נורמליזציה נולד עבור טומוגרפיה Fluorescence הקרנה אופטית עבור הדמיה בלב שלם
June 2nd, 2009
אנו מציעים גישה מנורמל נולד עבור טומוגרפיה הקרנה אופטי (BnOPT) אשר מהווה את מאפייני הקליטה של דגימות צילמו להשיג מדויק כמותי שחזורים הקרינה טומוגרפית. אנו משתמשים באלגוריתם המוצע לשחזר את התפלגות הקרינה בדיקה מולקולרית בתוך איברי חיה קטנה.
על מנת לבצע טומוגרפיה של הקרנה אופטית מנורמלת, הדגימה מקובעת תחילה ומוטמעת בצילינדר של מקדחה. לאחר מכן הדגימה מסובבת לאורך ציר אנכי ולאחר מכן מוארת באופן אחיד באורך גל עירור, והשידור נמדד עם אופטיקה מתאימה C, CD. האות הפלואורסצנטי באורך הגל נמדד במצב טרנס-הארה.
תמונות הפלואורסצנט והספיגה הנרכשות משמשות לקביעת יחס הלידה המנורמל ולשחזור התפלגות ארבע הפלואורו בתוך הדגימה. היי, שמי קלאודיה נאון ואני עובדת במרכזים לביולוגיה מערכתית בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס, בית הספר לרפואה של הרווארד. אני דניאל ראקי מהמכון להדמיה ביולוגית ורפואית באוניברסיטה הטכנית של מינכן ומרכז אל במינכן.
אני ג'יזל פידו. אני המנהל של Experimental su Co כאן ב-C-M-I-C-S-B, בית החולים הכללי של מסצ'וסטס, בית הספר לרפואה של הרווארד. היום נראה לך הליך להדמיית איבר שלם בזמן אמת ex vivo באמצעות גישת Born מנורמלת לטומוגרפיה של הקרנה אופטית.
אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור התפלגות בדיקה מולקולרית פלואורסצנטית באיברים חלולים. אז בואו נתחיל. סרטון זה יסביר את הנוהל לשימוש בטומוגרפיה של הקרנה אופטית להדמיית רקמות או איברים מוכנים וסרטון נלווה.
אנו מסבירים כיצד להשתמש במערכת זו לביצוע הדמיית זמן-lapse על התפתחות דרוזופילה. טכניקת ההדמיה התלת מימדית של טומוגרפיה הקרנה אופטית דורשת שילוב ייחודי של אופטיקה ושלב מסתובב. בקטע זה של הסרטון יובהר הליך ההדמיה.
ראשית, מקור האור העיקרי משמש כמקור הן למדידות תאורה והן לספיגה, וכדי לספק עירור פלואורסצנטי למדידות פלואורסצנטיות, מקור האור העיקרי מסונן תחילה עם מסנן הפרעות מעבר פס צר. לאחר מכן, האור עובר דרך קבוצה של מסנני צפיפות ניטרלית קבועים ומשתנים. אלה משולבים עם נוכחות של תריס אוטומטי כדי לשלוט בכמות האור על הדגימה ולשמור עליה נמוכה מספיק כדי למנוע הלבנת תמונות.
תאורת דגימה אחידה מושגת על ידי שימוש במרחיב אלומה ועדשת טלסקופ גלאן משולבת עם עדשת מפזר. לבסוף, מסנני הפרעות מעבר פס צר אופטי משמשים לניקוי אופטי של אור מקור העירור. הדגימה טובלת בתמיסת ניקוי ומוחזקת במקומה להדמיה בתוך צינור זכוכית.
הדגימה מסובבת לאורך הציר האנכי שלה באמצעות שלב סיבוב במהירות גבוהה עם דיוק מוחלט של 0.05 מעלות. שלושה בקרים ידניים נפרדים מאפשרים להטות ולכוונן את הציר האנכי של הדגימה במישור האורתוגונלי שלו. האות הסופג נרכש בתאורת טרנס ומזוהה ישירות על ידי מצלמת CCD.
