Name: תא Multi-CNS-Neuron גליה שותף תרבות Microfluidic רציף (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-10T16:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: למד שיטת תרבית שיתוף נוירון-גליה במערכת מיקרו-זורמית רב-תאית לחקר אינטראקציות אקסון-גליה במערכת העצבים המרכזית. השיטה מאפשרת ביצוע ניסויים מקבילים ושליטה מדויקת בסביבה התאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים / המכון הלאומי לבריאות הנפש (NIH / NIMH) מענק # 1R21MH085267.

חלק 1: הכנת תבנית אב תא רב נוירון שיתוף התרבות ייצור המכשיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעד ראשון לפברק האב PMMA הוא להפוך תאים 3.5 מ&quot;מ עמוק. אחת תא סומה ושישה האקסון / גליה תאים מוגדרים על בלוק PMMA באמצעות כרסום מיקרו מכונה (MDX-40, רולנד או כל מכונת כרסום CNC אחרים). PMMA המאסטר sonicated אז במשך 10 דקות כדי להסיר שאריות של אלכוהול איזופרופילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכים של מבנים 2.5 מיקרומטר רכס גבוה הם בדוגמת על 50.8 מ&quot;מ x 50.8 מ&quot;מ זכוכית שקופית בתהליך photolithography סטנדרטי, ואחריו תחריט רטוב של הזכוכית. ראשית, מערך של מבנים רכס הם בדוגמת על מצע זכוכית לנקות עם חיובי photoresist S1818 באמצעות photolithography. S1818 היא ספין מצופים על פני המצע (4,000 סל&quot;ד), רך מבוסס על 110 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן נחשף לאור UV (84 mJ / cm 2) בעזרת aligner המסכה ואחריו פיתוח של photoresist ב MF319 עבור 40 שניות. בשלב הבא, המצע בדוגמת photoresist זכוכית שקוע תחמוצת שנאגרו לחרוט (BOE) בטמפרטורת החדר למשך 6-7 דקות כדי לקבל 2.5 מיקרומטר מבנים רכס גבוה. לבסוף, שכבת photoresist יוסר על ידי אצטון ואלכוהול איזופרופיל, ואחריו שטיפה יסודית במים (DI) דה מיונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצע זכוכית עם מיקרו רכס מבנים הוא חם בולטות נגד המאסטר PMMA להעביר את דפוסי שלה. ראשית, אדון PMMA עובש מצעים זכוכית מיושרים ידני והניח על העיתונות חם. ואז, הטמפרטורה עולה על 115 ° C. לאחר הטמפרטורה הרצויה היא הגיעה, 0.5 טון משקל מוחל במשך 5 דקות. אחרי 5 דקות, הטמפרטורה הוא מקורר עד 40 ° C והלחץ הוא שוחרר. האדון PMMA הוא חתך ואז לתוך 50.8 מ&quot;מ x 50.8 מ&quot;מ גודל הבלוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PDMS מראש פולימר (Sylgard 184) מעורבב עם סוכן ריפוי ביחס של 10: 1 לפי משקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PMMA מאסטר ממוקם בתוך חבית תערובת PDMS הוא שפך על גבי האב PMMA לפברק מאסטר PDMS. זה ממוקם אז ייבוש המחובר משאבת ואקום. PDMS שפכו על גבי PMMA המאסטר degassed אז במשך 15 דקות כדי להסיר בועות שנוצר במהלך תהליך PDMS ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל הבועות מוסרים, PDMS מכניסים לתנור מפולס 85 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת של פילמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע