוזיה והוצאת הלב באמצעות הזרקה תוך-פריטונית של ketamine ו-xylazine. לאחר מכן, הזיקו 50 units של heparin באופן תוך-פריטוני כדי למנוע קרישה.
חמש דקות מאוחר יותר, בצעו לפרוטומיה אורכית בבעל החיים המורדם באופן מלא כדי להוציא את הדם. ראשית, פתחו את הווריד הרנלי השמאלי. כעת, הזריקו באיטיות 20 milliliters של תמיסת סלין אל הווריד הנבוב התחתון.
הסליין מחליף את הדם לאחר שטיפה של כל הדם תחת מיקרוסקופ דיסקציה. המשך בשימוש בשיטות עבודה סטנדרטיות כדי לפתוח את בית החזה ולהוציא את הלב. כעת, קבע את הלב למשך שמונה שעות ב-4% PFA בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.
מהשלב הזה ואילך, יש לבצע את שלבי הכנת הרקמה בחושך כדי למנוע הלבנה של חומרי ניגוד פלואורסצנטיים או חלבונים שהוחלו על הרקמה. עם השלמת הקיבוע, יש לשטוף את ה-PFA בשטיפה של 15 דקות ב-PBS, ולאחר מכן להטמיע את הלב הנקי בתוך מאגר של 0.8% agarose. לאחר ייבוש ה-agarose, יש לחתוך את ה-agarose מסביב לרקמה כדי ליצור צורה של בלוק.
בשלב הבא, ייבשו את הלב המוצפן ב-aros באמצעות סדרה של חמישה שלבים, המתחילה בהשריה ב-20%Ethanol, לאחר מכן בריכוזי אתנול גבוהים יותר באופן הדרגתי, ולבסוף באתנול טהור. הליך ייבוש זה מסייע במניעת התכווצות אסימטרית של הדגימה. את ארבעת האמבתים הראשונים באתנול מדולל יש לבצע במשך שעה, ואת האמבט האחרון ב-100%Ethanol יש לבצע למשך 10 שעות לפחות.
לאחר השלמת טיפולי האתנול, השב את הדגימה לתוך תמיסתו השקופה של Murray עד שהדגימה תהפוך לשקופה, תהליך שמשכו משתנה בין מספר שעות למספר ימים. תמיסת הבהירה זו מחקה את המים התאיים ומתאימה את מקדם השבירה של קרומי התאים, ובכך הופכת את הרקמה לשקופה. עקבות מינימליים של אתנול עשויים להישאר בסוף תהליך הבהירה, דבר שעלול לגרום למספר ארטיפקטים בשחזורים עקב תנועה תרמית של האלכוהול בתוך תמיסת הבהירה עצמה.
כדי למנוע בעיה זו, מומלץ לבצע מחזור הבהרה שני. תהליך זה לא אמור להימשך יותר מארבע שעות. עם השלמתו, הדגימה מוכנה להקרנה אופטית.
טומוגרפיה בעזרת מחשב. ניתן להשיג שחזור של בליעה אופטית בהיעדר פיזור אור באמצעות אלגוריתם נפוץ של השלכה לאחור של רדון מסונן (filtered radon back projection). תהליך זה מקביל לטומוגרפיה ממוחשבת של קרני X דו-ממדית.
הניחו את גוש הארוסול (aeros) לתוך תא הדמיון השקוף המלא בתמיסת ההבהרה (clearing solution). כעת התקינו את התא על השולחן, והאירו את הדגימה באמצעות קרן מקולטת (collated beam) לצורך מדידות עירור (excitation) ומדידות תמסורת (transmission). בחירת מקור העירור תלויה בחלבון הפלואורסצנטי או בחומר הניגוד להדמיה מולקולרית שנבחרה.
מומלץ ליישר את הציר האנכי של הדגימה במקביל לעמודת הפיקסלים של ה-CCD. סובבו את הדגימה לאורך 360 היטלים בגידולים זוויתיים של מעלה אחת, ורכשו תמונות בכל זווית בתאורה חודרת (trans illumination) הן באורכי הגל של הספיגה והן באורכי הגל של הפלואורסצנציה. התוכנה המפעילה את הרכישה שולטת באופן אוטומטי בתריס של מקור האור הראשי כדי למנוע חשיפה רציפה ולהפחית פוטו-הבהרה (photo bleaching) של הדגימה.