האות הפלואורסצנטי מסונן דרך מסנן הפרעות מעבר פס צר, יחד עם מסנן מעבר ארוך ולאחר מכן נאסף עם עדשה טל-צנטרית. עדשות טל מציעות את היתרון של מתן תכונות ייחודיות שהופכות אותן לאידיאליות. לטומוגרפיה של הקרנה אופטית.
הנוכחות של עצירת צמצם הממוקמת בתוך מכלול העדשה בנקודת המוקד של העדשה היא המפתח. זה מבטיח שהתמונה תנוע במקביל לציר האופטי. זה מבטל עיוות פרספקטיבה ומספק הגדלה שווה על פני מישורי מוקד רבים בעומק הטלצנטרי.
קטע הווידאו הבא מתאר טכניקה להכנת דוגמאות. לאחר מכן תבוא מתודולוגיה המשמשת להדמיה. הכנת רקמת הדגימה או האיבר להדמיה טומוגרפית מסתמכת על התייבשות מבוססת אתנול של הדגימה המונעת הצטמקות אסימטרית.
תהליך זה אורך ימים רבים. בסרטון זה מכינים לב עכבר, אך ניתן ליישם את הפרוטוקול על כל רקמה או איבר. נדגים את שיטת ההדמיה הקרינה שלנו באמצעות לב של בעל חיים שסבל מאוטם מבוקר.
במילים אחרות, אובדן אספקת דם המוביל לנמק רקמות ברור מראש. לעכבר הוזרק פרו מאז שישה חיישנים פלואורסצנטיים 80 חסרי פעולה המדווחים על פעילות קטפסין בריפוי. שריר הלב מרדים את העכבר לצורך זלוף ושחול לב באמצעות הזרקה תוך-צפקית של קטמין וקסילזין לאחר מכן יש להזריק 50 יחידות של הפרין תוך-צפקי כדי למנוע קרישה.
חמש דקות לאחר מכן, בצע את הלפרוטומיה האורכית על החיה המורדמת לחלוטין כדי להסיר את הדם. ראשית, פתח את וריד הכליה השמאלי. כעת הזרקו לאט 20 מיליליטר תמיסת מלח לווריד הנבוב התחתון.
מי המלח עוקרים את הדם לאחר ששוטפים את כל הדם במיקרוסקופ מנתח. המשך להשתמש בשיטות הפעלה סטנדרטיות כדי לפתוח את בית החזה ולהוציא את הלב. כעת, תקן את הלב למשך שמונה שעות ב-4% PFA בארבע מעלות צלזיוס.
מנקודה זו ואילך, יש לבצע את שלבי הכנת הרקמה בחושך כדי למנוע הלבנה של חומרי ניגוד פלואורסצנטיים או חלבונים המופעלים על הרקמה. לאחר השלמת הקיבוע, שטפו את ה-PFA בשטיפה של 15 דקות ב-PBS, הלב הנקי מוטבע בבריכה של 0.8% ארוס. לאחר שהארוס מתייבש, האגרוז נחתך סביב הרקמה ליצירת צורת בלוק.
לאחר מכן, ייבשו את הלב המוצפן באמצעות סדרה של חמישה שלבים של השרייה ראשונה של 20% אתנול, לאחר מכן ריכוזים גבוהים יותר של אתנול, ולבסוף, אתנול טהור. הליך ייבוש זה מסייע במניעת כל הצטמקות אסימטרית של הדגימה. יש לבצע את ארבע האמבטיות הראשונות באתנול מדולל למשך שעה ואת האמבטיה האחרונה באתנול 100% יש לבצע במשך 10 שעות לפחות.
לאחר השלמת טיפולי האתנול, הכניסו את הדגימה לתמיסה השקופה של מוריי עד שהדגימה מתנקה, המשתנה בין מספר שעות למספר ימים. תמיסת ניקוי זו מחקה את המים התאיים והאינדקס מתאים את קרומי התאים, ובכך הופך את הרקמה לשקופה. אתנול בעקבות מינימלי יכול להיות נוכח בסוף תהליך הפינוי, מה שמוליד מספר חפצים בשחזורים עקב תנועה תרמית של האלכוהול בתוך תמיסת הפינוי עצמה.
