בדיקה Microfluidic: מבצע ושימוש לעיבוד Surface לוקליזציה
4 ביוני 2009
בסרט זה אנו מציגים את החללית microfluidic 1 (MFP). אנחנו מסבירים בפירוט כיצד להרכיב את MFP, להעלות אותו על גבי מיקרוסקופ הפוכה, וליישר אותה יחסית אל פני השטח את המצע, ולבסוף להראות כיצד להשתמש בו כדי תהליך משטח המצע שקוע פתרון חיץ.
נוהל זה מדגים כיצד להרכיב ולהשתמש בגשש המיקרופלואידי (MFP). הרכיבים המיקרופלואידיים של ה-MFP הם מזרקים אטומים לגז, צינורות נימיים מזכוכית, מחברים מסוג micro tight מבית Upchurch וראש ה-MFP. סרטון זה יציג את השלבים הקריטיים של ההרכבה והכיול.
לאחר ההרכבה, ניתן להשתמש ב-MFP עם מגוון רחב של תשתיות וריאגנטים לצורך תבנית עיבוד ועיבוד של פני השטח. שלום, אני ססיל פרו (Cecil Perot). אני עמית פוסט-דוקטורט במעבדה של דייוויד יאקר (David Yaker) במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת מקגיל במונטריאול, קנדה.
שלום, אני מוחמד קסימי. אני דוקטורנט במעבדה של דייוויד Y במחלקה להנדסה ביו-רפואית, אוניברסיטת מקגיל. שלום, אני דייוויד יוקר.
אני פרופסור לסגל במחלקה להנדסה ביו-רפואית, ואני שמח לברך אתכם היום להדגמה שלנו על הגשושית המיקרופלואידית. היום נראה לכם את הליך ההפעלה והשימוש בגשושית המיקרופלואידית. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו לצורך עיבוד ודפוס של פני שטח.
אם כן, נתחיל בתהליך. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, נעשה שימוש במזרקים ומחטים מפלסטיק למילוי מזרקי זכוכית מסוג gas type בריאגנטים, תוך הבטחה שלא יישארו בועות אוויר. בדרך כלל, נשתמש במזרק של 1 to 10 µL להזרקה ובמזרק בעל נפח הגדול פי 5 עד 10 לשאיבה.
בשלב הבא, באמצעות מחברי nano tight בעלי נפח מת שנמוך, מחברים את המזרקים לצינוריות קפילריות. לאחר מכן ממלאים את הקפילריות ובודקים תחת המיקרוסקופ אם קייות בועות. שבב ה-MFP ממולא מראש בתמיסת בופר כדי למנוע לכידה של בועות בעת חיבור הקפילריות.
לבסוף, מחברים את הנימיים למחבר ה-PDMS בראש ה-MFP המיוצר במיקרו-פבריקציה. כעת, כאשר ה-MFP מורכב, ניתן להתחיל בהגדרתו. את התשתית מכניסים למחזיק מתוצרת ביתית.
הוא מקובע לבמת המיקרוסקופ. המרווח בין ה-MFP לתשתית הוא קריטי לתהליכי דפוס פני שטח. באמצעות תמיכה תלת-נקודתית הנוצרת על ידי ברגי מיקרומטר, ניתן לכוונן את היישור האופקי בדיוק של מיקרומטר.
פעולה זו נחוצה מכיוון שהמצע מעובד על ידי סריקה מתחת ל-MFP. כדי להתחיל בהגדרת ה-MFP, ראש הגשוש מקובע למחזיק הגשוש ומותקן על תחנת הגשוש שמעל מיקרוסקופ הפוך. לאחר מכן, המזרקים מוצבים במשאבות מזרקים בעלות דיוק גבוה.
לאחר מכן, באמצעות זוג גוניומטרים, מכווננים את היישור של משטח ה-MFP ביחס לתשתית על ידי התבוננות בטבעות ניוטון, הידועות גם כפסי התאבכות. אלו מופיעות כאשר ה-MFP מובא למגע עם התשתית; נקודת המגע ותדירות הטבעות משמשות כאינדיקציה לשיפוע. כאשר ה-MFP מיושר ביחס לפני השטח, טבעת התאבכות אחת נפרסת על פני כל השטח.