התריס חשוב במיוחד כאשר נדרשים זמני אינטגרציה ארוכים כדי ליצור שחזור תלת-ממדי מנתוני הבליעה. עבור שחזור תלת-ממדי מתמונות הפלואורסצנציה, השתמש פשוט באלגוריתם Radon back projection מסונן. יש להביא בחשבון תרומות בליעה אחרות, המתוארות במקטע הווידאו הבא.
לאחר השלמת השלבים הנדרשים לשחזור בבליעה, נותרו מספר שלבים נוספים להשלמת שחזור פלואורסצנטי. ניתן להשיג שחזור של מפה אופטית בהיעדר פיזור אור באמצעות אלגוריתם נפוץ של השחזת רדון מסוננת (filtered radon back projection). תהליך זה מקביל לטומוגרפיה ממוחשבת של קרני רנטגן דו-ממדית.
בעת שחזור התפלגות הפלואורסצנציה, הבליעה המשתנה התלויה במרחב הופכת את השימוש בטרנספורמציית רדון הפוכה (inverse radon) להטלה לאחור של תמונות הפלואורסצנציה לשגוי, דבר המשפיע קשות על ההתפלגויות המתקבלות של חלבון פלואורסצנטי או גשושית מולקולרית פלואורסצנטית ועל יכולת הכימות שלהן. כל קרן באורך גל עירור Lambda X הנפלטת ממיקום מקור שרירותי Xs, נחלשת באופן מעריכי בע//ידה דרך האובייקט המצולם.
לאחר עירור הפלואורונומ שנמצא במיקום X, הקרינה באורך גל הפליטה מסוננת ונאספת על ידי פיקסל ה-CCD שנמצא במיקום XD באמצעות מערכת עדשות הדמיה טלקנטרית. למרות שהפליטה הפלואורסצנטית אינה עוקבת אחרי אותו נתיב של קרן העירור, העוצמה שנרשמה בכל פיקסל מקריבה השלכה של כל הפלואורונומים שעוררו לאורך כל אזור המיקוד המתאים לקרן עירור ספציפית זו. בשל הטלקנטריות הגבוהה של המערכת, האובייקט המדוגם מסובב ב-360 מעלות ומדידות רב-מקור-גלאה, UX באורך גל העירור ו-UFL באורך גל הפליטה, נרכשות באמצעות מצלמת ה-CCD.
אלו משולבים לאחר מכן תחת שדה ה-born הנורמליזציה UB המוגדר כיחס בין השניים. ניתן להקל על שחזור התפלגות הפלואורו-כרום על ידי כתיבת המודל הישיר עבור התפשטות אור העירור והפליטה, כאשר פונקציית גרין מתארת את העירור. התפשטות הקרניים עוקבת אחר חוק ביר-למברט פשוט, שבו moo A היא התפלגות הבליעה האופטית שנקבעה קודם לכן.
ניתן לכתוב את עוצמת האור UX הנפלטת מהמקור במיקום excess ונמדדת על ידי הגלאי במיקום XD ב-C.C, D כמכפלה של פונקציית גרין עם קבוע B התלוי במערכת. לאחר מכן ניתן לחשב את ההתפלגות המדויקת של עוצמת אור העירור GX לאורך כל נתיב קרן. עוצמת הפלואורסצנציה UFL המזוהה בגלאי XD, אשר מגורה על ידי האור הנפלט מהמקור Xs, לוקחת בחשבון את התרומה של כל ה-theros שעוררו לאורך נתיב הקרן מ-X ל-xd.
ניתן לכתוב את המודל הקדמי של בעיית הדימות שלנו כ-ub ub, כאשר alpha כולל את הקבועים הבלתי ידועים התלויים במערכת. לאחר מכן המודל הקדמי עובר דיסקרטיזציה על הרשת ההנחיתה ומבוצעת אינוורסיה כדי לחלץ את התפלגות הפלואורוכרום, לרכוש הן את אות התמסירה והן את האות הפלואורסצנטי, ולהשתמש באלגוריתם back projection קונבנציונלי כדי לשחזר את הדגימה. כאן מוצגות שחזורים של טומוגרפיה אופטית בהסבקה של תמסירה ושל פלואורסצנציה קונבנציונלית.
