Dissection של דיסקים דמותי מן הזחלים 3 תסיסנית Instar
17 בפברואר 2007
פרוטוקול זה מדגים את הטכניקה לנתיחה משמש לבידוד דיסקים דמותי מן הזחלים תסיסנית בשלב instar 3. שיטות לתיקון רקמות אחרי אומר והסרה של הזרוע, רגל, עין ודיסקים הם הוכיחו ישירות על שקופיות מיקרוסקופ להדמיה הבאים.
היום אני הולך להראות לכם כיצד לנתח דיסקים דמיוניים מזחלי דרוזופילה של הכוכב השלישי. דיסקי זחל מדרגה שלישית יכולים לשמש למספר תהליכי התפתחות. אנחנו מסתכלים עליהם במעבדה שלנו כדי לראות את תהליך האפופטוזיס, אבל אתה יכול לבטא בהם חלבונים שונים ולחקור אותם כך ולראות כל מיני תהליכים התפתחותיים שמתרחשים בתוך הדיסקים לפי הסדר.
כדי לעשות זאת, אני הולך להשתמש בכמה כלים חשובים מאוד. הראשון הוא מקל הקטיף שבעזרתו נוציא את הזחלים מהכלים שלהם. הבא, חשוב מאוד הוא מלקחיים הניתוחים, שצריכים להיות חדים במיוחד כדי שהדיסקציה תצא לדרך.
לאחר מכן נשתמש בלהב כירורגי, להב כירורגי מספר 11 כדי להסיר את הדיסקים מהראש. ואז נניח את הדיסקים על שקופית עם מגן וקטורי כלשהו כאמצעי ההרכבה שלנו. אז הדבר הראשון שאנחנו הולכים לעשות הוא לאסוף כמה זחלים שלישיים וכוכבים נודדים, שלישי וכוכב.
אני פשוט משתמש במקל האיסוף שלי כאן כדי לחטט אותם מהצד של הבקבוקון. לפעמים זה עוזר אם המקל שלך קצת רטוב ואז לשים אותם בטיפה של PBS. אוקיי, אז הנה לנו זחלי הכוכב השלישי שלנו.
מכיוון שאני ימני, אני הולך לסובב את ראשו לימיני ואנחנו הולכים להשתמש בכמה נקודות ציון שידריכו אותנו היכן לתפוס אותו. הראשון הוא החלק העיקרי של קנה הנשימה כאן וכאן. ואז יש כאן חתך קטן לכיוון הראש.
אז ראשית אני הולך לתפוס את הזחלים כשני שליש מהדרך במורד הגוף מהראש בעדינות. ואז אני הולך לתפוס ביד ימין כמה מילימטרים מאחורי החתיכה הצולבת כאן, מנסה להגיע בערך למחצית הרוחב של הזחלים. אז זו תפיסה די טובה.
אתם יכולים לראות שאני בערך באמצע הדרך. אז אני מושך בעדינות עם יד ימין קדימה, רואה את כל המעיים יוצאים משם. בסדר. כעת ניתן להשליך את החלק העיקרי של הגוף.
וכאן יש לנו את הראש, הכולל את הדיסקים הדמיוניים המחוברים לחלקי הפה. אז אני הולך לתפוס אותו בחלקי הפה כדי לא לרסק אף אחד מהדיסקים ולהעביר אותו לנקודה טרייה של PBS. אז עכשיו יש לנו את ראש הזחל הקבוע שלנו.
אנחנו הולכים להסיר את כל הרקמה העודפת ולתפוס את הזחל בפיות כמו קודם או שנוכל ללחוץ אותו כלפי מטה על צלחת החיתוך עם המלקחיים. שופרות נמצאים עכשיו משמאל. בסדר, אז הנה לנו המעיים, שאנחנו לא רוצים, ויש בלוטת רוק.
יש גוף שמן או גוף שמן. פשוט המשיכו להתרחק, במיוחד שומן, שיכול להפריע לבדיקות מסוימות ולהכתים כל דבר שאתם לא רוצים. אז עכשיו יש לנו את ראש הזחל הנקי.
אז עכשיו יש לנו את ראשי הזחלים שלנו, שנותחו מהגוף, תוקנו ונשטפו, הרקמה החיצונית הוסרה והם טופלו בכל מה שהם צריכים לטפל בו, שיכול להיות כתם נוגדנים במנהרת C 2 או כתם פונקציונלי אחר. ועכשיו הנחנו אותם על שקופית ואנחנו מוכנים לנתח את הדיסקים עצמם הרחק מהראש. חלקי הפה.
אוקיי, אז הפעם חלקי הפה שלנו נמצאים בצד שמאל כאן. אני הולך לקחת את המלקחיים שלי ופשוט ללחוץ אותם כלפי מטה כנגד המגלשה. על ידי הימנית יש לי להב אזמל מספר 11, שהוא גם מכשיר קצת יותר עדין, איתו ניתן לנתח.
אז קודם אני הולך להוריד את מערכת העצבים המרכזית ואת האונות האופטיות. ואתם רואים שיש את מערכת העצבים המרכזית, יש את שתי האונות האופטיות, והנה דיסקיות אנטנת העין המחוברות אליהן. אז אם אני מסיר את מערכת העצבים המרכזית על ידי הדבקת הלהב שלי בין האונות האופטיות לדיסקי העין ומשיכה איטית, אז דיסקי העין נמתחים שם.