מדד זה משמש גם לכיול המרווח בין ה-MFP לתשתית. כעת, כאשר ה-MFP מוגדר, אנו מוכנים לעבור לתפעולו. במהלך תפעול ה-MFP, הדיספנסינג נשלט באמצעות תוכנת LabVIEW.
תפעול המכשיר מבוצע באמצעות תצפית ויזואלית ובאמצעות מצלמת CCD. לפני תחילת השאיבה עצמה, יש להזריק מעט נוזל כדי לוודא שמזרק השאיבה מכוון כראוי ושאין בתוכו בועות. לאחר מכן, טבל את ה-MFP בבופר.
כעת ניתן להתחיל בהזרקת הנוזל תוך ניטור של כלילת זרימת החרוצים. יחס ההזרקה-שאיבה משתנה בין 1:3 ל-1:10, בהתאם לדיפוזיות של הריאגנט בבופר מקיף ולתבנית הזרימה הגאומטרית הרצויה. לבסוף, ניתן כעת להשתמש בחרב למגוון יישומים.
הדפוסים השטחיים המוצגים כאן הושגו באמצעות MFP עם biotin המסומן ב-fluorescein על strep divide, ושקופיות זכוכית של hydrogel מצופות ב-ENC. קצב זרימת ההזרקה היה 1 nanoliter לשנייה, וקצב זרימת השאיבה היה 10 nanoliters לשנייה תוך שימוש במזרקים של 10 microliter ו-50 microliter בהתאמה. המרווח בין השטח לבין הפרובה היה 5 micrometers.
ניתן להשתמש ב-MFP גם לצביעה מקומית ועיבוד של תאים ורקמות. כליאת הזרימה מונעת דיפוזיה של הרכיב הכימי ומאפשרת צביעה כימית מדויקת של תאים. כפי שמוצג כאן, שכבה אחת (monolayer) של תאי פיברובלסט נצבעה ב-100 micrograms per milliliter של dai.
הראינו לכם כיצד להפעיל את הפרובה המיקרופלואידית. בעת ביצוע פרוצדורה זו, עליכם לוודא שאין בועות במערכת ושפני הפרובה המיקרופלואידית מקבילים לתשתית. זהו כל התהליך.
תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים את ההרכבה והשימוש בגשש המיקרופלואידי (MFP). הוא סוקר את השלבים הקריטיים ליישור ה-MFP עם מיקרוסקופ הפוך ועיבוד משטחי מצע טבולים בתמיסת בופר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרופלואידיקה
- הנדסה ביומדיקלית
- עיבוד שטח
רקע
- ה-MFP מורכב ממזרקים אטומים לגז, צינוריות קפילריות מזכוכית ומחברים מסוג micro-tight.
- הוא מתוכנן עבור מגוון שלמצעים ומגיבים.
- הרכבה וכיול נכונים הם קריטיים לשימוש יעיל.
- ה-MFP יכול לסייע ביצירת תבניות ובעיבוד של פני השטח.
מטרת המחקר
- מתן מדריך מפורט להרכבת ה-MFP.
- הדגמת יישור ה-MFP עם מיקרוסקופ.
- הצגת יישום ה-MFP בעיבוד תשתית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרכבת רכיבי ה-MFP.
- התקנת ה-MFP על מיקרוסקופ הפוך.
- כיול מיקום ה-MFP ביחס לפני השטח של התשתית.
- עיבוד פני תשתית בתמיסת בופר.
תוצאות עיקריות
- ניתן להרכיב ולכייל את ה-MFP ביעילות.
- המערכת מאפשרת עיבוד רב-גוני של מצעים שונים.
- הודגמו טכניקות מוצלחות ליצירת תבניות על פני השטח.
- הודגשה חשיבותו של כיול מדויק להשגת תוצאות אופטימליות.
מסקנות
- ה-MFP הוא כלי בעל ערך עבור חוקרים בהנדסה ביו-במדיקלית.
- הרכבה וכיול נכונים חיוניים לתפקודו.