PDMS הוא נרפא לחלוטין, PDMS הראשי הוא קילף מן האב PMMA והניח בתוך תא ייבוש עם 2-3 טיפות trichlorosilane ושאבתי במשך 15 דקות עד אדי המעיל פני האדון PDMS. ציפוי Trichlorosilane מאפשר את שחרורו של האחרון PDMS נוירון שיתוף התרבות התקנים מן האדון PDMS. לאחר ציפוי, המאסטר PDMS היא שטפה בקצרה עם אלכוהול איזופרופילי להסיר trichlorosilane מוגזם, מיובש עם הגז N 2. </li></ol> חלק 2: התקן Neuron שכפול תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PDMS מראש פולימר (Sylgard 184) מעורבב עם סוכן ריפוי ביחס של 10: 1 לפי משקל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת PDMS הוא שפך על גבי האב PDMS ו degassed בתוך תא ייבוש המחובר משאבת ואקום במשך 15 דקות. חשוב לא לשפוך PDMS יותר מדי, כך מבנה גבוה 3.5 מ&quot;מ PDMS הבסיס אינו שקוע לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר כל הבועות מוסרים, PDMS מכניסים לתנור מפולס 85 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת של פילמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PDMS מוציאים מהתנור אחרי שעה והשאיר בטמפרטורת החדר כדי להתקרר. ואז, PDMS מכשירים נוירון תרבות הם קלופים בעדינות מן האדון PDMS. קילף מכשירים PDMS הם עטופים עם parafilm כדי להגן עליהם מפני dusts או פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PDMS התקנים, עטוף parafilm, הם לחתוך לחתיכות בודדים באמצעות מקדחה מצויד בסכין. </li></ol> חלק 3: התקן הרכבה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PDMS מכשיר נוירון תרבות ממוקם בתוך שואב פלזמה חשוף לאוויר פלזמה למשך 90 שניות כדי להפוך את פני השטח של המכשיר PDMS הידרופילי. טיפול זה יקל פלזמה microchannels להתמלא התקשורת בתרבות לאחר ההרכבה למצע poly-d-ליזין מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנים שטופלו פלזמה שקועים אז במשך 30 דקות עבור עיקור באתנול 70% ועבר בתוך מכסה המנוע ביו מעוקרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשירים מעוקרות לקוחים מתוך אתנול 70% מיובשים עם גז Millipore מסונן 2 N. מכשירים יבשים ממוקמים על גבי קלקר poly-d-ליזין מצופה 6-גם צלחת תרבות לחץ עדין מוחל על מנת להבטיח את החותם בין המצע לבין המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התקשורת מלאה אז לתא סומה, ואחריו ממלאים את ששת האקסון / גליה תאים. עדיף לתת 1-2 דקות הפסקה לפני מילוי האקסון / גליה תאים לאחר הוספת התקשורת בתרבות לתא סומה, כדי לוודא ששום בועות לכודים בתוך microchannels. