Name: קבלת מטוהרים Toxoplasma gondii שביצים ידי Gradient כלוריד רציפה וצזיום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: למד שיטה לטיהור שביצי Toxoplasma gondii מצואת חתולים באמצעות מדרגת כלוריד צזיום. הפרוטוקול מספק שביצים מטוהרות לניסויים במיקרוביולוגיה וביולוגיה מולקולרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות ניקול ברינקמן ומיכאל ור לבדיקה טכנית של כתב היד ואת ד&quot;ר אבו סייד ולינדה Ransick לקבלת תמיכה טכנית ומנהלית. ארצות הברית הסוכנות להגנת הסביבה באמצעות משרד של מחקר ופיתוח במימון חלקי שיתפו פעולה במחקר המתואר כאן תחת חוזה מספר EP-D-06-096 כדי Dynamac, Inc הסכם interagency מספר DW-12-92289801-0 ל משרד החקלאות. זה כבר נתון לביקורת הסוכנות ואושר לפרסום. אזכור של שמות מסחריים או מוצרים מסחריים אינו מהווה המלצה או המלצה לשימוש. MJS הכתובת הנוכחית: Dynamac, Inc בסינסינטי, אוהיו.

<p class="jove_title"&gt; 1. כללי בטיחות זהירות כאשר עובדים עם<em&gt; ט gondii</em&gt; שביצים</p&gt;<ol&gt;<li&gt; חשוב לעקוב אחרי כל אמצעי בטיחות כאשר עובדים עם<em&gt; ט gondii</em&gt; שביצים. אצל אנשים בריאים ביותר,<em&gt; ט gondii</emזיהום&gt; נשלט בקלות על ידי המערכת החיסונית, אך חיים ארוכים תוצאות זיהום. אנשים immunocompromised רגישים במיוחד טוקסופלזמוזיס ולא צריך לטפל<em&gt; ט gondii</em&gt; שביצים. נשים בהריון צריכות גם לא לטפל<em&gt; ט gondii</em&gt; שביצים, כי הזיהום עלול לגרום למומים מולדים חמורים<sup&gt; 8</sup&gt;.</li&gt;<li<em&gt; ט gondii</em&gt; שביצים צריך רק להיות מטופלים בשטח המיועד עם צוות מיומן. סימנים המעידים<em&gt; ט gondii</em&gt; עבודה oocyst מתבצעת חייב להתפרסם כדי להתריע אחרים להיכנס אל תוך השטח המיועד.</li&gt;<li&gt; ללבוש מתאים ציוד מגן אישי (PPE) כגון חלוק מעבדה, חלוק חד פעמי, כפפות חד פעמיות, והגנה עין תקין או מגן פנים בעת הטיפול<em&gt; ט gondii</em&gt; שביצים.</li&gt;<li&gt; שינויים תכופים כפפה מומלץ. לא להתמודד עם כל ציוד מעבדה עם<em&gt; ט gondii</em&gt; Oocyst מזוהמים כפפות.</li&gt;<li&gt; השתמש תמיד מגשי מתכת מצופה autoclavable ספינות סופג חד פעמי כאשר עובדים עם<em&gt; ט gondii</em&gt; שביצים. ודאו כי כל המדפים, צינורות, וכו &#39;משמש הן חד פעמיות או autoclavable.</li&gt;<li&gt; כל<em&gt; ט gondii</emפסולת&gt; יש autoclaved פעמיים במשך שעה אחת לפחות.</li&gt;<li&gt; כל הציוד הלא מתכלה (מתלים, מגשים וכו &#39;) חייב להיות גם autoclaved פעמיים במשך שעה אחת לפחות.</li&gt;<li&gt; קווי אבק רגיל לשאוב נוזלים צריך להיות מחובר ™ Vacushield לסנן על מנת למנוע זיהום של משאבת ואקום.</li&gt;<li&gt; כל מעבדה מושפע הספסל צמרות יש לחטא לאחר שסיים לעבוד עם<em&gt; ט gondii</em&gt; שביצים. Hypochlorite 10% עשו טרי צריך להיות מיושם בנדיבות על אזור העבודה ואפשרו יבש. האזור לאחר מכן יש לשטוף היטב עם מים.