Name: טיהור של המיטוכונדריה מתאי שמרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: למד שיטה מהירה ויעילה לטיהור מיטוכונדריה מ-Saccharomyces cerevisiae באמצעות הומוגניזציה וצנטריפוגציה בגרדיאנט סוכרוז. השיטה מבטיחה בידוד ברמת ניקיון גבוהה תוך שמירה על שלמות מבנית ותפקודית של האורגנלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי CIHR לבין NSERC של קנדה. ויט הוא חוקר חדש CIHR ו קונקורדיה יו&quot;ר אוניברסיטת מחקר Genomics, ביולוגיה של התא והזדקנות.

חומרים ושיטות שמרים זנים ותנאי גידול זן wild-type BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) היה גדל בינוני YEPD עשיר (1% תמצית שמרים, peptone 2%, גלוקוז 2%). היו תאים בתרבית בשעה 30 ° C עם הסיבוב רועד בסל&quot;ד 200 ב צלוחיות Erlenmeyer על יחס &quot;נפח / בינוני נפח בקבוק&quot; של 05:01. בידוד של חלק המיטוכונדריה גולמי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול 1 ליטר של תרבות wild-type BY4742 זן עבור 48 ח </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים התרבות של 500 מ&quot;ל צינורות Nalgene צנטריפוגות. מאזן את העומס ותאי הקציר ידי צנטריפוגה 5 דקות ב 3000 XG בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג תאים pelleted supernatant ו resuspend ב 250 מ&quot;ל של dH2O. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 3000 XG בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג תאים pelleted supernatant ו resuspend ב 250 מ&quot;ל של dH2O. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 3000 XG בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת משקל רטוב של התא גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים pelleted במאגר DTT [2 מ&quot;ל של חיץ / g (משקל רטוב) תאים]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה תא 50 מ&quot;ל פלקון צינורות פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את צינורות ב 70 סל&quot;ד ב שייקר במשך 20 דקות בקצב של 30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 3000 XG בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים pelleted במאגר Zymolyase ללא [7 מ&quot;ל של חיץ / g (משקל רטוב) תאים] Zymolyase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 3000 XG בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים pelleted במאגר Zymolyase ללא [7 מ&quot;ל של חיץ / g (משקל רטוב) תאים] Zymolyase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ההשעיה התא בקבוק זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את אבקת Zymolyase-100T [1 מ&quot;ג של Zymolyase-100T / g (משקל רטוב) תאים] כדי השעיית התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הבקבוק עם ההשעיה התא ב 70 סל&quot;ד ב שייקר למשך 30 דקות בקצב של 30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Spheroplasts העברת שנוצר עקב עיכול של התא הקיר עם Zymolyase-100T ל -50 מ&quot;ל צנטריפוגות צינורות פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה spheroplasts ידי צנטריפוגה 8 דקות ב 2200 XG ב 4 ° C. </li></ol> ** כל הצעדים הבאים צריכים להתבצע על 4 מעלות צלזיוס או על קרח. המתלים של spheroplasts יש לטפל בעדינות באמצעות טפטפות עם טיפים לחתוך כדי למנוע שבירת האברונים .** <ol start="18" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend spheroplasts pelleted במאגר קר כקרח homogenization [6.5 מ&quot;ל של חיץ / g (משקל רטוב) תאים]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה spheroplasts ידי צנטריפוגה 8 דקות ב 2200 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend spheroplasts pelleted במאגר קר כקרח homogenization [6.5 מ&quot;ל של חיץ / g (משקל רטוב) תאים]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים טרום מצוננים על קרח בכוס homogenizer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות העלי הדוק, homogenize התאים על ידי ביצוע משיכות 15 העלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 נפח המאגר קר כקרח homogenization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת spheroplasts הומוגני עד 50 מ&quot;ל צינורות צנטריפוגה מפלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים שלמים, גרעינים, ופסולת רבה על ידי centrifuging דקות 5 XG ב 1500 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant כתוצאה דקות 5 XG ב 3000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant וכתוצאה מכך במשך 15 דקות ב 12000 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant ו resuspend גלולה במאגר קרים כקרח homogenization [6.5 מ&quot;ל של חיץ / g (משקל רטוב) תאים]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דקות 5 XG ב 3000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant וכתוצאה מכך במשך 15 דקות ב 12000 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant ו resuspend גלולה ב 3 מ&quot;ל של חיץ SEM קר כקרח. </li></ol> ** למרות ההשעיה הוא מועשר במיטוכונדריה, הוא מכיל גם אברונים אחרים כגון reticulum endoplasmic (microsomes), Golgi ו vacuoles. כדי לקבל המיטוכונדריה טהור, חלק זה המיטוכונדריה גולמי יכולה להיות נתונה חלוקה נוספת, כמתואר להלן .