על מנת להימנע מבעיה זו, מומלץ מחזור ניקוי שני. זה לא אמור לקחת יותר מארבע שעות. לאחר השלמתו, הדגימה מוכנה להקרנה אופטית.
טומוגרפיה בעזרת מחשב. ניתן להשיג שחזור של ספיגה אופטית בהיעדר פיזור אור באמצעות אלגוריתם הקרנה אחורית של ראדון מסונן. תהליך זה מקביל לטומוגרפיה ממוחשבת דו-ממדית של קרני רנטגן.
הנח את בלוק האירוס בתא ההדמיה השקוף המלא בתמיסת הניקוי. כעת הרכיב את החדר על הבמה, האר את הדגימה עם קרן מורכבת הן למדידות עירור והן למדידות שידור. בחירת מקור העירור מבוססת על החלבון הפלואורסצנטי הנבחר או חומר הניגוד להדמיה מולקולרית.
נוח ליישר את הציר האנכי של המדגם במקביל לעמודת הפיקסלים של ה-CCD. סובב את הדגימה על פני 360 הקרנות באמצעות מרווחים זוויתיים של מעלה אחת, רכוש תמונות בכל זווית בתאורת טרנס באורכי גל הבליעה והפלואורסצנטיות. התוכנה המפעילה את הרכישה שולטת באופן אוטומטי בתריס במקור האור הראשי כדי למנוע תאורה רציפה ולהפחית את הלבנת התמונות לדוגמה.
התריס חשוב במיוחד כאשר נדרשים זמני אינטגרציה ארוכים ליצירת שחזור תלת מימד מנתוני הספיגה. כל שעליך לעשות הוא להשתמש באלגוריתם הקרנה אחורית של ראדון מסונן לשחזור תלת מימד מתמונות הפלורסנט. יש לקחת בחשבון תרומות קליטה אחרות, המתוארות בקטע הסרטון הבא.
לאחר השלמת השלבים הנדרשים לשחזור ספיגה, ישנם עוד כמה שלבים להשלמת שחזור פלואורסצנטי. ניתן להשיג שחזור של מפה אופטית בהיעדר פיזור אור באמצעות אלגוריתם הקרנה אחורי של ראדון מסונן. התהליך מקביל לטומוגרפיה ממוחשבת דו-ממדית של קרני רנטגן.
בעת שחזור התפלגות הקרינה. הספיגה המשתנה התלויה במרחב הופכת את השימוש בראדון ההפוך לגב לא נכון, ומקרין את תמונות הקרינה המשפיעות קשות על התפלגות החלבון הפלואורסצנטי או המולקולרית הפלואורסצנטית המתקבלת ועל יכולת הכימות שלו. כל קרן באורך גל העירור Lambda X הנפלטת ממיקום מקור שרירותי Xs, מוחלשת באופן אקספוננציאלי כאשר היא עוברת דרך האובייקט המצולם.
לאחר התרגשות, הפלואורוכרום הממוקם במיקום X, הקרינה באורך גל הפליטה מסוננת ונאספת על ידי פיקסל CCDs הממוקם במיקום XD באמצעות מערכת עדשות ההדמיה Teleric. למרות שהפלואורסצנציה הנפלטת אינה עוקבת אחר אותו נתיב כמו קרן העירור, העוצמה שנרשמה בכל פיקסל מתקרבת להקרנה של כל הפלואורוכרומים הנרגשים לאורך כל אזור המוקד המתאים לקרן העירור הספציפית הזו. בשל הצנטריות הגבוהה של המערכת, האובייקט המצולם מסובב לאחר מכן 360 מעלות ומדידות גלאי מקורות מרובים, UX באורך גל העירור ו-UFL באורך גל הפליטה נרכשות עם מצלמת ה-CCD.