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 2. הכנת מאגרים ופתרונות</p&gt;<ol&gt;<li&gt; הכן 1 2.2 L M פתרון של סוכרוז על ידי המסת 752.66 גרם של סוכרוז ב 600 מ&quot;ל DDH<sub&gt; 2</sub&gt; א &#39; מערבבים ומחממים בעדינות בעזרת צלחת ומערבבים מחומם לפזר את סוכרוז. לאחר נמס לגמרי, להביא נפח L 1 עם DDH<sub&gt; 2</sub&gt; א &#39; זו צריכה להיות מלווה על ידי עיקור מעוקר הפתרון לפחות 20 דקות.</li&gt;<li&gt; הכן TE 1L חיץ (50 mM טריס-HCl, 10 mM EDTA), pH 7.2 ידי הוספת 6.05 גרם של טריס-HCl ו 3.7 גרם של EDTA ב 700 מ&quot;ל של DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O, כדי להתאים את ה-pH 7.2 אז להביא נפח L 1 עם DDH<sub&gt; 2</sub&gt; א &#39;</li&gt;<li&gt; עבור השיפוע CsCl, להכין מלאי של פתרון CsCl בחומרה ספציפית של 1.15 (1.15-CsCl) על ידי הוספת 21.75 גרם CsCl עם 103.25 מ&quot;ל של הצפת TE. פתרון, לערבב 30 מ&quot;ל של TE עם 20 מ&quot;ל של 1.15-CsCl. פתרון ב &#39;, לערבב 20 מ&quot;ל של TE עם 30 מ&quot;ל של 1.15-ו 12.5 CsCl μl של פתרון פנול אדום. פתרון C, לערבב 10 מ&quot;ל של TE עם 40 מ&quot;ל של 1.15-CsCl (טבלה 1).</li&gt;<li&gt; הכן פתרון 1 ליטר 1 N של סודיום הידרוקסיד (NaOH) על ידי המסת 40 גרם של NaOH, ב 800 מ&quot;ל של DDH<sub&gt; 2</sub&gt; א &#39; מומס פעם, להביא נפח L 1 עם DDH<sub&gt; 2</sub&gt; א &#39;</li&gt;<li&gt; הכן פתרון 1 ל 2% (לפי נפח) של H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; ערבוב 20 מ&quot;ל של H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; עם 980 מ&quot;ל של DDH<sub&gt; 2</sub&gt; א &#39;</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 3. סוכרוז לצוף</p&gt;<ol&gt;<li&gt; הוסף 10 מ&quot;ל של השעיה של צואה<em&gt; ט gondii</em&gt; שביצים, ב 2% H<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt;, לתוך צינור מ&quot;ל 50 צנטריפוגות חרוטי. יש לציין כי ההשעיה צואה מתייחס דוגמאות, כי כבר מראש מעובד באמצעות הליך הנפקה סוכרוז כפי שתואר קודם לכן<sup&gt; 8</sup&gt;. כאשר דגימות צואה נקצרים בתחילה מן החתולים הנגועים הם מעובדים באמצעות לצוף סוכרוז כפי שתואר התייחסות 8. זה לצוף סוכרוז נוסף יש צורך לצמצם עוד יותר פסולת צואה נישא מעל לתהליך טיהור CsCl ולקבל הטהור<em&gt; ט gondii</em&gt; שביצים אפשרי.</li&gt;<li&gt; לנטרל את H 2%<sub&gt; 2</sub&gt; SO<sub&gt; 4</sub&gt; על ידי הוספת 6 מ&quot;ל (3 / 5 כרכים) של 1 N NaOH על ההשעיה צואה. מערבבים היטב על ידי vortexing.</li&gt;<li&gt; הוסף נפח זהה (16 מ&quot;ל) של סוכרוז 2.2 M יצירת הריכוז הסופי של M 1.1 על ההשעיה צואה ומערבבים היטב על ידי vortexing.</li&gt;<li&gt; בזהירות כיסוי סוכרוז / השעיה צואה עם 10 מ&quot;ל DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O בעזרת פיפטה 10 מ&quot;ל. צנטריפוגה ההשעיה XG ב 1200 עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר עם הבלם לא.