** טיהור נטול המיטוכונדריה של זיהום על ידי אברונים אחרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.5 מקום מ&quot;ל של 60% קר כקרח (w / v) סוכרוז במאגר EM לתוך צינור Beckman-Ultra Clear צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי 60% (w / v) סוכרוז עם 4 מ&quot;ל של 32%, 1.5 מ&quot;ל של 23%, 1.5 מ&quot;ל של סוכרוז 15% (כל חיץ wt / v ב EM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 3 מ&quot;ל של השבר המיטוכונדריה גולמי SEM חיץ מעל 15% (w / v) סוכרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה של רוטור SW41 Beckman מתנדנד-Ti דלי עבור 1 h ב XG 134,000 (33,000 סל&quot;ד) בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צורת המיטוכונדריה שלם להקה חום בממשק / 60% סוכרוז 32%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות סוכרוז עד שהגיע הלהקה המיטוכונדריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הלהקה המיטוכונדריה בעזרת פיפטה עם טיפ לחתוך ולמקם אותו לתוך צינור צנטריפוגות Beckman עבור רוטור MLS-5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הצינור עם חיץ SEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה המיטוכונדריה טהור על ידי צנטריפוגה של הרוטור MLS-5 למשך 30 דקות בכל XG 10,000 (31,000 סל&quot;ד) למשך 30 דקות 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Supernatant למזוג באמצעותפיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש המיטוכונדריה טהור לניתוח של פונקציות המיטוכונדריה, המיטוכונדריה proteome ו lipidome, ו-DNA המיטוכונדריאלי. </li></ol> ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DTT חוצץ [100 מ&quot;מ Tris/H2SO4 (pH 9.4), 10 mM dithiothreitol] (עבור מ&quot;ל 15) <ul style="list-style-type:none;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.5 מ&quot;ל של חיץ 1 Tris/H2SO4 M (pH 9.4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 150 μl של 1 M DTT </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח עד 15 מ&quot;ל </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Zymolyase חוצץ [20 mM אשלגן זרחתי (pH 7.4), 1.2 מ &#39;סורביטול] (עבור 100 מ&quot;ל) <ul style="list-style-type:none;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מ&quot;ל של 1 חיץ M פוספט אשלגן (pH 7.4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 60 מ&quot;ל של M 2 סורביטול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח עד 100 מ&quot;ל </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ homogenization [10 mM טריס / HCl (pH 7.4), 0.6 מ &#39;סורביטול, 1 mM EDTA, 0.2% (w / v) BSA] (עבור 250 מ&quot;ל] <ul style="list-style-type:none;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.5 מ&quot;ל של טריס 1 M / HCl חיץ (pH 7.4) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 75 מ&quot;ל של M 2 סורביטול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 μl של 500 mM EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 גרם של BSA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח עד 250 מ&quot;ל </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SEM חוצץ [10 mM מגבים / KOH (pH 7.2), סוכרוז 250 מ&quot;מ, 1 mM EDTA] (עבור 250 מ&quot;ל) <ul style="list-style-type:none;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.5 מ&quot;ל של 1 מגבים ז / KOH חיץ (pH 7.2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 31.25 מ&quot;ל של סוכרוז M 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 μl של 500 mM EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח עד 250 מ&quot;ל </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EM חוצץ [10 mM מגבים / KOH (pH 7.2), 1 mM EDTA] (עבור 250 מ&quot;ל) <ul style="list-style-type:none;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.5 מ&quot;ל של 1 מגבים ז / KOH חיץ (pH 7.2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 μl של 500 mM EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח עד 250 מ&quot;ל </li></ul></li></ol>

<ol><li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Biochemistry.</a> , 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2004).</li>
<li>Suen, D. -F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li>
<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &amp, Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Detmer, S. A., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+dysfunctions+of+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).</li>
<li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+more+than+just+a+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: more than just a powerhouse.</a> Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).</li>
<li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+oxidants%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120, 483-495 (2005).</li>
</ol>

לכותבים אין הצהרות על ניגודים.