אלה משולבים לאחר מכן תחת השדה הנולד המנורמל UB המוגדר כיחס בין השניים. ניתן להקל על שחזור התפלגות הכרום הפלואורו על ידי כתיבת המודל קדימה הן להתפשטות אור עירור והן להתפשטות אור פליטה, פונקציית הירוקים המתארת את העירור. התפשטות קרניים עוקבת אחר חוק למברט בירה פשוט שבו moo A היא התפלגות הספיגה האופטית שנקבעה בעבר.
ניתן לכתוב את עוצמת האור UX הנפלטת מהמקור במיקום עודף ונמדדת על ידי הגלאי במיקום XD ב-C.C, D כמכפלה של הפונקציה הירוקה עם קבוע B התלוי במערכת. לאחר מכן ניתן לחשב את ההתפלגות המדויקת של עוצמת אור העירור GX לאורך כל נתיב קרן. עוצמת הקרינה שזוהתה בגלאי XD המגורה על ידי האור הנפלט מהמקור Xs לוקחת בחשבון את התרומה של כל התרוסים שהתרגשו לאורך נתיב הקרן מ-X ל-xd.
לאחר מכן ניתן לכתוב את המודל הקדמי של בעיית ההדמיה שלנו כ-ub ub, כאשר אלפא משלב את הקבועים הלא ידועים התלויים במערכת. לאחר מכן, המודל הקדמי מובחן על הרשת המשוערת ומבוצע היפוך כדי לחלץ את התפלגות הפלואורוכרום, לרכוש גם את השידור וגם את האות הפלואורסצנטי ולהשתמש באלגוריתם ההקרנה האחורית הקונבנציונאלי כדי לשחזר את הדגימה. כאן, מוצגים שחזורי טומוגרפיה של הקרנה אופטית פלואורסצנטית קונבנציונלית.
שחזור של מישור יחיד של הלב מוצג הן בספיגה והן בקרינה. שחזור הלידה המנורמל מוצג והוא מראה את ההבדל בפיזור הצבע בתוך הלב. לאחר הנורמליזציה, זה עתה הראינו לך כיצד להיות ההגדרה לטומוגרפיה של הקרנה אופטית וכיצד להסיר חפצים עקב ספיגה אופטית בשחזורים עבור טומוגרפיה פלואורסצנטית.
למעשה חשוב מאוד לזכור לנקות את הדגימה על מנת להסיר את תרומת האור המפוזר, אך יחד עם זאת, חשוב גם לאזן את תהליך הפינוי על מנת לשמור ככל האפשר על תרומת הקרינה. דבר נוסף שחשוב מאוד לזכור בעת שימוש בגישה זו הוא לחשב את היחס המנורמל של העצם המתקבל על ידי חלוקת תמונות הקרינה בתמונות הספיגה. אז זהו.
תודה שהצטרפתם לניסוי הוויזואלי שלנו ובהצלחה בניסויים שלכם.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מחקר זה מציג גישה מנורמלת של בורן עבור טומוגרפיית הקרנה אופטית (BnOPT) שמשפרת את הדיוק של הבניה טומוגרפית של פלואורסצנציה על ידי התחשבות במאפייני הספיגה של הדגימות. השיטה מיושמת כדי לשחזר את התפלגות הגששים המולקולריים הפלואורסצנטיים באיברים של חיות קטנות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- הדמיה אופטית
- טומוגרפיית פלואורסצנציה
- הדמיה ביו-רפואית
רקע
- טומוגרפיית הקרנה אופטית היא טכניקה המשמשת להדמיה של דגימות ביולוגיות.
- שיטות מסורתיות עשויות שלא להתחשב במאפייני הספיגה, מה שמוביל לאי דיוקים.
- גששים מולקולריים פלואורסצנטיים חיוניים לדמיה של תהליכים ביולוגיים.
- שיפור שיטות הבניה יכול לשפר את ההבנה של תפקודי האיברים.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה שמשחזרת במדויק את התפלגות הפלואורסצנציה.
- להתחשב במאפייני הספיגה של דגימות ביולוגיות.
- לשפר את האמינות של הדמיה של איברים בחיות קטנות.
שיטות ששימשו
- הדגימות קבועות ומוטבעות בגליל של אוגר.
- הדגימות מופנות ומוארות באורך גל עירור.
