ממוקד רקמות מפלצות עובריים: דג הזברה Gastrula השתלת תאים

פרוצדורה זו מתחילה בסידור של עוברים של דגי זבוב (zebrafish) בשלב של תא בודד בתוך פלטת מיקרו-הזרקה. יש להזריק באמצעות מיקרו-הזרקה תמיסת דקסטרין פלואורסצנטית לחלמון. העוברים המוזרקים שנמצאים ממש מתחת לתא הם תורמי השתלה.

צפו את עוברי התורם והמארח וגדלו אותם עד לשלב המגן (shield stage). העמיסו שני עוברי דקסטרין שסופקו ב-DEC, שהוזרקו זה לצד זה, לתוך באער אחד של פלטת השתלה. חזרו על הפעולה עבור כל זוג תורמים. הוסיפו עובר מארח אחד לכל באער כדי לכוון את התאים המושתלים ל-di cephalon העתידי של המוח הקדמי; השתילו תאים מהקו האמצעי ואליו.

במרחק חצי דרך בין הקוטב החייתי למגן (shield). השתיל תאים מהרצועה התורמת אל הרצועה המארחת. גדל עד ל-30 שעות וקיבע.

בצעו אימונוכימיה במידת הצורך, קבעו לדף צביעה וצלמו. לחלופין, קבעו את המארח בחיים ובצעו דימיון במרווחי זמן (time lapse). שלום, שמי אליזבת דה שיין מהמעבדה של ד"ר מייקל איסי במחלקה למדעי הביולוגיה במכללה לסמית' בנוהמפטון, מסצ'וסטס.

ואני החוקר הראשי של המעבדה, ד"ר Michael Besi. היום נראה לכם כיצד ליצור עוברים כימריים על ידי ביצוע השתלות תאים בשלב הגסטולציה באמצעות מערכת המודל של דג הזברה. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדתי כדי לחקור את התפקוד של גנים ספציפיים על התפתחות הקומיסורה של המוח הקדמי, וכן את תהליך האינטראקציות בין אקסונים לגליות במהלך היווצרות הקומיסורה.

אם כן, נתחיל. כדי להתחיל, הכינו תבניות תעלות עבור לוחיות המיקרו-הזרקה על ידי שבירה זהירה לחצי של שלוש קפילרות ללא פילמנט, בקוטר 1 mm ובאורך 4 אינץ'. בעזרת דבק מהיר (super glue), הדביקו שניים מחצאי הקפילרות זה לצד זה על משטח הדבקה שטוח.

הניחו את הקפילרה השלישית מעל שתי הקפילרות הללו, כשהיא מקוננת בתוך החריץ כדי ליצור צורה של פירמידה. השאירו את התבנית להתייבש עם שלוש הקפילרות. עליכם להכין כשלוש עד חמש תבניות עבור כל פלטת הזרקה.

בשלב הבא, הכינו את פלטות ההזרקה על ידי מזיגת 20 עד 25 milliliters של מצע 1.5%aros במיגובה (molten) למנת עוברים לתוך צלחת פטרי בקוטר 100 millimeter. הניחו מיד שלוש עד חמש תבניות תעלה מוכנות בתחתית הפלטה, תוך וידוא שהצד השטוח של התבנית נוגע בתחתית צלחת הפטרי ומכוסה לחלוטין ב-aros. לאחר שה-aros התקשח, הסירו את תבניות התעלה על ידי חיתוך ריבוע aros גדול המכיל אותן.

הסרו בעדינות את האגר מהיקף הריבוע הגזור והשליכו אותו. הפכו את פיסת האגר הריבועית, ובעזרת פינצטה עדינה, הסירו לחלוטין את תבניות החריצים. מזגו אגר נוזלי לתוך צלחת הפטרי מסביב לריבוע כדי לקבע את הבארות שנוצרו במקומן.

המתינו להתset. ניתן לאטום את הפלטות באמצעות פאראפילם (paraform) ולאחסנן למשך שבועות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius. יש להשליך את הפלטות אם מופיעים סימנים כלשהם לצמיחה באגר.