שיטה זו מאפשרת את הבידוד עתירי יבול של המיטוכונדריה טהור מתאי שמרים. המיטוכונדריה מטוהרים בשיטה זו חופשיים בעיקרו של זיהום על ידי אברונים אחרים ולשמור על השלמות המבנית תפקודית לאחר הטיהור שלהם. השיטה המתוארת התשואות המיטוכונדריה המתאימים הכינון מחדש תאים ללא תהליכי המיטוכונדריה חיוני. המיטוכונדריה אלה טהור מאוד יכול לשמש גם לצורך ניתוח של מבנה ופונקציות המיטוכונדריה, המיטוכונדריה proteome ו lipidome, ו-DNA המיטוכונדריאלי.

טיהור של המיטוכונדריה מתאי שמרים

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

המיטוכונדריה הם האתר העיקרי של ייצור ה-ATP במהלך המטבוליזם האירובי שאינם פוטוסינתטיים התאים האיקריוטים<sup&gt; 1</sup&gt;. אברונים אלה מורכבים לשחק גם תפקידים חיוניים מוות של תאים אפופטוטיים<sup&gt; 2</sup&gt;, התא הישרדות<sup&gt; 3</sup&gt;, יונקים פיתוח<sup&gt; 4</sup&gt; פיתוח, תפקוד עצבי ו<sup&gt; 4</sup&gt;, איתות תאיים<sup&gt; 5</sup&gt;, ואריכות ימים תקנה<sup&gt; 6</sup&gt;. ההבנה שלנו של תהליכים ביולוגיים מורכבים אלה נשלט על ידי המיטוכונדריה מסתמך על שיטות חזקים להערכת המורפולוגיה שלהם, חלבון שלהם הרכב השומנים, על שלמות ה-DNA שלהם, תפקידים חיוניים רבים שלהם. שמרים ניצני<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Eukaryote גנטית ביוכימית unicellular manipulable עם הגנום המבואר ומוגדרת היטב proteome, הוא מודל יקר ערך לחקר המנגנונים המולקולריים שבבסיס ו הסלולר תפקודים ביולוגיים חיוניים של המיטוכונדריה. עבור סוגים אלה של מחקרים, חשוב להיות המיטוכונדריה טהור מאוד. כאן אנו מציגים תיאור מפורט של שיטה מהירה ויעילה לטיהור שמרים המיטוכונדריה. שיטה זו מאפשרת את הבידוד של המיטוכונדריה מאוד טהור, כי הם חופשיים בעיקרו של זיהום על ידי אברונים אחרים ולשמור על השלמות המבנית תפקודית לאחר הטיהור שלהם. המיטוכונדריה מטוהרים בשיטה זו מתאימים הכינון מחדש תאים ללא תהליכי המיטוכונדריה חיוני והוא יכול לשמש לניתוח מבנה ופונקציות המיטוכונדריה, proteome המיטוכונדריה ו lipidome, ו-DNA המיטוכונדריאלי.

אנו מתארים שיטה מהירה ויעילה לטיהור של המיטוכונדריה של השמרים<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. שיטה זו מאפשרת את הבידוד גבוהה תשואה של המיטוכונדריה טהור חופשיים בעיקרו של זיהום על ידי אברונים אחרים ולשמור על השלמות המבנית תפקודית לאחר הטיהור שלהם.

מיטוכונדריה הן האתר המרכזי לייצור ATP במהלך מטבוליזם אירובי בתאים איקריוטיים שאינם פוטוסינתטיים1. אבנים אלו המורכבות ממבנים סבוכים ממלאות גם תפקיד...