</li&gt;<li&gt; לאסוף בזהירות את המים מעל שכבות שלבי הביניים והעברת צינור חדש מ&quot;ל 50 צנטריפוגות חרוטי ידי pipetting מממשק האוויר המים בלי מתערבל פיפטה. חשוב למזער שריד סוכרוז תוך איסוף שכבת שלבי הביניים.</li&gt;<li&gt; מערבבים את שאר סוכרוז / צואה פתרון גלולה ידי vortexing את הצינורית.</li&gt;<liחזור&gt; צעדים 3.4 ו 3.5.</li&gt;<li&gt; הביאו את עוצמת הקול של שני הפתרונות שלבי הביניים oocyst ל 50 מ&quot;ל עם DDH<sub&gt; 2</sub&gt; O ו צנטריפוגות צינורות XG ב 2000 במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li&gt;<li&gt; לשאוב supernatant מהצינור כל כדורי resuspend עם חיץ TE 5 מ&quot;ל ו - הבריכה ההשעיה oocyst יחד. נפח ונקווה הכולל צריך להיות 10 מ&quot;ל.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 4. CsCl שיפוע</p&gt;<ol&gt;<li&gt; הכן שיפוע CsCl רציפה בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל באוקרידג&#39; פוליקרבונט ידי בקפידה underlaying כל שכבה באמצעות מזרק 50 מ&quot;ל עם מד 18 קהה הסתיים, autoclavable, מחט פלדה, זין דרך לעצור 2. הערה: פנול אדום הוא הוסיף B פתרון להבחין בקלות בין שכבות צבע (לוח 1).</li&gt;<li&gt; לאט לאט להוסיף את הפתרונות הבאים אל הצינור כדי המפורטים להלן. יצוין כי קצב הזרימה לא יעלה יותר מ 0.5 מ&quot;ל / sec.<ol&gt;<li&gt; 10 מ&quot;ל של מדגם TE / oocyst ההשעיה</li&gt;<li&gt; 8 מ&quot;ל פתרון</li&gt;<li&gt; 8 מ&quot;ל פתרון B</li&gt;<li&gt; 8 מ&quot;ל פתרון C</li&gt;</ol&gt;</li&gt;<li&gt; צנטריפוגה הצינור באוק רידג&#39; בשעה XG 12,000 עבור 60 דקות ב 4 ° C עם הבלם לא. השימוש הרוטור זווית קבועה מקובל, אבל במהירות גבוהה מתנדנד תוצאות דלי בהפרדה טובה יותר של שביצים מן המדגם ההשעיה עם מינימלי מריחות פסולת צואה לאורך הצד או את הצינורית. היקף כתמי תלוי בהרכב ההשעיה צואה ועל כן עשוי להיות נחוץ כדי לבצע שתי gradients CsCl אם ההשעיה צואה מלוכלך מאוד.</li&gt;<li&gt; בעקבות צנטריפוגה, ולאסוף את הלהקה אטום / לבן oocyst המכיל בין פתרונות A ו-B כדי למזער זיהום בפסולת צואה, לעבור ישירות הלהקה oocyst מבלי להפריע שיפוע לאסוף את שלבי הביניים oocyst בעזרת פיפטה 10 מ&quot;ל. מעבירים את שלבי הביניים oocyst אל צינור חדש מ&quot;ל 50 צנטריפוגות חרוטי. נסו לצמצם את כמות פתרון CsCl aspirated תוך איסוף oocyst שלבי הביניים מכיוון שהוא עלול להוות בעיה pelleting שביצים במהלך שלב ההדחה.</li&gt;<li&gt; לשטוף שביצים עם 30-40 מ&quot;ל של DDH<sub&gt; 2</sub&gt; א &#39; צנטריפוגה התחתית XG 2000 בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות עם הבלם לא. בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע גלולה oocyst. חזור על לשטוף 2 פעמים נוספות.</li&gt;<li&gt; בסוף לשטוף הסופי, בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend את הכדור בתוך חומצה גופרתית 10 מ&quot;ל 2% ולאחסן ב 4 ° C עד השימוש. שביצים מוכנים כעת עבור מניפולציה נוספת. טוהר Oocyst ניתן לבדוק במיקרוסקופ על ידי בהעדר פסולת צואה במדגם.</li&gt;</ol