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנים מלא עם התקשורת התרבות היא מודגרות בתוך 37 ° C חממה לילה לשטוף כל פסולת אפשרית או שאריות רעילים. </li></ol> חלק 4: Cell העמסה נוירון-oligodendrocyte שיתוף תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הראשון של התרבות תאים, התאים העיקריים forebrain נוירון מיום עובריים 16-18 חולדות נטענים לתוך תא סומה בצפיפות אזוריות של 500 תאים / מ&quot;מ 2. ראשית, התקשורת והתרבות בתוך תא הן סומה האקסון ו / גליה תאים הם aspirated בעזרת פיפטה לפני טעינת התא. לאחר מכן, התאים 38500, בדילול מלא μl 40 של מדיה תרבות, נטענים לתא סומה סביב פתחי הכניסה microchannel. חשוב לא לגעת במכשיר PDMS בעת טעינת התאים, שכן הוא יכול לשבור את החותם בין המכשיר לבין המצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה מכשירים סלולריים נטען במשך 30 דקות בתוך 37 ° C חממה כדי לשפר את הידבקות התא למצע. לאחר דגירה, תאים כל התמלא התקשורת והתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הם תאים בתרבית בשעה 37 ° C ב humidified 5% CO 2 באינקובטור ורק מחצית התקשורת בתרבות משתנה החוצה כל 3-4 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 14 ימים של תרבות נוירון במבחנה, oligodendrocytes מתווספים האקסון / גליה תאים לתרבות משותפת. Oligodendrocytes, גזור מן אונות המוח של חולדות Sprague-Dawley ביום הלידה 1-2, מתווספים תא האקסון / גליה כל בצפיפות על שטח של 1000 תאים / מ&quot;מ 2. לפני טעינת תאים, כ 60% של התקשורת בתרבות בתוך תאים הם aspirated עם פיפטה. זהירות חייב להיעשות לא לגעת המצע התחתונה, שכן הוא יכול לגרום נזק רשת axonal נוצרו על פני המצע. לאחר מכן, 6700 תאים oligodendrocyte, בדילול מלא μl 5 של התקשורת בתרבות, מתווספים אל האקסון / גליה תאים. תאים מודגרת במשך שעה 1 ו - תאים מלאים עם התקשורת והתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הם תאים בתרבית בשעה 37 ° C ב humidified 5% CO 2 באינקובטור ורק מחצית התקשורת בתרבות משתנה החוצה כל 3-4 ימים במשך שבועיים נוספים. </li></ol> חלק 5: תוצאות נציג: כאשר הניסויים מתבצעים כראוי, תאים הנוירון טעון לתא סומה לאתר קרוב פתחי הכניסה microchannel שכבת axonal להתחיל לגבש בתוך האקסון / גליה תאים לאחר שבוע 1 של התרבות. סימן צבירה תא עצב בתוך תא סומה יכול להיות אינדיקציה לכך התאים אינם בריאים. בעת טעינת oligodendrocytes לאחר שבועיים של תרבות נוירון, האקסון / גליה תאים צריך להיות מכוסה בשכבה צפופה של אקסונים oligodendrocytes צריך להיות טעון על גבי שכבת axonal. <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig1tmb.jpg" border="0" alt="דמות 1" /> באיור 1. איורים סכמטי של תפוקה גבוהה פלטפורמת CNS תא רב microfluidic שיתוף תרבות נוירון. חתך להציג מראה ובידוד של אקסונים מ סומה ו דנדריטים עצביים כמו גם בידוד fluidic בין תאים עם הפרש דקה רמת fluidic. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig1.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות 1. <img src="/files/ftp_upload/1399/1399fig2tmb.jpg" border="0" alt="דמות 2" /> 2. איור ייצור צעדים הרכבה עבור תא רב PDMS microfluidic שיתוף תרבות המכשיר. כל התקן מתאים לאחד היטב צלחת קונבנציונאלי 6-גם תא פוליסטירן תרבות. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1399/1399fig2.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.