פרוטוקול זה מתחיל בהמרת תאי שמרים לספרופלסטים (Sphero plats) על ידי עיכול דופן התא באמצעות simul liase, ולאחר מכן הספרופלסטים עוברים הומוגניזציה באמצעות הומוגניזטור זכוכית-טפלון. ההומוגנאט שמתקבל עובר פעמיים סנטריפוגציה, כדי לשקע תאים שלמים, גרעינים ושאריות גדולות. לאחר מכן, supernatant שמתקבל עובר סנטריפוגציה למשך 15 דקות ב-12,000 Gs כדי לשקע מיטוכונדריה.לבסוף, את פראקציית המיטוכונדריה הגולמית, שעדיין מכילה אברונים אחרים, מעבירים לסבב צנטריפוגה למשך 60 דקות ב-134, 000 Gs במדרג דחיסות של סוכרוז; מיטוכונדריה טהורה, נטולת זיהום מאברונים אחרים, מופקת בממשק שבין סוכרוז בריכוז 60% weight per volume לבין סוכרוז בריכוז 32% weight per volume. שלום, אני ד"ר Christopher Greg מהמעבדה של ד"ר Vladimir tko במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת Concordia. היום אראה לכם כיצד לבודד מיטוכונדריה משמר השמרים *Saccharomyces cerevisiae*.אנו עושים זאת כדי לחקור את הדינמיקה ואת השינויים התלויים בגיל המתרחשים במיטוכונדריה. ככל שהתאים מזדקקים, נבחן שינויים בפרוטאום, בליפידום וב-DNA של המיטוכונדריה. אםًכך, בואו נתחיל.התחילו את הפרוטוקול זה על ידי גידול של זן השמרים בעשרה בקבוקים של 250 מיליליטר. כל אחד מהם יכיל 50 מיליליטר של מדיום YP בטמפרטורה של 30 °C עם ניעור סיבובי למשך 48 שעות. לאחר מכן, שפכו את התרבית למבחנות צנטריפוגה של Nalgene בנפח 500 מיליליטר.קצרו את התאים באמצעות סבב צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-3000 Gs בטמפרטורת החדר, שפכו את הנוזל העליון ותלו את התאים השקועים ב-250 milliliters של מים מזוקקים; סובבו את התאים בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-3000 Gs בטמפרטורת החדר. חזרו על שלב זה, תלו את התאים השקועים ב-250 milliliters של מים מזוקקים וסובבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות.ב-3000 Gs בטמפרטורת החדר, שקלו את משקע התאים הרטוב שהתקבל, ולאחר מכן השעיקו מחדש את התאים המשוקעים בבופר DTT והעבירו את תרחיף התאים לבקרא של 250 מיליליטר. סובבו את הבקרא במהירות של 70 RPMs בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר 20 הדקות, אספו את התאים על ידי צנטריפוגציה למשך חמש דקות ב-3000 Gs בטמפרטורת החדר, השעיקו מחדש את התאים המשוקעים בבופר Xs ללא Xs ובצעו צנטריפוגציה למשך חמש דקות.ב-3000 Gs בטמפרטורת החדר, השעו מחדש את התאים שהשקיעו בבופר Zy ללא Xs והעבירו את תרחיף התאים לבקבוק זכוכית. הוסיפו את אבקת zy liase 100 T לתרחיף התאים וסובבו ב-70 RPMs במנער בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך 30 דקות; ה-Zy liase 100 T יעכל את דפנות התאים ליצירת Sphero plats. יש לבצע את כל השלבים העוקבים לעיכול X שהוצג קודם לכן בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius או על קרח.יש לטפל בתשויי הספלאטים (splats) בעדינות באמצעות פיפטות עם קצוות חתוכים כדי למנוע שבירה של אברונים. עם השלמת עיכול ה-XMO שנמשך 30 דקות, העבירו את ה-Sphero plats למבחנות צנטריפוגה פלסטיות של 50 milliliter וצנטריפוגו למשך שמונה דקות ב-2200 Gs בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס; השביו את הספלאטים שהשקיעו בבופר הומוגניזציה קר מאוד. צנטריפוגו את הספלאטים למשך שמונה דקות ב-2200 Gs בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.יש להשעות מחדש את משקע הספרופלסטים בבופר הומוגניזציה קר על קרח, ולהעביר את התאים להומוגנייזר זכוכית שקולל מראש. באמצעות עלי פסטל הדוקים, יש לבצע הומוגניזציה לתאים על ידי ביצוע 15 תנועות של הפסטל.