<ol><li>Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+viable+Toxoplasma+gondii+in+beef%2C+chicken%2C+and+pork+from+retail+meat+stores+in+the+United+States%3A+risk+assessment+to+consumers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Prevalence of viable Toxoplasma gondii in beef, chicken, and pork from retail meat stores in the United States: risk assessment to consumers.</a> J. Parasitol. 91, 1082-1093 (2005).</li>
<li>Tenter, A. M., Heckeroth, A. R., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+from+animals+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: from animals to humans.</a> Int. J. Parasitol. 30, 1217-1258 (2000).</li>
<li>Bowie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+toxoplasmosis+associated+with+municipal+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Outbreak of toxoplasmosis associated with municipal drinking water.</a> Lancet. 350, 173-177 (1997).</li>
<li>Moura, L. de <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+toxoplasmosis%2C+Brazil%2C+from+field+to+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Waterborne toxoplasmosis, Brazil, from field to gene.</a> Emerg. Infect. Dis. 12, 326-329 (2006).</li>
<li>Jones, J. L., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+toxoplasmosis+-+Recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Waterborne toxoplasmosis - Recent developments.</a> Exp. Parasitol. doi: 10.1016/j.exppara.2009.03.013, (2009).</li>
<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+detect+Toxoplasma+gondii+oocysts+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">How to detect Toxoplasma gondii oocysts in environmental samples.</a> FEMS Microbiol. Rev. 27, 651-661 (2003).</li>
<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Toxoplasma+gondii+oocysts+by+cesium+chloride+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of Toxoplasma gondii oocysts by cesium chloride gradient.</a> J. Microbiol. Methods. 56, 427-4230 (2004).</li>
<li>Dubey, J. P. Toxoplasmosis of Animals and Man. , 2nd Edition, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL. (2009).</li>
</ol>