<ol><li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angew. Chem. 37, 550-575 (1998).</li>
<li>Taylor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2005).</li>
<li>Li, J., Baud, O., Vartanian, T., Volpe, J. J., Rosenberg, P. A., A, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxynitrite+generated+by+inducible+nitric+oxide+synthase+and+NADPH+oxidase+mediates+microglial+toxicity+to+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Peroxynitrite generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial toxicity to oligodendrocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 9936-9941 (2005).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

פיתחנו תא רב שיתוף תרבות פלטפורמה לחקר יונקים CNS-האקסון גליה אינטראקציה. אקסונים CNS בודדו בהצלחה מתא גופים העצבית / דנדריטים, ו oligodendrocytes היו בהצלחה שיתוף בתרבית בתוך המכשיר. צפיפות Neuron יכולים להיות מגוונים על ידי יישומים, אבל בריכוז נמוך מדי או גבוה מדי עלול לגרום לתאים למות. כמו כן, חשוב לשנות רק מחצית התקשורת בתרבות כך תאים או שכבת axonal על פני המצע אינם פגומים. אנו צופים כי המערכת הזו תהיה כלי רב עוצמה ללימוד CNS-האקסון גליה איתות רשתות במבחנה לספק נתיב ל...

תא multi-cns-neuron גליה שותף תרבות microfluidic רציף

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

אנו מציגים רומן תא רב שיתוף תרבות נוירון microsystem פלטפורמה למחקר האקסון גליה ב-CNS במבחנה אינטראקציה, המסוגלת לנהל עד שישה ניסויים עצמאיים במקביל עבור תפוקה גבוהה יותר. פיתחנו שיטת ייצור חדשים כדי ליצור התקנים microfluidic שיש מבנים בקנה מידה הן מיקרו ומקרו בתוך המכשיר אותו באמצעות תהליך רך ליתוגרפיה יחיד, מה שמאפשר ייצור המוני עם הדירות טוב. תא רב פלטפורמת microfluidic שיתוף תרבות מורכבת במדור אחד עבור סומה נוירונים ושישה האקסון / גליה מדורים oligodendrocytes (OLS). תא סומה האקסון ו / גליה תאים המחוברים באמצעות מערכים של האקסון, המנחה microchannels המתפקדים מחסומים פיזיים להגביל סומה עצבי בתא סומה, תוך מתן אפשרות האקסונים לגדול לתוך האקסון / תאים גליה. OLS נטען לתוך האקסון / גליה תאים יכולים לתקשר רק עם אקסונים אך לא עם סומה או דנדריטים עצביים, מה שמאפשר מקומי האקסון, גליה מחקרים אינטראקציה. Microchannels גם איפשר הבידוד fluidic בין תאים, המאפשר six ניסויים עצמאיים להתנהל על התקן יחיד עבור תפוקה גבוהה יותר. רכים ליתוגרפיה באמצעות פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) היא טכניקה הנמצאת בשימוש נפוץ microdevices ביו. מאגרים על מכשירים אלה מוגדרים בדרך כלל על ידי ניקוב ידני. למרות יישור פשוטים, עניים הטבע זמן רב של התהליך עושה את התהליך הזה אינו מתאים כאשר מספר גדול של מאגרי יש ליצור שוב ושוב. השיטה החדשה שפותחה לא דורשים ניקוב ידני של מאגרים, להתגבר על מגבלות כאלה. ראשית, שבעה מאגרי מים (עומק: 3.5 מ&quot;מ) נעשו על בלוק פולי (PMMA) (methacrylate מתיל) באמצעות מכונת כרסום מיקרו. ואז, מערכים של microstructures רכס, מפוברק על מצע זכוכית, היו חמים בולטות נגד בבלוק PMMA להגדיר microchannels המחברים את סומה ואת האקסון / גליה תאים. תהליך זה הביא המאקרו היקף המאגרים (3.5 מ&quot;מ) ומיקרו בקנה מידה ערוצים (2.5 מיקרומטר) כדי לחפוף בתוך מאסטר PMMA יחיד. העתק PDMS ששימש מאסטר עובש הושג באמצעות רך ליתוגרפיה והמכשיר הסופי PDMS היה משוכפל מן האדון הזה. נוירונים ראשי מ E16-18 חולדות הועמסו לתא סומה ותרבותי במשך שבועיים. לאחר שבוע של תרבית תאים, אקסונים חצה microchannels והקימו רשת axonal שכבת רק בתוך האקסון / גליה תאים. אקסונים גדל באופן אחיד במשך שש האקסון / גליה תאים ו OLS מ P1-2 חולדות נוספו האקסון / גליה תאים ב 14 ימים במבחנה לתרבות משותפת.

פיתחנו רומן רב תא שיתוף תרבות נוירון פלטפורמה עבור microsystem ב CNS מחקר במבחנה אינטראקציה האקסון, גליה. פלטפורמה המסוגלת לנהל עד שישה ניסויים עצמאיים במקביל היה מפוברק באמצעות פיתח מאקרו / מיקרו שיטת ייצור כלאיים.

תא Multi-CNS-Neuron גליה שותף תרבות Microfluidic רציף

אנו מציגים פלטפורמת מיקרו-מערכת חדשנית לתרבית משותפת של נוירונים רב-מדורית למחקר של אינטראקציית אקסון-גליה במערכת העצבים המרכזית (CNS) במערכת in vitro, המסוגלת לבצע עד...