הוסיפו נפח שווה של תמיפת הומוגניזציה קרה מאוד לדגימות ה-S ההומוגניות, והעבירו אותן למבחנות צנטריפוגה פלסטיות בנפח 50 מיליליטר. צנטריגו את הדגימות ההומוגניות למשך חמש דקות ב-1500 Gs בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי לשקע תאים שלמים, גרעינים ופסולת גדולה. שפכו את העילוי שהתקבל למבחנות חדשות וצנטריגו למשך חמש דקות.ב-3000 Gs בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר סבב צנטריפוגה זה, סנטריפוגה את העלייה שהתקבלה למשך 15 דקות ב-12,000 Gs בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, נקו את העלייה ושחזר את המשקע בבופר הומוגניזציה קר על קרח.סנטריפוגה את המשקע שהושעה למשך חמש דקות ב-3000 Gs בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לבסוף, סנטריפוגה את העלייה שנוצרה למשך 15 דקות ב-12,000 Gs בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. שפוך את העלייה והשעה שוב את המשקע בשלושה מיליליטר של תמיסה קרה בקרח.בופר SEM. תרחיף זה הוא הפракציה המיטוכונדריאלית הגולמית. למרות שהוא מועשר במיטוכונדריה, הוא מכיל גם אבניקים אחרים כגון הרשת האנדופלזמית או מיקרוסומים GOGI ו-VAs כדי להשיג מיטוכונדריה טהורה.הסספנסיה תעבור הפרדה נוספת כפי שמתואר בסעיף הבא. כדי להתחיל בהפרדה של סספנסיית המיטוכונדריה הגולמית לקבלת מיטוכונדריה טהורה, העבירו 1.5 milliliters של 60% weight per volume Sucrose ב-em buffer, קרים לטמפרטורת קרח, לשפופרת צנטריפוגה מסוג Beckman UltraClear.בשלב הבא, הוסף בעדינות מעל ה-60%sucrose ארבעה מיליליטרים של 32%sucrose, 1.5 מיליליטרים של 23%sucrose ו-1.5 מיליליטרים של 15%sucrose, כולם בריכוז משקל לנפח ב-em. Buffer. הנח שלושה מיליליטרים של פראקציית מיטוכונדריה גולמית ב-SEM buffer מעל ה-15%weight per volume. Sucrose. צנטריפוג ברוטור מסוג swinging bucket דגם Beckman SW 41 TI למשך שעה אחת ב-134, 000 Gs או 33, 000 RPMs בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius.לאחר צנטריפוגציה, המיטוכונדריה השלמות יצרו פס חום בממשק שבין 60% ל-32% Sucrose. הסיר בזהירות את הסוכרוז עד להגעה לפס המיטוכונדריאלי באמצעות פיפטה עם קצה חתוך, הוצא את הפס המיטוכונדריאלי והעמדה אותו בתוך מבחנה לצנטריפוגה מסוג Beckman. עבור רוטור MLS five, מלא את המבחנה ב-SEM buffer pellet, השק את המיטוכונדריה הטהורות על ידי צנטריפוגציה ברוטור MLS five ב-10,000 GS או 31,000 RPM למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, ושפוך את העילוי.ניתן להשתמש במיטוכונדריה טהורות אלו כעת לצורך ניתוחים של תפקודי מיטוכונדריה, הפרוטאומיקה המיטוכונדריאלית, הרכב הליפידים ו-DNA מיטוכונדריאלי. הפракציה המיטוכונדריאלית הגולמית בנתיבים השמאליים ומיטוכונדריה שטוהרו על ידי סנטריפוגציה במדרג צפיפות של סוכרוז בנתיבים הימניים הועברו ל-SDS page ואימונו-בלוטינג עם נוגדנים למסמני חלבון של אברונים שונים. נוכחות המיטוכונדריה בשתי ההכנות אוששה על ידי תגובתיות אימונולוגית של PO one P ו-COX one p; אימונו-בלוטינג העיד על נוכחות של DP M1 P, FO 13 p ו-VPS 10 P, המייצגים חלבונים של הרשת האנדופלזמית, המיזוסומים ואפגיי גולג'י בהתאמה, בפракציה המיטוכונדריאלית הגולמית.לעומת זאת, חלבונים מסמנים אלו לא זוהו במיטוכונדריה המופקת, מה שמאשר שהפרוטוקול הניב מיטוכונדריה נקייה מזיהום על ידי אברונים אחרים. כך הראינו לכם כיצד לבודד מיטוכונדריה משמרים מסוג sace visier. רק זכרו, בעת ביצוע ניסוי זה, לא להשאיר את התאים בדגירה ב-zy lies 100 T למשך יותר מחצי שעה, כיוון שאתם מסתכנים בפירוק חלבוני הממברנה או חלבון האברון שעשויים להיות נוכחים בתאים.ייתכן שהדבר נובע מפרוטאזות הנמצאות בריאגנט. כמו כן, כאשר אתם עומדים לבצע בידוד של המיטוכונדריה ומדרג הסוכרוז, ניתן להקפיא את המיטוכונדריה בטמפרטורה של 20- מעלות לפני כן, ולהפשיר אותן לפני שאתם מוכנים לבצע את שלב הסבוב (centrifugation). זהו כל הפרוטוקול.בהצלחה בניסויים שלכם.