קבלת מטוהרים toxoplasma gondii שביצים ידי gradient כלוריד רציפה וצזיום

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii הוא הפתוגן לחייב protozoan תאיים כי בדרך כלל מדביק בני אדם. זהו apicomplexan מאופיין היטב הקשורים בגרימת מזון ומים נישאים להתפרצות מחלות. המארח הוא סופי מינים של חתולים היכן שכפול מינית מתרחשת וכתוצאה מכך להתפתחות oocyst מדבקת מאוד עמיד לסביבה. ההדבקה מתרחשת באמצעות בליעה של ציסטות רקמה בשר או שביצים מזוהם מן האדמה או מים. הזיהום הוא בדרך כלל ללא תסמינים אצל אנשים בריאים, אבל התוצאה היא זיהום לאורך החיים סמוי כי ניתן להפעיל מחדש את דלקת קרום המוח ולגרום למוות toxoplasmic ואם הפרט הופך immunocompromised. בשר מזוהם עם ט &#39; ציסטות gondii היו המקור העיקרי לזיהום באירופה וארצות הברית, אבל השינויים האחרונים בהנהלת חיה ושיטות חקלאות וטיפול מזון משופר ונהלים עיבוד צמצמו משמעותית את שכיחות ט gondii ציסטות 1 בשר, 2. עם זאת, seroprevalence בבני אדם נותר גבוה יחסית שמראה כי חשיפה מהקרקע מים מזוהמים oocyst או סביר. ואכן, התפרצויות waterborne של טוקסופלזמוזיס דווחו ברחבי העולם התומכים בתיאוריה חשיפה לטופס oocyst הסביבה מהווה סיכון בריאותי משמעותי 3-5. מחקר כה, על הבנה השכיחות של ט &#39; שביצים gondii במים ואיכות הסביבה מוגבלים בשל העדר של כלים לגילוי שביצים בסביבה 5, 6. זה בעיקר בשל היעדר פרוטוקולים טיהור יעיל להשגת מספר גדול של מטוהרים מאוד T שביצים gondii מחתולים נגועים למטרות מחקר. מחקר זה מתאר את התפתחות שיטת CsCl שונה בקלות מטהר ט gondii שביצים מצואה של חתולים נגועים המתאימים ביולוגית מולקולרית בתרבית רקמה מניפולציה 7.