ייצור התקן מיקרופלואידי רב-תאים לתרבית משותפת של נוירונים מתחיל בהגדרת מאגרי נוזלים על גבי בלוק PMMA באמצעות מכונת כרסום, ולאחריה ביצוע תבנית חמה (hot embossing) של מערכי מיקרו-ערוצים המחברים בין התאים. לאחר הכנת תבנית ה-PMMA, משכפלים ממנה מאסטר לתבנית PDMS ומצפים אותו בטריכלוראתילן (trichlorethylene). ההתקן הסופי משוכפל ממאסטר תבנית ה-PDMS ומורכב על פלטת תרבית מצופה ב-PDL.נוירונים ראשוניים של חולדה בגיל E 16 עד 18 נטענים תחילה לתא הסומה ומגודלים במשך שבועיים לפני הוספת תאי אוליגודנדרוציטים של חולדה בגיל P one to two מעל לשכבות האקסונים בתוך תא ה-axon ggl לצורך תרבית משותפת. שלום, אני J Par ממעבדת Nano Bio Systems במחלקה להנדסת חשמל ומחשבים באוניברסיטת Texas a and m. היום נראה לכם הליך לייצור פלטפורמת מיקרופלואידיקה רב-תאית לתרבית משותפת של נוירונים.אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור אינטראקציה בין נוירונים לגליות במערכת העצבים המרכזית in vitro. בואו נתחיל. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, השתמשו במכונת כרסום מיקרונית כדי ליצור תאים בעומק של 3.5 millimeter.בבלוק A-P-M-M-A הגדירו מדור אחד של סומה (goma) ושישה מדורים של axon ggl. לאחר הכנת המדורים, בצעו סוניקציה ב-isopropanol למשך 10 דקות כדי להסיר שאריות, צרו מבני micro ridge על גבי למסחת הזכוכית באמצעות פוטוליתוגרפיה קונבנציונלית ותהליך תכשיט רטוב (wet etching), ובצעו hot emboss של תבניות ה-micro ridge מהזכוכית. החליקו תחילה אל ה-PMMA master, ויישרו ידנית את תבנית ה-PMMA master ואת מצע הזכוכית.לאחר מכן העלה את הטמפרטורה ל-115 °C באמצעות מכבש חם. ברגע שהטמפרטורה הגיעה לרמה הרצויה, הפעל משקל של 0.5 tons למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, קרר ל-40 °C ושחרר את הלחץ.כעת התחילו בהכנת תבנית ה-PDMS. ערבבו את הפולימר המקדים של ה-PDMS עם סוכן ההר curing ביחס של 10 ל-1 לפי משקל, וחתכו את תבנית ה-PMMA לבלוקים בגודל 50 millimeter על 50 millimeter. באמצעות מסור קשת, הניחו אותה בתוך מיכל ושפכו את תערובת ה-PDMS מעל תבנית ה-PMMA; הניחו את המיכל בתוך דסיקטור המחובר למשאבת ואקום ו-DGAs למשך 15 דקות.להסרת בועות שהיווצרו במהלך תהליך ערבוב ה-PDMS. לאחר שכל הבועות הוסרו, יש להניח את התבנית בתנור מפולס בטמפרטורה של 85 degrees Celsius למשך שעה אחת לצורך פולימריזציה. לאחר שה-PDMS התגבש לחלוטין, קלפו את תבנית ה-PDMS מתבנית ה-PMMA, ובצעו ציפוי אדים לתבנית ה-PDMS על ידי הנחתה בתוך דסיקטור עם שתיים עד שלוש טיפות של trichlorethylene והחלת ואקום למשך 15 דקות.