אוקיי, אז הנה לנו מערכת העצבים המרכזית והאונות האופטיות. אז עכשיו יש לנו את שני דיסקי העין והעין שנותקו ממערכת העצבים המרכזית. עכשיו אני הולך להרחיק אותם מחלקי הפה רק על ידי חיתוך עדין ומשיכה בבסיס.
אוקיי, אז יש דיסק אנטנה אחד של העין, הדיסק השני של העין. בסדר. ועכשיו אנחנו יכולים לראות את דיסק הכנף מבצבץ כאן. אני הולך, שוב, למצוא בעדינות את חתך הבסיס ולמשוך.
אז הנה לנו דיסק כנף ודיסק רגליים מחובר אליו, יחד עם מעט קנה נשימה. אוקיי, אז הנה דיסק הכנף שלך עם דיסק רגליים מחובר, וברור שיש כמה דיסקים ברגליים. אז אנחנו יכולים, אנחנו יכולים לחפש כאן ולמצוא דיסקים נוספים רק על ידי חיטוט עדין עם הלהב.
זה כל הדיסקים שאנחנו הולכים למצוא בדיסק הזה. יש עוד כמה דיסקים לרגליים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
פרוטוקול זה מדגים את טכניקת הניתוח המשמשת לבידוד דיסקים אימגינליים מזחלי דרוזופילה בשלב הגולם השלישי. שיטות לקיבוע הרקמה לאחר הסרת דיסקי הכנפיים, הרגליים והעיניים מוצגות ישירות על שקופית מיקרוסקופ לצורך ויזואליזציה נוספת.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- גנטיקה
רקע
- דיסקים אימגינליים חיוניים לחקר תהליכים התפתחותיים בדרוזופילה.
- זחלי גולם שלישי מספקים מודל לבחינת אפופטוזיס וביטוי חלבונים.
- טכניקות ניתוח חיוניות לבידוד רקמות ספציפיות לניתוח.
- כלים ושיטות נכונים משפרים את דיוק הניתוחים.
מטרת המחקר
- לבודד דיסקים אימגינליים למחקרים התפתחותיים.
- לדמיין ולנתח תהליכים תאיים בתוך הדיסקים.
- לספק פרוטוקול מפורט לחוקרים בתחום.
שיטות בשימוש
- שימוש במקל איסוף כדי לחלץ זחלים מכלים.
- שימוש במלקטות ניתוח חדות לדיוק.
- קיבוע רקמה על שקופיות מיקרוסקופ לצורך ויזואליזציה.
- הדגמה של טכניקות ניתוח לדיסקי כנפיים, רגליים ועיניים.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של דיסקים אימגינליים מזחלים.
- ויזואליזציה יעילה של תהליכים התפתחותיים לאחר הניתוח.
- הדגמה של חשיבות חדות הכלים בניתוחים.
- הפרוטוקול מספק בסיס למחקר נוסף בביולוגיה התפתחותית.
מסקנות
- טכניקת הניתוח יעילה לבידוד דיסקים אימגינליים.
- שיטות נכונות משפרות את חקר התהליכים ההתפתחותיים בדרוזופילה.
- פרוטוקול זה משמש כמשאב בעל ערך לחוקרים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol provides a foundational method for isolating Drosophila imaginal discs, enabling mechanistic studies of developmental pathways and apoptosis. The technique supports target validation by allowing precise interrogation of gene function in a genetically tractable model system. It enhances predictive confidence in early discovery by facilitating phenotypic screening and pathway analysis relevant to conserved human disease mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of genes and pathways in a living tissue context to support target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a reproducible method for isolating specific tissues to reduce variability in downstream assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates isolated disc preparations suitable for protein expression studies and functional staining to assess compound effects.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation for consistent readouts in apoptosis and developmental process screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by linking genetic perturbations to observable developmental phenotypes in a disease-relevant system.
- Operational Value: Facilitates continuity from gene discovery to functional validation in a genetically manipulable model.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where genetic and phenotypic screening inform target selection and lead identification efforts.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing through tissue-specific protein expression and phenotypic analysis in imaginal discs.
- Screening: Delivers standardized tissue samples for quantitative assessment of developmental processes and compound-induced phenotypes.
- Analytics: Produces isolatable tissues compatible with staining, imaging, and molecular readouts for pathway analysis.
- Translational Research: Connects genetic findings to phenotypic outcomes in a conserved developmental system relevant to human biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue preparation platform for iterative screening and mechanistic studies across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct observation of developmental phenotypes in intact tissues.
- Operational Value: Improves assay reproducibility via standardized dissection and tissue mounting procedures.
- Strategic Value: Reduces false positives in target selection by providing functional validation in a physiological context.
- Portfolio Impact: Supports early go/no-go decisions by clarifying mechanism-of-action and phenotypic relevance.
Implementation Considerations
- Requires proficiency in microsurgical techniques and tissue handling to maintain sample integrity.
- Dependent on sharp dissection tools and clean PBS-based workflows to prevent tissue damage or contamination.
- Necessitates standardization across operators to ensure consistent disc isolation and mounting quality.
- Adaptable to various staining and fixation protocols depending on downstream assay requirements.
- Limited by the small tissue size, which may constrain multiplexed analytical approaches.