מחקר זה מתאר את התפתחות שיטת CsCl שונה בקלות מטהר ט שביצים gondii מצואה של חתולים נגועים המתאימים ביולוגית מולקולרית תרבות מניפולציה רקמה

קבלת מטוהרים Toxoplasma gondii שביצים ידי Gradient כלוריד רציפה וצזיום

*Toxoplasma gondii* הוא פתוגן פרוטוזואי תוך-תאי מחייב המדביק בני אדם באופן נפוץ. זהו אפקומפלקסאן (apicomplexan) מאופיין הידוע כקשור ל...

Oocysts של *Toxoplasma gondii* מופקות בדרך כלל מצואה של חתולים נגועים ומבודלות באמצעות הליך ציפה, שתוצאתו היא תרחיף מטהר חלקית, לשימוש בניסויי תרביות רקמה ומולקולריים. עם זאת, ניסויים בטפיל זה דורשים oocysts בדרגת טהרה גבוהה כדי להשיג זאת. ה-oocysts מטהרות עוד יותר באמצעות שלב ציפה בסוכרוז, שבו ה-oocysts מושחייה מחדש, מעליהם מושכבת שכבת סוכרוז ומים, ולאחר מכן מתבצעת סרינגציה כדי להפריד את ה-oocysts ממרבית תוצרי הצואה.לאחר מכן מעבירים את שכבת ה-osis למבחנה חדשה המכילה cesium chloride ומסבבים אותה בצנטריפוגה. את פס OSIS המובחן שמתקבל אוספים ושוטפים, כך שיהיה מוכן לשימוש בניסויים הדורשים teon io assist מטהר מאוד. שלום, אני ד"ר שרה סטאגס, עובדת ב-Dynam, קבלנית של המעבדה הלאומית לחקר חשיפה של סוכנות הגנת הסביבה של ארה"ב.היום נדגים לכם הליך לטיהור של Toxoplasma gondii oocysts מצואה של חתולי מעבדה נגועים, באמצעות מדרג ריכוזים לא רציף של צסיום כלוריד. הליך זה נמצא בשימוש שוטף במעבדתנו לבידוד oocysts, לצורך שימוש בניסויי ביולוגיה מולקולרית ותרביות רקמה. אז בואו נתחיל.לפני תחילת כל עבודה עם TG O Osis, יש להביא בחשבון שיקולי בטיחות חשובים. אנשים עם מערכת חיסון מוחלשת, נשים בהריון או נשים המנסות להרות לא צריכות לטפל בפתוגן בשל הסיכון להידבקות בטוקסופלזמוזיס, העלולה לגרום למחלה ולמומים מולדים חמורים. כדי להפחית את הסיכון לזיהום, הקצו מרחב ייעודי להליך זה והציבו שלטים כדי להזהיר אחרים לפני כניסתם לחדר.זכרו ללבוש חלוק מעבדה, גלימה חד-פעמית, כפפות חד-פעמיות והגנה מתאימה על העיניים או מגן פנים בעת טיפול בציסטות של T-One IO. הקפידו להחליף כפפות לעיתים קרובות והימנעו מנגיעה בכל ציוד עם כפפות מזוהמות. חשוב גם לעבוד על מגשים מתכתיים הניתנים לסטריליזציה באוטוקלבה, המרופדים בניירות ספיגה חד-פעמיים.ובהקשר זה, הקדישו דקה כדי לוודא שכל רמולי המבחנות, המבחנות וציודים אחרים שאתם מתכננים להשתמש בהם הם חד-פעמיים או ניתנים לעקרה באוטוקלאב. אם אתם משתמשים בפריטים שאינם חד-פעמיים, הקפידו לעקר אותם באוטוקלאב לאחר השימוש בשני מחזורים של שעה אחת כל אחד. כמו כן, מומלץ לחבר את כל קווי הוואקום למסנן הגנה לוואקום כדי למנוע זיהום של משאבת הוואקום.בסיום בידוד הציסטות, יהיה עליך להחיל תמיסת היפוכלוריט 10% רעננה על משטח העבודה. המתן לייבוש ולאחר מכן שטוף את האזור מספר פעמים במים. לאחר שננקטו אמצעי הבטיחות המתאימים, תוכל להמשיך בניסויים שלך.לפני איסוף ה-T Guni OYS, יש להכין תחילה את כל התמיסות הדרושות עבור הגרדיאנט של הסוכרוז, הציפה והצסיום כלוריד. שלבי סנטריפוגציה. התמיסות הדרושות כוללות תמיסת סוכרוז 2.2 molar שע经过ה סטריליזציה במחזור של 20 דקות באוטוקלאב, ליטר אחד של TE buffer pH 7.2, תמיסת נתרן הידרוקסיד 1 normal, תמיסת חומצה גופרית 2% ותמיסת אם של Caesium chloride עם משקל סגולי של 1.15.תמיסת המלאי של Caesium chloride בריכוז 1.15 תשמש להכנת תמיסות A, B ו-C, אשר ישמשו להכנת מדרג ה-cesium chloride. תמיסה A מכינים על ידי ערבוב של 30 milliliters של TE עם 20 milliliters של תמיסת מלאי של 1.15 cesium chloride. תמיסה B מכינים על ידי ערבוב של 20 milliliters של TE עם 30 milliliters של תמיסת מלאי של 1.15 cesium chloride, ולאחר מכן הוספה של 12.5 microliters של תמיסת pheno red. לבסוף, תמיסה C מכינים על ידי ערבוב של 10 milliliters של TE עם 40 milliliters של תמיסת 1.15 cesium chloride.נתחיל בהכנת ציפת הסוכרוז על ידי נטילת 10 milliliters של תרחיף צואה של T osis ב-2% sulfuric acid והעברתו לשפופרת צנטריפוגה קונוית של 50 milliliters. מקור חומר הצואה הוא מצואה של חתולים נגועים שעברה כבר עיבוד באמצעות הליך ציפת סוכרוז שתואר בעבר בספר שכתב ד"ר JP Duby, שכותרתו Toxoplasmosis of Animals and Humans. שלב נוסף זה מפחית עוד יותר את כמות השאריות הצואתיות בתהליך הניקוי ב-cesium chloride ומסייע בהשגת רמת הניקיון הגבוהה ביותר של ציסטות T goi.