ציפוי של תבנית ה-PDMS המקורית מקל על שחרור התקן הסופי לקו-קלטורה של נוירונים מ-PDMS מתבנית ה-PDMS המקורית. לאחר הציפוי, שוטפים בקצרה את תבנית ה-PDMS המקורית באיזופרופנול כדי להסיר עודפי טריכלורואתילן ומייבשים בגז חנקן. ייצור התקן לקו-קלטורה של נוירונים מפולימר PDMS דומה להכנת תבנית ה-PDMS המקורית שתוארה בסעיף הקודם. התחילו בערבוב של קדם-פולימר PDMS עם חומר מקשה ביחס של 10 ל-1 לפי משקל, ואז שפכו את תערובת ה-PDMS על גבי תבנית ה-PDMS המקורית. חשוב לא לשפוך כמות גדולה מדי של PDMS, כדי שמבנה ה-PDMS בגובה 3.5 millimeter שעל התבנית המקורית לא יטבע לחלוטין.DGAs בתוך דסיקטור המחובר למשאבת ואקום למשך 15 דקות. כאשר כל הבועות הוסרו, הכניסו את ה-PDMS לתנור מאוזן בטמפרטורה של 85 degrees Celsius למשך שעה לצורך פולימריזציה. בתום השעה, הוציאו את ה-PDMS מהתנור והשאירו אותו בטמפרטורת החדר להתקרר. לאחר מכן, קלפו בעדינות את התקני גידול הנוירונים מ-PDMS מה-PDMS master.עטפו את התקני ה-PDMS בפרפורם כדי להגן עליהם מאבק או לכלוך. השלימו את התהליך על ידי חיתוך ה-PDMS העטוף בפרפורם לחלקים בודדים באמצעות מכבש קידוח המצויד בלהב; התקני ה-PDMS לתרבית משותפת של נוירונים כמעט מוכנים לשימוש בצלחות תרבית תאים. לפני הנחת התקן ה-PDMS לתרבית משותפת של נוירונים בצלחת תרבית תאים, הכניסו את ההתקן לתוך מנקה פלזמה וחשפו אותו לפלזמת אוויר למשך 90 שניות כדי להפוך את הפני השטח להידרופיליים.טיפול זה יקל על מילוי המיקרו-ערוצים בתמירי תרבית לאחר ההרכבה על פלטות מצופות poly-D-lysine. כדי לעקר את ההתקן שעבר טיפול בפלזמה, טבול אותו ב-70% ethanol למשך 30 דקות והעבר את המיכל למבן הביולוגי הסטרילי. לאחר 30 דקות, הוצא את ההתקן וייבש אותו באמצעות גז חנקן המסונן דרך מסנן millipore של 0.2 micron.כעת הנח את ההתקנים המיובשים על גבי פלטת תרבית של שש בארות מפוליסטירן מצופה ב-poly D lysine, והפעל לחץ עדין כדי להבטיח איטום הדוק בין פני הפלטה לבין ה-ice של ההתקן. כעת מלא את תא הסומה (soma compartment) במצע גידול. המתן דקה או שתיים כדי לוודא שלא נלכדו בועות בתוך המיקרו-ערוצים.לאחר מכן מלאו את ששת תאי הגליות של האקסון. לבסוף, הדגרימו את המכשירים המלאים בתמיסת תרבית באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך לילה כדי להסיר שאריות פסולת או משקעים רעילים אפשריים. לאחר הדגרת הלילה, ניתן להתחיל בתרבית כדי להכין את המכשיר להעמסת תאים.