לבסוף, כדי להכין את מחטי ההזרקה, השתמשו במושך קפילרות של מיקרו-פיפטה כדי להכין את המחטים מקפילרות זכוכית באורך ארבעה אינצ'ים ובקוטר מילימטר אחד עם פילמנטים פנימיים, כאשר פלטת המיקרו-הזרקה והמחטים מוכנות. נבחן כעת את איסוף העוברים ואת הגדרת מכשיר המיקרו-הזרקה. ביציות הפוריות נאספות מיד לאחר הנחתן ונשמרות בצלחת פטרי מלאה במדיום עוברים.

באמצעות פיפטת זכוכית בעלת קצה רחב, העבירו את העוברים לבארות של פלטת הזרקה בטמפרטורת החדר, הממולאת בתרחיף עוברים. השתמשו בפינצטה קהה כדי לדחוק בעדינות את העוברים לתחתית התעלות; עוברים שהמעטפת (chorion) או החלמון שלהם נפגעו יש להשליכם.

בשלב הבא, טענו את מחט ההזרקה עם 1 עד 2 µL של תמיסת דקסטרין פלואורסצנטית מהולה ב-Alexa 594. אפשרו לדקסטרין להגיע לקצה מחט ההזרקה באמצעות פעולת נימיות. חברו את מחט ההזרקה למחזיק הקפילריה של מיקרו-מניפולטור סטראאוטקטי וכווננו תחילה את הלחץ במכשיר המיקרו-מזרק.

40 עד 50 PSI ומשך פולס של 500 milliseconds. השתמש בפינצטה כדי לגרד או לגזור בעדינות את קצה מחט ההזרקה כדי לשבור את החתימה. באופן אידיאלי, הקוטר צריך להיות 0.05 עד 0.15 millimeters.

כדי לכייל את המחט, השתמשו במיקרוסקופ סטריאו והשריצו את הדקסטרין על מיקרומטר עם שמן מינרלי מעליו. שנו את גודל הבולוס על ידי התאמת משך לחץ האוויר של הפולס וגודל המחט. טיפ: יש לשמור על גודל בולוס השווה לנפח של 0.8 עד 1 nanoliters לאורך כל ההזרקות.

כעת ניתן להתחיל בהזרקה מיקרוסקופית של דקסטרין תוך שימוש בהגדלה של כ-3.2x במיקרוסקופ סטריאו. התחילו את ההזרקות לעוברים מקצה אחד של התעלה על ידי חדירה חלקה דרך הקוריון וקרומי התאים של העוברים כדי להגיע לחלמון. ההריקו את תמיסת הדקסטרין ממש מתחת לתא.

יש לוודא כי הסרת מחט ההזרקה מתבצעת באותה תנועה חלקה ששימשה להחדרה לעובר. הזז את צלחת הפטרי כדי למצב את העובר הבא בתור והמשך בהזרקות לאורך התעלה. בדוק את הלחץ ואת גודל הבולוס (bolus) באופן תקופתי.

כעת השתמשו בפינצטה כדי לדחוף בעדינות את העוברים החוצה מהתעלות. העבירו אותם לכלי פטרי המלא בתהליך הזנה לעוברים עם אנטיביוטיקה. דגרו את העוברים בטמפרטורה של 28.5 °C ועקבו אחריהם כדי לזהות ביצים שלא הופרו או מוות.

העובריים מוכנים כעת להשתלות עתידיות. לפני השלמת הפוליגסטראציה (poli during gas ration), חלקים מהחלמון נותרים חשופים. החלמון שבריר ביותר וידבק וייקרע בקלות על פלסטיק של פטרי dish.

לפיכך, יש להניח את העוברים על פלטות מצופות יום לפני ביצוע ההשתלה. הכינו פלטות קיבוע אלו על ידי מזיגת 5 עד 10 מיליליטר של agarose מומס לצלחית פטרי בני 100 מילימטר. שכבה דקה של agarose בעובי של כ-2 עד 3 מילימטרים בלבד נחוצה כדי להוות ריפוד לעוברים במהלך הקיבוע.