לאחר מכן, ננטרל את חומצה הגופרית על ידי הוספת נפח של שלושה חמישיים מתמיסת נתרן הידרוקסיד בריכוז 1N לסספנסיון הצואה. נערבב היטב את הסספנסיון באמצעות וורטקס. לאחר מכן, נוסיף נפח שווה של סוכרוז ונערבב שוב היטב את הסספנסיון באמצעות וורטקס.באמצעות פיפט של 10 מיליליטר, כסו בזהירות את תגלי התוצאות של ת сусפנסיאת הצואה בסוכרוז ב-10 מיליליטר של מים מזוקקים פעמיים. עם סיום הפעולה, הניחו בזהירות את המבחנות בצנטריפוגה וסובבו אותן ב-1200 ×g למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ללא הפסקה לאחר הסבוב. תוך הקפדה על אי-שאיבת יתר של הנפח בפיפט, שאבו בעדינות בפיפט מהממשק שבין האוויר למים כדי לאסוף את שכבת המים העליונה ואת שכבת הממשק.חשוב מאוד לנסות לצמצם ככל האפשר את כמות שכבת הסוכרוז שעוברת בעת איסוף שכבת הממשק. העבירו שכבות אלו לפרוטוקול של מבחנת צנטריפוגה קונית חדשה בנפח 50 milliliters. ערבלו את המבחנה באמצעות Vortex כדי לערבב את תמיסת משקע הצואה בסוכרוז שנותרה.חזור על שלבי הצנטריפוגציה עם שכבת המים העליונה פעם נוספת. לאחר הסבוב, אסוף את שכבת המים העליונה ואת שכבת הממשק והעבר אותן למבחנה חדשה. השתמש במים מזוקקים פעמיים כדי להביא את הנפח של שני תמיסות ממשק ה-oh oh cyst ל-50 milliliters.לאחר מכן, סבבו את המבחנות בצנטריפוגה ב-2000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, שאבו את ה-S supernatant מכל מבחנה. השביו את המשקעים ב-5 milliliters של tea buffer וסננו את תרחיפי ה-osis.ה-osis מוכנים כעת לשלב של מדרג צסיום כלוריד. נתחיל בהכנת מדרג צסיום כלוריד לא רציף בתוך מבחנה פוליקרבונטית של Oak ridge בנפח 50 מיליליטר. העבירו למבחנה הפוליקרבונטית 10 מיליליטר של התמיה המכילה TE ו-osis, באמצעות מזרק 50 מיליליטר עם מחט פלדה סטריליזבלית בעלת קצה קהה במידה 18.באמצעות ברז דו-כיווני, הוסיפו לאט את התמיסות הבאות ישירות לתחתית המבחנה: 8 mL של תמיסה A, 8 mL של תמיסה B ו-8 mL של תמיסה C. ודאו שקצב הזרימה אינו עולה על 0.5 mL לשנייה. חשוב לציין כי ה-phenol red בתמיסה B מסייע בהבחנה בין שכבות המדרג.כעת ניתן לצנטריפוז את מבחורת ה-Oak ridge במהירות של 12,000 ×g למשך 60 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ללא הפסקה, באמצעות רוטור בעל זווית קבועה ומהירות גבוהה. עם סיום הצנטריפוגה, נאסוף את הפס הלבן העמום שנמצא בין תמיסות A ו-B. פס זה מכיל את ה-oocytes. באמצעות פיפט של 10 מיליליטר, יש לגשת ישירות אל פס ה-oocytes מבלי להפר את הגרדיאנט ולאסוף את ה-oocytes.נסו לצמצם את כמות תמיסת caesium chloride שאתם שואבים בעת איסוף הציסטה, מכיוון שעודף של caesium chloride עלול להקשות על השקיעה של הציסטות במהלך השטיפה. בשלב הבא, העבירו את ה-OSIS למבחנה קונית חדשה של 50 milliliter לצנטריפוגה. כעת שטפו את הציסטות עם 30 עד 40 milliliters של מים מזוקקים פעמיים, ולאחר מכן צנטריפיקו את המבחנה ב-2000 times G בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות ללא הפסקה; שאבו בזהירות את ה-SUP natant תוך הקפדה לא להפריע למשקע של הציסטות.חזור על השטיפה פעמיים נוספות. לאחר סיום השטיפות האחרונות, שאב בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) ושחזר את המשקע ב-10 milliliters של 2% sulfuric acid. בדוק את ה-OSIS תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שכל שאריות הצואה הוסרו בהצלחה מהדגימה.ה-osis מוכנים כעת למניפולציות נוספות, או שניתן לאחסנם בטמפרטורה של 4 °C עד למועד השימוש בהם. להלן תצפית על המראה של osis שאינם מטוהרים, באמצעות מיקרוסקופ בעל ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) בהגדלה של 400x. שימו לב לנוכחות של כמויות גדולות של מזהמי צואה בשדה הראייה, המקשים מאוד על זיהוי ה-OSI assists.כך נראים ה-OISS תחת הגדלה של 400x לאחר פרוטוקול טיהור במדרג צסיום כלוריד. שימו לב להיעדרם של שאריות צואה. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לטהר Toxoplasma gondii מצוואים של חתולי מעבדה שהודבקו, באמצעות מדרג צסיום כלוריד לא רציף.בביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לפעול לפי כל הנחיות הבטיחות ולהיות זהירים תמיד בעת יצירת מדרג ה-cesium chloride, על ידי הוספה איטית מאוד של כל שכבה תוך השתדלות לא להפריע למדרג או לערבב אותו. זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