השתמשו בפיפט כדי לשאוב את מצע התרבית מתאי הסומה (Soma) והאקסון (Axon). לאחר מכן, טענו 40 µL של תאי נוירונים ראשוניים מהמוח הקדמי של חולדות מימי עובר 16 עד 18 אל תא הסומה, סביב פתחי המיקרו-ערוץ, בצפיפות שטחית של 500 תאים לממ"ר. חשוב לא לגעת בהתקן ה-PDMS בזמן טעינת התאים, שכן הדבר עלול לשבור את האיטום בין ההתקן לבין פלטת תרבית התאים.תמונות מיקרוסקופיות אלו מציגות תאי עצב שצבעו calcium am. בתוך מדור הסומה (soma), התאים טעונים באופן אחיד בתוך המדור וממוקמים בקרבה לתעלות המיקרופלואידיקה. יש להדגיר את ההתקנים הטעונים בתאים למשך 30 דקות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C כדי להגביר את היצמדות התאים למצע.לאחר דגירה זו, מלאו את כל התאים במצע גידול. שמרו על התאים הגדלים במכשיר בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם 5%CO2, והחליפו רק מחצית ממצע הגידול מדי שלושה או ארבעה ימים. רשת אקסונית צפופה אמורה להיווצר בתוך תאי ה-Axon glia.לאחר שבועיים של תרבית, לפני טעינת התאים, שואבים כ-60% מתווך התרבית מהתאים. תאי נוירונים ראשוניים in vitro CLIA מתווספים. אוליגודנדרוציטים בודדו מהחצאי המוח של חולדות Sprague Dawley בימים 1 עד 2 לאחר הלידה. מוסיפים 5 µL של תאי אוליגודנדרוציטים לכל תא של axon glia בצפיפות של 1000 תאים לממ"ר. יש להיזהר לא לגעת בתחתית המצע באמצעות הפיפטה בזמן הטעינה, כיוון שדבר זה עלול לפגוע ברשת האקסונים שנוצרה על המצע. לאחר הוספת האוליגודנדרוציטים, מדגרים את התאים במשך שעה אחת ב-37 °C ולאחר מכן ממלאים את התאים.המשך את גידול הנוירונים עם מצע גידול כפי שנעשה לפני הוספת ה-CLIA; החלף רק מחצית ממצע הגידול מדי שלושה או ארבעה ימים למשך שבועיים נוספים, תוך כדי חקר האינטראקציה בין אקסונים לגליה במערכת העצבים המרכזית של יונקים. כאשר הניסויים מבוצעים כראוי, תאי נוירונים שהוטענו לתא הסומה ממוקמים קרוב לכניסות המיקרו-ערוצים, ושכבה אקסונלית מתחילה להיווצר בתוך תאי ה-axon Ggl.לאחר שבוע אחד של תרבית, סימנים של אגרגציה של תאי נוירונים בתוך תא הסומה יכולים להוות אינדיקציה לכך שהתאים אינם בריאים בעת טעינת אוליגודנדרוציטים. לאחר שבועיים של תרבית נוירונים, תאי ה-axon ggl צריכים להיות מכוסים בשכבה צפופה של אקסונים, ויש לטעון אוליגודנדרוציטים מעל השכבה האקסונלית. כעת הצגנו בפניכם כיצד לייצר פלטפורמת תרבית נוירונים רב-תאית וכיצד להשתמש בה כדי לחקור אינטראקציה בין נוירוגליה של ה-CNS in vitro.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להגן על המכשירים מאבק ולא לעקר אותם באתנול למשך זמן ממושך מדי, שכן הדבר עלול לפגוע בחיבור. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