purification-of-mitochondria-from-yeast-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זיהום של ההכנות של הריבוזומים אוקריוטים מטוהרים באמצעות שיטות מסורתיות על ידי שיתוף טיהור nucleases ו פרוטאזות משפיע לרעה על ניתוחים ביוכימיים ומבניים במורד הזרם. שיטה מהירה ופשוטה טיהור chromatographic משמש כדי לפתור את הבעיה הזו באמצעות הריבוזומים שמרים כמערכת מודל.

טיהור chromatographic של הריבוזומים שמרים מאוד פעיל

mRNAs רבים קידוד חלבוני המיטוכונדריה משויך הקרום החיצוני מיטוכונדריה. אנו מתארים הליך חלוקה subcellular שמטרתה בידוד של שמרי המיטוכונדריה עם mRNAs הקשורים אליו והריבוזומים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תאים שגודל בתנאים מגוונים במטרה לחשוף את המנגנונים של לוקליזציה mRNA ותרגום מקומי ליד המיטוכונדריה.

בידוד של mRNAs הקשורים למיטוכונדריה שמרים לחקר מנגנונים מקומי תרגום

כאן אנו מציגים פרוטוקול אקספרס, solubilize של לטהר מספר שנאים בוראט האיקריוטים עם הומולוגיה למשפחה טרנספורטר SLC4 בעזרת שמרים. אנו מתארים גם assay cross-linking כימי כדי להעריך את החלבונים homomeric מטוהרים להרכבה multimeric. פרוטוקולים אלה ניתן להתאים חלבונים ממברנה מאתגרים אחרים.

ביטוי Solubilization, טיהור של בוראט האיקריוטים שנאים

הגנום המיטוכונדריאלי של שמרי בייקר מקודד שמונה פוליפפטידים. מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לתייג את כולם ולאחר מכן לדמיין אותם כקצועות נפרדות.

תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב Cerevisiae שמרים של בייקר

למרות ההתקדמות האחרונה, חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים רבים עדיין נשארים עם הפונקציות שלהם לא ידוע לחלוטין. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ואמינה כדי לקבוע את לוקליזציה submitochondrial של חלבונים, אשר היה בסיסי עבור הפיהור של הפונקציות המולקולריות שלהם.

הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae

אנו מציגים פרוטוקול דו-שלבי לבידוד מיטוכונדריה באיכות גבוהה התואם לגילוי וכימות חלבונים בקנה מידה של פרוטאום. הפרוטוקול שלנו אינו דורש הנדסה גנטית ולכן מתאים לחקר מיטוכונדריה מכל תא ורקמות ראשוניים.

בידוד דו-שלבי ללא תגים של מיטוכונדריה לשיפור גילוי וכימות חלבונים

אתרי מגע מיטוכונדריאליים הם קומפלקסים חלבוניים המקיימים אינטראקציה עם חלבוני הממברנה הפנימית והחיצונית של המיטוכונדריה. אתרים אלה חיוניים לתקשורת בין קרומי המיטוכונדריה, ולכן בין הציטוזול לבין המטריצה המיטוכונדריאלית. במאמר זה אנו מתארים שיטה לזיהוי מועמדים המתאימים לסוג מסוים זה של חלבונים.

שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

עבודה זו מסבירה כיצד לשנות מיטוכונדריה של שמרים באמצעות שיטה ביוליסטית. אנו גם מראים כיצד לבחור ולטהר את הטרנספורמנטים וכיצד להציג את המוטציה הרצויה במיקום המטרה בתוך הגנום המיטוכונדריאלי.

טרנספורמציה מיטוכונדריאלית בבייקר

נשימה מיטוכונדריאלית בתאים שלמים של שמרים היא אינדיקטור רב ערך לביו-אנרגטיקה של התאים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות פנוטיפ זה הרלוונטי למיני שמרים שונים.

כימות נשימה מיטוכונדריאלית בתאי שמרים שלמים

שמרי הביקוע Schizosaccharomyces pombe מתגלים כמודל אטרקטיבי לחקר מיטוכונדריה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח השפע וההרכבה של קומפלקסי הנשימה המיטוכונדריאלים ב-S. pombe. זה מאפשר לאפיין את הפונקציות החדשות של גנים שמורים בשרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית.

ניתוח הביטוי והרכבת הקומפלקסים של חלבוני שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית בשמרי הביקוע Schizosaccharomyces pombe

למד שיטה מהירה ויעילה לטיהור מיטוכונדריה מ-Saccharomyces cerevisiae באמצעות הומוגניזציה וצנטריפוגציה בגרדיאנט סוכרוז. השיטה מבטיחה בידוד ברמת ניקיון גבוהה תוך שמירה על שלמות מבנית ותפקודית של האורגנלות.

טיהור של המיטוכונדריה מתאי שמרים

גלה סרטונים נוספים