obtaining-highly-purified-toxoplasma-gondii-oocysts-discontinuous

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

קדימה הגנטיקה היא שיטה רבת עוצמה לחשוף את הרמה המולקולרית של...

מסך גנטית לבודד Toxoplasma gondii מארח תאים יציאה מוטציות

פרוטוקול זה מתאר את השימוש זרימת משיק חלול סיבים מערכת ultrafiltration מדגם ריכוז דיסוציאציה חום כמו צעדים חלופיים עבור זיהוי של...

שינוי שיטת EPA 1623 שמשתמש תזרים משיק הולו סיבים Ultrafiltration ומחממים צעדים ניתוק לזהות waterborne<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; ו<em&gt; Giardia spp.</em

סרטון זה מדגים את טכניקת הכרומטוגרפיה של חילופי קטיונים לבידוד חלבון רקומביננטי מחלבון תא החרק ליזט.

כרומטוגרפיית חילופי קטיונים: טכניקה לבידוד חלבון רקומביננטי מטרה מליזט תאי חרקים בהתבסס על מטען פני שטח נטו

בסרטון זה אנו מדגימים שיטה במבחנה לטיהור ספורוזואיטים מביציות בעלות דופן עבה של הטפיל הפתוגני Cryptosporidium parvum. הספורוזואיטים המבודדים יכולים לשמש למחקרי זיהום.

בידוד Sporozoite במבחנה מ Cryptosporidium parvum ביציות

סרטון זה מדגים טכניקת מיקרו-הזרקה לפיתוח מודל זיהום אורגנואיד מעיים אנושי. שלב sporozoite זיהומיות של הטפיל Cryptosporidium parvum מוזרק מיקרו לתוך לומן אורגנואידי. עם פלישת תאי האפיתל של האורגנואיד, הוא עובר רבייה א-מינית ומינית כדי להשלים את מחזור חייו ומפיץ את הזיהום.

טכניקה לפיתוח זיהום טפיל באורגנואידים במעיים באמצעות מיקרו-הזרקה

מדידת פונקצית נוגדן היא מפתח להבנה חסינות למלרית falciparum Plasmodium. שיטה זו מתארת ​​את הטיהור של merozoites קיימא, ומדידה של phagocytosis opsonization תלוי על ידי cytometry זרימה.

טיהור תשואה גבוהה של<em&gt; Falciparum Plasmodium</em&gt; Merozoites לשימוש בOpsonizing נוגדן מבחני

שיטה זו של הפרדה trypanosome הדם תלויה שלהם תשלום משטח שלילי פחות מאשר בתרבית של תאי דם. דם נגוע להציב, שטופלו על עמודת מחליף אניון. שיטה זו, הכי מתאים אבחון של מחלת השינה, מספקת טפילים מטוהרים לחקירות חיסוניות, ביולוגיים, ביוכימיים, פרמצבטיקה וביולוגיה מולקולרית.

טיהור של Trypanosomes חוץ-תאית, כולל אפריקה, מן הדם על ידי אניון-מחליפי (Diethylaminoethyl-תאית עמודות)

נייר זה מפרט פרוטוקול להכנת תרבות שיתוף של תאים cryptococcal ו אמבות כי הוא למד באמצעות עדיין, תמונות פלורסנט ברזולוציה גבוהה שידור תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים. מומחש כאן היא הדרך שבה נתונים כמותיים יכולים להשלים מידע איכותי כזה.

שימוש משלים של טכניקות מיקרוסקופיים וקריאה פלואורסצנטית ללמוד קריפטוקוקוס-אמבה אינטראקציות

אנו מתארים פרוטוקולים כדי להכין זיהומים ולטהר את הנבגים עבור לימוד זיהום של המעי האנושי ואורגאואידים על ידי הקריפטוספורידיום parvum. אנו מדגימים את ההליכים למיקרו הזרקה של טפילים לתוך מעיים אורגנואיד וכתמים של אורגנואידים. לבסוף, אנו מתארים את הבידוד. של ציסטות שנוצרו...

לימוד זיהום הצפנה ברקמה תלת-ממדית-מערכות תרבות מיקרואיד של האדם הנגזר על ידי מיקרו-הזרקה

כאן, אנו מתארים תנאי תרבית חוץ גופית , בידוד וייצור מוגבר של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מ-Echinococcus granulosus. הרכבים החשמליים הקטנים התאפיינו בפיזור אור דינמי ובמיקרוסקופ אלקטרונים שידור. הספיגה על ידי תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם והאפנון הפנוטיפי שלהם נחקרו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וציטומטריית זרימה.

בידוד וספיגת תאים דנדריטיים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מ-Echinococcus granulosus

למד שיטה לטיהור שביצי Toxoplasma gondii מצואת חתולים באמצעות מדרגת כלוריד צזיום. הפרוטוקול מספק שביצים מטוהרות לניסויים במיקרוביולוגיה וביולוגיה מולקולרית.

קבלת מטוהרים Toxoplasma gondii שביצים ידי Gradient כלוריד רציפה וצזיום

גלה סרטונים נוספים