שחזור של מישור בודד של הלב מוצג הן בבליעה והן בפלואורסצנציה. שחזור born מנורמל מוצג, והוא מראה את ההבדל בפיזור הצבע בתוך הלב. לאחר הנורמליזציה, הצגנו בפניכם כיצד להקים את מערך ה-optical projection tomography וכיצד להסיר ארטיפקטים הנובעים מבליעה אופטית בשחזורים עבור פלואורסצנציה טומוגרפית.
למעשה, חשוב מאוד לזכור לבצע שקיפות של הדגימה כדי להסיר את התרומה של אור מפוזר, אך בו בזמן, חשוב לאזן את תהליך השקיפות כדי לשמר ככל הניתן את תרומת הפלואורסצנציה. דבר נוסף שחשוב מאוד לזכור בעת שימוש בגישה זו הוא לחשב את היחס הנורמליזציה לעצם, המתקבל על ידי חלוקת תמונות הפלואורסצנציה בתמונות הבליעה. וזהו זה.
תודה שהצטרפתם לניסוי הוויזואלי שלנו ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג גישה מנורמלת לפי בורן עבור טומוגרפיה של השלכה אופטית (BnOPT), המשפרת את דיוק השחזורים הטומוגרפיים של פלואורסצנציה על ידי התחשבות בתכונות הבליעה של הדגימות. השיטה יושמה לשחזור התפלגותם של גשמי פלואורסצנציה מולקולריים באיברים של בעלי חיים קטנים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- דימות אופטי
- טומוגרפיה פלואורסצנטית
- דימות ביו-רפואי
רקע
- טומוגרפיה של הקרנה אופטית (Optical Projection Tomography) היא טכניקה המשמשת להדמיה של דגימות ביולוגיות.
- שיטות מסורתיות עשויות שלא להתחשב בתכונות בליעה, דבר המוביל לאי-דיוקים.
- גששים מולקולריים פלואורסצנטיים חיוניים להדמיה של תהליכים ביולוגיים.
- שיפור שיטות השחזור יכול להעמיק את ההבנה של תפקודי איברים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה השוכבת באופן מדויק התפלויות פלואורסצנציה.
- התחשבות במאפייני הבליעה של דגימות ביולוגיות.
- שיפור המהימנות של דימות איברים בבעלי חיים קטנים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הדגימות מקובעות ומוטמעות בתוך גליל של auger.
- הדגימות מסובבות ומומרות באמצעות אורך גל של עירור.
- אותות פלואורסצנציה נמדדים במצב של תאורה נגד אור (transillumination).
- יחס born מנורמל מחושב כדי לסייע בשחזור.
תוצאות עיקריות
- שיטת ה-BnOPT המוצעת מספקת שחזורי פלואורסצנציה מדויקים.
- היא לוקחת בחשבון ביעילות את תכונות הבליעה של הדגימות.
- השיטה ממחישה בהצלחה את התפלגות הגששים באיברים של בעלי חיים קטנים.
- התוצאות מדגימות איכות דימוי משופרת בהשוואה לשיטות מסורתיות.
מסקנות
- גישת ה-BnOPT משפרת את הדיוק של טומוגרפיה פלואורסצנטית.
- היא מציעה שיטה מהימנה לחקר דגימות ביולוגיות in vivo.
- טכניקה זו עשויה לקדם את המחקר בדימות ביו-רפואי ובניתוח תפקודי איברים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות פלואורסצנציה מדויק בדימות של איברים שלמים הוא קריטי לתיקוף של מטרות ולצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות. שיטת ה-Born normalized Optical Projection Tomography (BnOPT) פותרת ארטיפקטים הנגרמים עקב בליעה הפוגעים בפירוש של אות הפלואורסצנציה, ובכך משפרת את הביטחון החזוי בניתוח התפלגות הגששים. יכולת זו תומכת בהערכה מהימנה של מעורבות מטרות טיפוליות ומודולציה של מסלולים במערכות הרלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של השערות טיפוליות באמצעות אספקת התפלגויות פלואורסצנציה נטולות ארטיפקטים של גששים מולקולריים באיברים שלמים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות דימות כמותי של פעילות הגשש בהקשרים פתופיזיולוגיים, כגון מודלים של אוטם.
