תא Multi-CNS-Neuron גליה שותף תרבות Microfluidic רציף

ייצור התקן מיקרופלואידי רב-תאים לתרבית משותפת של נוירונים מתחיל בהגדרת מאגרי נוזלים על גבי בלוק PMMA באמצעות מכונת כרסום, ולאחריה ביצוע תבנית חמה (hot embossing) של מערכי מיקרו-ערוצים המחברים בין התאים. לאחר הכנת תבנית ה-PMMA, משכפלים ממנה מאסטר לתבנית PDMS ומצפים אותו בטריכלוראתילן (trichlorethylene). ההתקן הסופי משוכפל ממאסטר תבנית ה-PDMS ומורכב על פלטת תרבית מצופה ב-PDL.

נוירונים ראשוניים של חולדה בגיל E 16 עד 18 נטענים תחילה לתא הסומה ומגודלים במשך שבועיים לפני הוספת תאי אוליגודנדרוציטים של חולדה בגיל P one to two מעל לשכבות האקסונים בתוך תא ה-axon ggl לצורך תרבית משותפת. שלום, אני J Par ממעבדת Nano Bio Systems במחלקה להנדסת חשמל ומחשבים באוניברסיטת Texas a and m. היום נראה לכם הליך לייצור פלטפורמת מיקרופלואידיקה רב-תאית לתרבית משותפת של נוירונים.

אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור אינטראקציה בין נוירונים לגליות במערכת העצבים המרכזית in vitro. בואו נתחיל. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, השתמשו במכונת כרסום מיקרונית כדי ליצור תאים בעומק של 3.5 millimeter.

בבלוק A-P-M-M-A הגדירו מדור אחד של סומה (goma) ושישה מדורים של axon ggl. לאחר הכנת המדורים, בצעו סוניקציה ב-isopropanol למשך 10 דקות כדי להסיר שאריות, צרו מבני micro ridge על גבי למסחת הזכוכית באמצעות פוטוליתוגרפיה קונבנציונלית ותהליך תכשיט רטוב (wet etching), ובצעו hot emboss של תבניות ה-micro ridge מהזכוכית. החליקו תחילה אל ה-PMMA master, ויישרו ידנית את תבנית ה-PMMA master ואת מצע הזכוכית.

לאחר מכן העלה את הטמפרטורה ל-115 °C באמצעות מכבש חם. ברגע שהטמפרטורה הגיעה לרמה הרצויה, הפעל משקל של 0.5 tons למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, קרר ל-40 °C ושחרר את הלחץ.

כעת התחילו בהכנת תבנית ה-PDMS. ערבבו את הפולימר המקדים של ה-PDMS עם סוכן ההר curing ביחס של 10 ל-1 לפי משקל, וחתכו את תבנית ה-PMMA לבלוקים בגודל 50 millimeter על 50 millimeter. באמצעות מסור קשת, הניחו אותה בתוך מיכל ושפכו את תערובת ה-PDMS מעל תבנית ה-PMMA; הניחו את המיכל בתוך דסיקטור המחובר למשאבת ואקום ו-DGAs למשך 15 דקות.

להסרת בועות שהיווצרו במהלך תהליך ערבוב ה-PDMS. לאחר שכל הבועות הוסרו, יש להניח את התבנית בתנור מפולס בטמפרטורה של 85 degrees Celsius למשך שעה אחת לצורך פולימריזציה. לאחר שה-PDMS התגבש לחלוטין, קלפו את תבנית ה-PDMS מתבנית ה-PMMA, ובצעו ציפוי אדים לתבנית ה-PDMS על ידי הנחתה בתוך דסיקטור עם שתיים עד שלוש טיפות של trichlorethylene והחלת ואקום למשך 15 דקות.

ציפוי של תבנית ה-PDMS המקורית מקל על שחרור התקן הסופי לקו-קלטורה של נוירונים מ-PDMS מתבנית ה-PDMS המקורית. לאחר הציפוי, שוטפים בקצרה את תבנית ה-PDMS המקורית באיזופרופנול כדי להסיר עודפי טריכלורואתילן ומייבשים בגז חנקן. ייצור התקן לקו-קלטורה של נוירונים מפולימר PDMS דומה להכנת תבנית ה-PDMS המקורית שתוארה בסעיף הקודם. התחילו בערבוב של קדם-פולימר PDMS עם חומר מקשה ביחס של 10 ל-1 לפי משקל, ואז שפכו את תערובת ה-PDMS על גבי תבנית ה-PDMS המקורית. חשוב לא לשפוך כמות גדולה מדי של PDMS, כדי שמבנה ה-PDMS בגובה 3.5 millimeter שעל התבנית המקורית לא יטבע לחלוטין.

DGAs בתוך דסיקטור המחובר למשאבת ואקום למשך 15 דקות. כאשר כל הבועות הוסרו, הכניסו את ה-PDMS לתנור מאוזן בטמפרטורה של 85 degrees Celsius למשך שעה לצורך פולימריזציה. בתום השעה, הוציאו את ה-PDMS מהתנור והשאירו אותו בטמפרטורת החדר להתקרר. לאחר מכן, קלפו בעדינות את התקני גידול הנוירונים מ-PDMS מה-PDMS master.