a-multi-compartment-cns-neuron-glia-co-culture-microfluidic-platform

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון הזה אנחנו מדגימים את הטכניקה של ליתוגרפיה רך עם polydimethyl siloxane (PDMS) שבו אנו משתמשים כדי farbricate מכשיר microfluidic עבור נוירונים culturing.

המצאה של המכשיר microfluidic עבור מידור של Neuron סומה האקסונים

בסרטון הזה אנחנו מדגימים הכנת E18 עכברוש נוירונים בקליפת המוח.

הכנת E18 נוירונים עכברוש קליפתיים עבור מידור בתוך המכשיר microfluidic

BioMEMS: Forging שיתופי פעולה חדשים בין ביולוגים ומהנדסים

מחקר זה מתאר את ההליכים של הקמת אקסון עצבי רומן ופלטפורמה (אסטרו) גליה שיתוף תרבות. במערכת זו שיתוף התרבות, מניפולציה של אינטראקציה ישירה בין האקסון יחיד (ותאי גלייה יחידים) הופכת להיות ריאלית, המאפשרת ניתוח מכניסטית של נוירון ההדדי לאיתות גליה.

ניתוח הדמיה של תא עצב לאינטראקצית גליה בפלטפורמת תרבות Microfluidic (MCP)-מבוסס אקסון העצבי ומערכת גליה שיתוף תרבות

סרטון זה מדגים את השימוש בשבב מיקרופלואיד פלסטי שהורכב מראש עבור תרבית ממודרת של נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס של חולדה. תאי העצב מצופים באחד התאים המיקרופלואידים, שם הם מתחברים וגדלים, ומאריכים את האקסונים שלהם דרך המיקרו-חריצים של השבב לתוך התא הסמוך. המיקרו-חריצים הצרים מונעים מגופי תאי עצב להיכנס, ובכך מאפשרים הפרדה פיזית בין התאים הסומטיים והאקסונליים.

תרבית נוירונים ראשונית ממודרת באמצעות שבבים מיקרופלואידים מפלסטיק

סרטון זה מדגים את הערכת הפעילות החשמלית העצבית בתרבית משותפת של נוירונים גלוטמטרגיים קליפת המוח שמקורם ב-hiPSC ותאי גליומה באמצעות מכשיר מיקרופלואידי עם מערכים מרובי אלקטרודות.

הערכת אינטראקציות בין נוירונים גלוטמטרגיים ותאי גליומה בתרבית משותפת

פרוטוקולים לעריכה אחת נוירון microfluidic ומיסוך מים לדפוסי פלזמה בשבב של ציפויים ביולוגי מתוארים. ניתן להכין שיתוף תרבויות מקושרות ביותר באמצעות תשומות תא מינימליות.

הכנת עצבית שיתוף תרבויות עם Precision תא בודד

פרוטוקול זה מתאר את השימוש שבבי פלסטיק תרבות, ממדר אותם נוירונים מאתר העיקרי. . הצ'יפס הזה preassembled, ידידותי למשתמש, תואם עם רזולוציה גבוהה, לחיות, קרינה פלואורסצנטית והדימות. פרוטוקול זה מתאר את אופן צלחת החולדה הנוירונים בהיפוקמפוס בתוך הצ'יפס הזה ולבצע בידוד fluidic, axotomy ו- immunostaining.

שימוש של שבבי Microfluidic פלסטיק מראש ממדר נוירונים מאתר העיקרי

פרוטוקול זה מדגים את השימוש של שבבי microflu, ממדר מיקרופלואידים, הזרקה מחזורית אולפין קופולימר לנוירונים מתורבתים הבדיל מתאי גזע אנושיים. שבבים אלה מורכבים וקלים לשימוש מאשר התקנים ממוזגים פולי (diמתיל siloxane) מסורתיים. מספר תפיסות נסיוניות נפוצות מתוארות כאן, כולל תיוג נגיפי, בידוד פלואידיג, הוספת פיום וכתמים חיסוני.

מידור של תאי גזע האדם הנגזרים בתוך שבבי מיקרופלואידיג פלסטיק מורכבים מראש

פרוטוקול זה מתאר תרבית מיקרוגליה-נוירונים שנוצרה מתאים עצביים ראשוניים שבודדו מעוברי עכברים בימים עובריים 15-16 ומתאי מיקרוגליה ראשוניים שנוצרו ממוחם של עכברים ילודים בימים 1-2 שלאחר הלידה.

יצירה וטיפוח משותף של תאי מיקרוגליה ראשוניים של מורין ונוירונים קורטיקליים

פרוטוקול זה מתאר מערכת מיקרופלואידית המדגמנת דינמיקה מטבולית עצבית לאחר פגיעה אקסונלית, המאפשרת הדמיה, ניתוח מולטי-אומיקס ומחקרים מכניסטיים של שיפוץ מטבולי מהותי.

שבב מיקרופלואידי עבור מודלים של פגיעות אקסונליות בנייה ומאפשר ניתוח מולטי-אומיקס

למד שיטת תרבית שיתוף נוירון-גליה במערכת מיקרו-זורמית רב-תאית לחקר אינטראקציות אקסון-גליה במערכת העצבים המרכזית. השיטה מאפשרת ביצוע ניסויים מקבילים ושליטה מדויקת בסביבה התאית.

תא Multi-CNS-Neuron גליה שותף תרבות Microfluidic רציף

גלה סרטונים נוספים