- ערך ניבוי: מגביר את הביטחון בקריאות של מודולציית מטרה על ידי תיקון בגיליות בליעה המשתנות מרחבית, אשר אחרת מעוותות את הכימות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: הכנת דגימות ביולוגיות שקופות ויציבות המתאימות למחקרי דימוי ארוכי טווח הדורשים קריאות פלואורסצנציה הניתנות לשחזור.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הכנת הדגימות באמצעות התייבשות באתנול והשקיפות של Murray, הממזערת התכווצות אסימטרית ושונות באות.
- מוכנות הבדיקה: יצירת מערכי נתונים כמותיים של בליעה ופלואורסצנציה המאפשרים חישובי יחס מנורמלים, החיוניים לפירוש מהימן של האות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקלה על המעבר משלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על שלמות אות הפלואורסצנציה במהלך סבבי הבהרה והדימיון ממושכים.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מפחיתה מסקנות שגויות לגבי התפלגות הגששים על ידי התחשבות באפקטים של בליעה המדמים או מסוואים אותות ביולוגיים אמיתיים.
- נאמנות למודל המחלה: יושם על לבבות עכברים לאחר אוואמיה כדי להמחיש גששים לפעילות פרוטאז, ובכך תומך בהערכת מנגנונים ספציפיים למטרה בפתופיזיולוגיה רלוונטית.
שילוב של תהליכי עבודה וקווי עיבוד
שיטת ה-BnOPT משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים לאחר סריקת מעורבות מטרה (target engagement screening), ומספקת מפות פלואורסצנציה תלת-ממדיות כמותיות המשמשות לאופטימיזציה של תרכיבים מובילים (lead optimization) ולבחירת מועמדים לשלב הפרה-קליני.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי מתן אפשרות למעקב אורך של התפלגות גששים פלואורסצנטיים באיברים שלמים ללא ירידה בעוצמת האות כתוצאה מארטיפקטים של בליעה.
- סריקה: מספקת דגימות רקמה שקופות המוכנות לבדיקה, עם פרוטוקולי הכנה סטנדרטיים המבטיחים הדירות בין סדרות ניסוייות.
- אנליזה: מפיקה יחסי born מנורמלים (פלואורסצנציה/בליעה) המבודדים אותות פלואורסצנציה אמיתיים מגורמי בליעה מבלבלים, מה שמאפשר השוואות מדויקות בין קבוצות.
- מחקר תרגומי: מקשר למחקרים פרה-קליניים על ידי שימור אות הפלואורסצנציה בדגימות שקופות לאורך זמן, מה שמאפשר קורלציה בין פעילות הגשש לתוצאות תפקודיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת דימוי רב-פעמית לכימות פלואורסצנציה של איברים שלמים, הישמה על תחומי טיפול ומחלקות מטרה מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את הוודאות החזויה בתיקוף מטרות על ידי ביטול שגיאות כימות המתווכות על ידי בליעה בטומוגרפיה פלואורסצנטית.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של שקיפות (תמיסת Murray) והתייבשות המצמצמים את השונות בין הדגימות.
- ערך אסטרטגי: מגביר את אמינות קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי אספקת קריאות מרחביות מדויקות של פעילות גששים מולקולריים באיברים רלוונטיים למחלה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מטרות מותאם סיכון על ידי הפחתת מסקנות של חיוביים או שליליים שגויים הנובעים מנתוני דימות לא מתוקננים.
שיקולים ליישום
- נדרשת מומחיות בדימות אופטי, הבהרה של דגימות (sample clearing) וכבירות פלואורסצנציה כדי למנוע ארטיפקטים הנובעים מאתנול שיורי או מהבהרה חלקית.
- התהליך תלוי במערכות אופטיות טלצנטריות, במבמי סיבוב עם דיוק של 0.05° ובסינון עירור/פליטה מסונכרן לשמירה על נאמנות האות.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של משך ההבהרה ומדרגי האתנול כדי להבטיח התאמה עקבית של מקדם השבירה ושימור הפלואורסצנציה.
- התאמה לגדלים ודחיסויות שונות של איברים עשויה לדרוש התאמות בזמן ההבהרה ובעוצמת ההארה כדי למנוע אובדן אות או הבהרה (bleaching).
- מגבלה מעשית: הבהרה ממושכת מעבר למשך הזמן האופטימלי עלולה לסכן את הפלואורסצנציה ולגרום להידרדרותה, מה שמחייב מחזורי הבהרה מתוזמנים כפי שמתואר בפרוטוקול.