עטפו את התקני ה-PDMS בפרפורם כדי להגן עליהם מאבק או לכלוך. השלימו את התהליך על ידי חיתוך ה-PDMS העטוף בפרפורם לחלקים בודדים באמצעות מכבש קידוח המצויד בלהב; התקני ה-PDMS לתרבית משותפת של נוירונים כמעט מוכנים לשימוש בצלחות תרבית תאים. לפני הנחת התקן ה-PDMS לתרבית משותפת של נוירונים בצלחת תרבית תאים, הכניסו את ההתקן לתוך מנקה פלזמה וחשפו אותו לפלזמת אוויר למשך 90 שניות כדי להפוך את הפני השטח להידרופיליים.

טיפול זה יקל על מילוי המיקרו-ערוצים בתמירי תרבית לאחר ההרכבה על פלטות מצופות poly-D-lysine. כדי לעקר את ההתקן שעבר טיפול בפלזמה, טבול אותו ב-70% ethanol למשך 30 דקות והעבר את המיכל למבן הביולוגי הסטרילי. לאחר 30 דקות, הוצא את ההתקן וייבש אותו באמצעות גז חנקן המסונן דרך מסנן millipore של 0.2 micron.

כעת הנח את ההתקנים המיובשים על גבי פלטת תרבית של שש בארות מפוליסטירן מצופה ב-poly D lysine, והפעל לחץ עדין כדי להבטיח איטום הדוק בין פני הפלטה לבין ה-ice של ההתקן. כעת מלא את תא הסומה (soma compartment) במצע גידול. המתן דקה או שתיים כדי לוודא שלא נלכדו בועות בתוך המיקרו-ערוצים.

לאחר מכן מלאו את ששת תאי הגליות של האקסון. לבסוף, הדגרימו את המכשירים המלאים בתמיסת תרבית באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך לילה כדי להסיר שאריות פסולת או משקעים רעילים אפשריים. לאחר הדגרת הלילה, ניתן להתחיל בתרבית כדי להכין את המכשיר להעמסת תאים.

השתמשו בפיפט כדי לשאוב את מצע התרבית מתאי הסומה (Soma) והאקסון (Axon). לאחר מכן, טענו 40 µL של תאי נוירונים ראשוניים מהמוח הקדמי של חולדות מימי עובר 16 עד 18 אל תא הסומה, סביב פתחי המיקרו-ערוץ, בצפיפות שטחית של 500 תאים לממ"ר. חשוב לא לגעת בהתקן ה-PDMS בזמן טעינת התאים, שכן הדבר עלול לשבור את האיטום בין ההתקן לבין פלטת תרבית התאים.

תמונות מיקרוסקופיות אלו מציגות תאי עצב שצבעו calcium am. בתוך מדור הסומה (soma), התאים טעונים באופן אחיד בתוך המדור וממוקמים בקרבה לתעלות המיקרופלואידיקה. יש להדגיר את ההתקנים הטעונים בתאים למשך 30 דקות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C כדי להגביר את היצמדות התאים למצע.

לאחר דגירה זו, מלאו את כל התאים במצע גידול. שמרו על התאים הגדלים במכשיר בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם 5%CO2, והחליפו רק מחצית ממצע הגידול מדי שלושה או ארבעה ימים. רשת אקסונית צפופה אמורה להיווצר בתוך תאי ה-Axon glia.

לאחר שבועיים של תרבית, לפני טעינת התאים, שואבים כ-60% מתווך התרבית מהתאים. תאי נוירונים ראשוניים in vitro CLIA מתווספים. אוליגודנדרוציטים בודדו מהחצאי המוח של חולדות Sprague Dawley בימים 1 עד 2 לאחר הלידה. מוסיפים 5 µL של תאי אוליגודנדרוציטים לכל תא של axon glia בצפיפות של 1000 תאים לממ"ר. יש להיזהר לא לגעת בתחתית המצע באמצעות הפיפטה בזמן הטעינה, כיוון שדבר זה עלול לפגוע ברשת האקסונים שנוצרה על המצע. לאחר הוספת האוליגודנדרוציטים, מדגרים את התאים במשך שעה אחת ב-37 °C ולאחר מכן ממלאים את התאים.

המשך את גידול הנוירונים עם מצע גידול כפי שנעשה לפני הוספת ה-CLIA; החלף רק מחצית ממצע הגידול מדי שלושה או ארבעה ימים למשך שבועיים נוספים, תוך כדי חקר האינטראקציה בין אקסונים לגליה במערכת העצבים המרכזית של יונקים. כאשר הניסויים מבוצעים כראוי, תאי נוירונים שהוטענו לתא הסומה ממוקמים קרוב לכניסות המיקרו-ערוצים, ושכבה אקסונלית מתחילה להיווצר בתוך תאי ה-axon Ggl.

לאחר שבוע אחד של תרבית, סימנים של אגרגציה של תאי נוירונים בתוך תא הסומה יכולים להוות אינדיקציה לכך שהתאים אינם בריאים בעת טעינת אוליגודנדרוציטים. לאחר שבועיים של תרבית נוירונים, תאי ה-axon ggl צריכים להיות מכוסים בשכבה צפופה של אקסונים, ויש לטעון אוליגודנדרוציטים מעל השכבה האקסונלית. כעת הצגנו בפניכם כיצד לייצר פלטפורמת תרבית נוירונים רב-תאית וכיצד להשתמש בה כדי לחקור אינטראקציה בין נוירוגליה של ה-CNS in vitro.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להגן על המכשירים מאבק ולא לעקר אותם באתנול למשך זמן ממושך מדי, שכן הדבר עלול לפגוע בחיבור. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.