הניחו לצלחות להתקרר. לאחר מכן, הכינו צלחות השתלה נפרדות על ידי מזיגת 30 milliliters של תמיסת 1.5%aros לתוך צלחת פטרי של 100 millimeter והכנסה של תבנית לבארות השתלה. התבנית צריכה להכיל 104 שקעים משולשים, שכל אחד מהם מורכב משלושה צלעות של 90 מעלות וצלע אחת בזווית של 45 מעלות.

הבארות תוכננו להכיל שני עוברים זה לצד זה. יש להקפיד שלא ללכוד בועות אוויר מתחת לתבנית ולהמתין עד שהאגרוז יתקשה. הסרת התבנית חושפת שקע המכיל את הבארות המרובעות בעלות השפה המשופעת.

כדי להכין עוברים של מאחים ותורמים להשתלה, יש לנטר את התפתחותם כדי לשמור על זיווגים בעלי גיל תואם ככל הניתן. לשם כך, ניתן לגדל את העוברים בטמפרטורות משתנות שבין 23 ל-31 degrees Celsius כדי להאט או להאיץ את ההתפתחות. יש לצפות ידנית הן את עוברי המאחים והן את עוברי התורמים על פלטת ציפוי שעה אחת לפני הגיל הרצוי.

במקרה של השתקת תאים בשלב הגסטרולציה, יש להשלים זאת עד חמש שעות לאחר ההפריה (HPF), לפני שלב המגן (shield stage) בשעה 5.5 HPF. השתמשו בפיפט זכוכית להעברת העובר המארח ועוברים תורמים לתוך פלטת השתקה הממולאת בתווך אנטיביוטי לעוברים. כאן, השורה הראשונה ממולאת בעוברים תורמים, שני עוברים בכל באר, ושתי השורות הבאות ממולאות בעובר מארח בודד בכל באר.

עבור השתלות, אנו משתמשים במיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי Zeiss luer הכולל מנגנון זום ומיקוד אוטומטיים לחלוטין הנשלטים באמצעות ג'ויסטיק. למרות שמיקרוסקופ אוטומטי זה אינו הכרחי, הוא מגביר משמעותית את הקלות והיעילות של השתלות כירורגיות עדינות אלו, במיוחד כאשר נדרש מספר גבוה של השתלות. כדי להכין את מערך ההשתלה, כוון את ה-einor air tram למרכז הסקאלה שלו, חבר את צינור ה-air tram למחזיק הקפילריה ואבטח את המחזיק אל ה-einor automated micro manipulator. לאחר שהעוברים ומערך ההשתלה מוכנים, ניתן להמשיך כעת להשתלות תאים בשלב הגסטולציה.

המיומנות הקריטית ביותר בהשלמת השתלות תאים בשלב הגסטולציה היא היכולת לזהות את האנטומיה התאית של הבלסטים הגבונים (dorsal blasts), המכונה גם "המגן" (shield) בדגי zebrafish. כאן אנו מציגים סרטון רצוף של הגסטולה מזוויות ראייה שונות ומדגישים היכן ממוקם המגן במבט צדי זה. המגן או הצד הגבני נמצא מימין, בתוך המסגרת האדומה, כדי לאתר את התאים להשתלה אל המוח הקדמי ואל קו האמצע.

בדיוק במחצית הדרך בין הקוטב האנימלי (animal pole) למגן (shield), נתחיל לסובב את העובר תחילה לכיוונך כדי לצפות בקוטב האנימלי, תוך הדגשת המגן ואתר ההשתלה במהלך הסיבוב. לאחר מכן, העובר מסתובב סביב צירו כדי למקם את המגן בחלקו התחתון. כעת הגסטרולה מסתובבת חזרה למעלה, ומציגה מבט גבי (dorsal view) ישיר.