- אותות פלואורסצנטיים נמדדים במצב תאורה חוצה.
- היחס הנורמלי של בורן מחושב כדי לסייע בבנייה מחדש.
תוצאות עיקריות
- השיטה המוצעת של BnOPT מספקת בנייה מחדש מדויקת של פלואורסצנציה.
- היא מתחשבת ביעילות במאפייני הספיגה של הדגימות.
- השיטה מצליחה להדמיה את תפלגות הגששים באיברים של חיות קטנות.
- התוצאות מראות איכות הדמיה משופרת בהשוואה לשיטות מסורתיות.
מסקנות
- גישת ה-BnOPT משפרת את הדיוק של הטומוגרפיה הפלואורסצנטית.
- היא מציעה שיטה אמינה לחקר דגימות ביולוגיות in vivo.
- טכניקה זו יכולה לקדם מחקר בהדמיה ביו-רפואית וניתוח תפקודי איברים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Accurate fluorescence quantification in whole-organ imaging is critical for target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. The Born normalized Optical Projection Tomography (BnOPT) method addresses absorption-induced artifacts that compromise fluorescence signal interpretation, thereby improving predictive confidence in probe distribution analysis. This capability supports reliable assessment of therapeutic target engagement and pathway modulation in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing artifact-free fluorescence distributions of molecular probes in intact organs.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative imaging of probe activity in pathophysiological contexts such as infarction models.
- Predictive Value: Enhances confidence in target modulation readouts by correcting for spatially varying absorption that otherwise distorts quantification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares cleared, stable biological samples suitable for longitudinal imaging studies requiring reproducible fluorescence readouts.
- Operational Value: Standardizes sample preparation via ethanol dehydration and Murray’s clearing, minimizing asymmetric shrinkage and signal variability.
- Assay Readiness: Generates quantitative absorption and fluorescence datasets enabling normalized ratio calculations essential for reliable signal interpretation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates progression from discovery to preclinical validation by maintaining fluorescence signal integrity during extended clearing and imaging sessions.
- Mechanistic De-risking: Reduces false conclusions about probe distribution by accounting for absorption effects that mimic or mask true biological signals.
- Disease Model Fidelity: Applied to infarcted mouse hearts to visualize protease activity probes, supporting target-specific mechanism evaluation in relevant pathophysiology.
Pipeline & Workflow Integration
The BnOPT method integrates into early discovery workflows following target engagement screening, providing quantitative 3D fluorescence maps that inform lead optimization and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling longitudinal tracking of fluorescent probe distribution in intact organs without signal degradation from absorption artifacts.
- Screening: Delivers assay-ready, cleared tissue samples with standardized preparation protocols ensuring reproducibility across experimental batches.
- Analytics: Outputs normalized born ratios (fluorescence/absorption) that isolate true fluorescence signals from absorption confounders, enabling accurate inter-group comparisons.
- Translational Research: Connects to preclinical studies by preserving fluorescence signal in cleared samples over time, allowing correlation of probe activity with functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for whole-organ fluorescence quantification applicable across multiple therapeutic areas and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in target validation by eliminating absorption-mediated quantification errors in fluorescence tomography.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized clearing (Murray’s solution) and dehydration protocols that minimize sample variability.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision reliability by providing accurate spatial readouts of molecular probe activity in disease-relevant organs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target prioritization by reducing false-positive or false-negative conclusions from uncorrected imaging data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical imaging, sample clearing, and fluorescence quantification to avoid artifacts from residual ethanol or incomplete clearing.
- Dependent on telecentric optical systems, rotation stages with 0.05° accuracy, and synchronized excitation/emission filtering for signal fidelity.
- Necessitates cross-team standardization of clearing duration and ethanol gradients to ensure consistent refractive index matching and fluorescence preservation.
- Adaptation to diverse organ sizes and densities may require adjustments in clearing time and illumination intensity to prevent signal loss or bleaching.
- Practical limitation: prolonged clearing beyond optimal duration risks fluorescence degradation, necessitating timed clearing cycles as described in the protocol.