- סרטון זה משמש כמדריך מקיף לשימוש ב-MFP.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הגשוש המיקרופלואידי מאפשר הזרקה מדויקת וממוקמת של ריאגנטים לעיבוד פני שטח ללא צורך בערוצים מיקרופלואידיים סגורים, ובכך תומך בפיתוח בדיקות (assays) הניתנות להרחבה ולשחזור. יכולת זו משפרת את תיקוף המטרה (target validation) ואת הסריקה הפנוטיפית על ידי יצירת סביבות מיקרו מבוקרות לאינטראקציות תאיות ומולקולריות. היא מספקת פלטפורמה לשימוש חוזר עבור תבניות פני שטח ברזולוציה גבוהה, ובכך מפחיתה את צריכת הריאגנטים ומשפרת את תפוקת הניסויים בזרימות עבודה של שלבי גילוי מוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות השקעה ממוקמת של ריאגנטים על תשתיות.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הגבלת מיקרו-ג'טים לאזורי שטח ספציפיים ליצירת תבניות מולקולריות מדויקות.
- ערך ניבוי: מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי מתן אפשרות להספקה מבוקרת של ליגנדים או מעכבים לאזורים מוגדרים.
סקר ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקה המשכית באמצעות שינוי פני שטח מקומי.
- ערך תפעולי: שיפור הסטנדרטיזציה והשחזור של הבדיקה באמצעות כלילה מדויקת של הזרימה ויכולת סריקה.
- قابליות הרחבה: מאפשר מוכנות לסריקה על פני שטחי מצע גדולים על ידי סריקת הגשושית, ותומך בשימוש חוזר בפלטפורמה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תומך במערכות רלוונטיות למחלה על ידי אפשור צביעה מקומית ועיבוד של תאים ורקמות.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר צביעה כימית מדויקת של תאים, כגון שכבות מונושכבה של פיברובלסטים, להערכת מעורבות המטרה.
- ביטחון ניבוי: מספק בקרה כמותית על אספקת הריאגנטים, ובכך משפר את האמינות של תוצאי קריאה פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
הגשוש המיקרופלואידי משתלב ברצף הגילוי, החל מאימות מטרות מוקדם, דרך פיתוח בדיקות ועד לסריקה פרה-קלינית, ותומך במחזורי תכנון ובדיקה איטרטיביים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות הזרקה מקומית של ריאגנטים על תסבסטים.
- סקר (Screening): מאפשרת מוכנות לבדיקה באמצעות כליאה של מיקרו-ג'ט הניתנת לשחזור וסריקה על פני שטח.
- אנליטיקה: מספקת פלטיים כמותיים כגון בקרת קצב זרימה ותבניות מרחביות לצורך ניתוח תנאים השוואתיים.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרציפות פרה-קלינית באמצעות עיבוד מקומי של תאים ורקמות בתנאים של בופר.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה לשימוש חוזר עבור תסבסטים וריאגנטים מרובים, ובכך מפחיתה את הצורך בשבבי מיקרופלואידיקה לשימוש חד-פעמי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי, תיקוף מטרה, והפחתת עמימות מכניסטית במדידות המבוססות על פני השטח.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של עיבוד פני שטח מקומי.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטאות משופרת לגבי המשכיות הפרויקט (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות הפחתת סיכונים מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף והחלטות קידום מותאמות לסיכון, המבוססות על הובלה מולקולרית מרחבית מדויקת.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהרכבה מיקרופלואידית, כיוון מיקרוסקופי ותפעול של משאבת מזרקים.
- תלוי במזרקים אטומים לגז, קפילרות זכוכית, מחברים מסוג micro-tight ומיקרוסקופ הפוך עם ויזואליזציה ב-CCD.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור כיוון הגששים, בקרת קצב זרימה וטיפול בנוזלים ללא בועות.
- כולל שיקולי התאמה לסוגי מצעים שונים, כולל שקף זכוכית עם הידרוג'ל ומשטחים מצופים בתאים.
- מוגבל על ידי הצורך בבקרת מרווח מדויקת (למשל, 5 micrometers) וכיוון באמצעות טבעות ניוטון כדי להבטיח כליאת הזרימה.