כעת העובר מסובב בחזרה ברצף למבט צדי בשלב של שש HPF. בעזרת המיקרו-מניפולטור, גע בעדינות בעובר עם קצה הנימי כדי לסובב אותו למצב המתאים לשליפת תאים, כך שקו האמצע והמגן (shield) שלו יהיו גלויים ומול קצה הנימה. ניתן לאמת בקלות את העוברים התורמים על ידי מעבר מתאורה בשדה בהיר לתאורה פלואורסצנטית. כאן, תאי הגסטרו-פילואורסצנציה זוהרים באדום. שאב כמות קטנה של מצע גידול עוברים אל תוך הנימה כדי למנוע כל אפשרות של מגע של התאים עם הממשק שבין האוויר למים, דבר שעלול לפגוע בהם.

נקב בעדינות את האקטודרמה של העובר התורם בקו האמצע, בדיוק בין הקוטב האנימלי למגן (shield). ב-gasa היו רק כ-20 micrometers של תאים בין האקטודרמה השטחית לבין החלמון שמתחתיה. לכן, היזהר לא לדקור את החלמון, שכן הדבר יוביל לעיתים קרובות למותו של העובר בתוך מספר שעות.

שאבו באיטיות את התאים אל תוך הנימי באמצעות ה-air tram. שמרו תמיד על נראות של קו המים תוך כדי הנעת הקצה בעדינות. השהייה בתוך התמיסה תסייע לשחרור המגעים בין התאים.

יש להוציא כ-10 עד 50 תאים מהעובר התורם. לאחר מכן, יש להוציא את הנימיור מהתורם. יש להכווין את העובר המארח באוריינטציה דומה, לדקור ולהזרים את התאים בדיוק לאותו מיקום בעובר המארח; מעבר מתאורה בשדה בהיר לתאורה פלואורסצנטית חושף את תנועת התאים המסומנים בדקסטרין מהמחט הנימיורית אל תוך העובר המארח.

לבסוף, לאחר השתלה, הוציאו את עוברי התורם והמארח מהבארות. הפרידו ביניהם והניחו אותם בעדינות בצלחת פטרי מצופה ב-A וממולאת במצע עוברים עם אנטיביוטיקה. דגרו את העוברים בטמפרטורה של 28.5 degrees Celsius. בכך הושלם תהליך ההשתלה.

נתחיל בתהליכי הוויזואליזציה והדימוי. ראשית, מקבעים את העוברים בשלב המתאים לדימוי במחזיר המאומת להיסטוכימיה של אימונוכימיה. במקרה שלנו, הקיבוע יתבצע ב-4% formaldehyde למשך שעתיים בטמפרטורת החדר או למשך לילה ב-4°C תחת סיבוב.

לאחר מכן, שטפו את העוברים המקובעים פעמיים, ולאחר מכן רחצו אותם במשך שלוש עד חמש דקות ב-0.1 molar pb. בצעו סימון אימונולוגי תקין במידת הצורך.

הניחו את העובריים ב-75% glycerol, השקיעו אותם בטמפרטורת החדר ואחסנו אותם בטמפרטורה של ארבע מעלות צלסיוס. הכינו שקופית להרכבת שני עובריים על ידי יצירת שני מסגרות ריבועיות של וזלין על גבי השקופית, התואמות לקוטר הפנימי של ריבוע. הניחו זכוכית כיסוי לצד העובר ובצעו כל דיסקציה נדרשת כדי להשיג מבט פרונטלי של המוח הקדמי.

נתקו את המוח הקדמי על ידי חיתוך בניצב למוח האמצעי. מקמו רקמה זו עם כמות מינימלית של glycerol בתוך ה-petroleum. כווןו את הרקמה למצב המתאים והניחו זכוכית כיסוי מעל הדגימה.

לחלופין, עבור עוברים חיים, קבעו אותם על זכוכית באמצעות תמיסת אגרו (agro) בריכוז 0.75%. בתחתית כלי תרבית, לפני שהאגרו מתמצק, השתמשו במחט טונגסטן כדי למקם את העובר an orientation הנכון עבור הדמיה. הן מארחים מקובעים והן מארחים חיים מדומיינים.

באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם סריקת לייזר Leica SP, נרכשו ערימות של חתכים במישור Z, ובוצע עיבוד תמונה תלת-ממדי או ארבע-ממדי באמצעות תוכנת velocity כדי ליצור עוברים כימריים שבהם חלק מאוכלוסיית האסטרוגליאה בתוך העובר שונה גנוטיפית או פנוטיפית. השתמשנו בגישה רב-גונית המשלבת שימוש בעוברים טרנסגניים ל-GFP, המסמנים את האסטרוגליאה, יחד עם השתלת תאים בשלבים של גסטולציה כדי לכוון באופן ספציפי את השיבוטים שלנו לצפאלון (cephalon). השתמשנו במפת הגורל של הגסטולציה בדגי zebrafish כדי לחלץ תאים באופן סלקטיבי מקו האמצע, במרחק שווה מהקטב האנימלי ומהמגן (shield).

תאים מופקים אלו הועברו לאחר מכן להשתלה באותו מיקום במארח gasa מסוג wild type, אשר גודל לאחר מכן עד ל-30 HPF ועבר סימון אימונו-היסטוכימי לכל האקסונים כנקודות ייחוס למבנה המוח הקדמי. בדוגמה המוצגת כאן, דימוי קונפוקאלי של עובר מארח אחד חושף תאים בודדים חיוביים ל-GFP ברחבי ה-cephalon וה-cephalon. ניתן להבחין במורפולוגיה המלאה של תאים חיוביים ל-GFP אלו בניסוי קלונלי זה, המגלה שרוב תאים אלו מקבלים את המורפולוגיה האופיינית של גליות רדיאלית, שבה הסומה ממוקמת בסמוך לאזור הוונטריקולרי וכף-קצה גדולה מסיימת זקיקה רדיאלית על פני השטח של הפלג.

רינדור תלת-ממדי של ה-Zack של פרוסות אופטיות אלו מראה בבירור את מיקומן של תאים אלה ביחס לאקסונים המסומנים. גישה נוספת הנפוצה להדמיה של תאים מושתלים היא הזרקה מיקרוסקופית ראשונית של צבע שושלת תאים פלואורסצנטי לחלמון שלו של עובר מסוג wild type או עובר טרנסגני ל-GFP בשלב תא אחד. בדוגמה זו, הזרקנו Alexa 5 94 dextrin לעוברים מסוג wild type.

בשלב התא הבודד, אפשרנו להם להתפתח לשלב הגסטרולה ולאחר מכן ביצענו ארבעה השתלות ממוקדות למוח כפי שצוין לעיל. אך במקום זאת, ביצענו השתלה למארח טרנסגני בשלב הגסטרולה ודימות של הצפאלון הגבי באמצעות סריקה בלייזר. מיקרוסקופיה קונפוקלית חשפה צבירים אדומים פלורסצנטיים של תאי תורם בין גרעינים חיוביים ל-GFP בתוך המוח הקדמי.

ניתחנו את המארח הזה באופן מעמיק יותר על ידי איסוף צירים (Z-stacks) בכל שלוש דקות לאורך שעתיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי עם סריקת לייזר. רינדור תלת-ממדי של סרטון צילום הזמן (time lapse) באמצעות תוכנת velocity שסופקה על ידי IMP מראה תנועות תאיות דינמיות של ממברנות התאים של ה-rod domine והגרעינים החיוביים ל-GFP. הראינו לכם כיצד להכין את כל המכשור והריאגנטים הדרושים להשתלת תאים בעוברים של zebrafish.

באופן ספציפי, הדגמנו את הטכניקה בשלב הגסטולציה. עם זאת, היא ישימה גם להשתלות בשלב הבלסטולה. בעת שימוש בהליך זה, חשוב להקרין במדויק את המיקום הסופי הרצוי של התאים המושתלים אל מול מיקום מפת הגורל המוקדם יותר של תאים אלו בגסטולציה; לעיון נוסף, ניתן להיעזר במחקרו המפורט של ד"ר Scott Frazier משנת 1995 על מפות גורל של דגי זברה, שכותרתו Fate Maps of the Zebrafish Embryo.

זהו זה. תודה לצפייתכם ובהצלחה בניסוייכם.