Name: מהיר רגיש Colloidal Coomassie G-250 מכתים עבור חלבונים גל polyacrylamide (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-03T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: למדו פרוטוקול צביעה מודיפיקציה של Coomassie G-250 לזיהוי חלבונים ברמות ננוגרם בג'לי פוליאקרילאמיד. השיטה מאפשרת השלמת צביעה תוך שעתיים ומתאימה ליישומים אנליטיים בפרוטאומיקה מבוססת ג'ל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר ניקולה Wiethölter עבור הכנת מכתים של 1-D ג&#39;לים. עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם דויטשה Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 ל ND ו - SM) ונתמך על ידי מענק מחקר מן Manchot יורגן Stiftung ל ND.

חלק 1: דו מימדי (2-D) ג&#39;ל אלקטרופורזה באמצעות כוס העמסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IPG-רצועת התייבשות ומיקוד isoelectric (IEF) <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעננותם ג&#39;לים Immobiline DryStrip, pH 6-11 (7 ס&quot;מ) בתמיסה 125 התייבשות μl [7 M אוריאה, 2 M thiourea, בחורים 4%, 50 hydroxyethyldisulfide מ&quot;מ 2% IPG pH הצפת 6-11] באמצעות מגש DryStrip Immobiline Reswelling עבור לפחות 10 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים מדגם חלבון זירז במאגר מדגם IEF [7 M אוריאה, 2 M thiourea, בחורים 2%, 2% ASB-14, 50 hydroxyethyldisulfide מ&quot;מ 2% IPG pH הצפת 6-11] המקביל לחלבון 60-100 מיקרוגרם לכל 100 μl . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר solubilization (לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר), להחיל מדגם חלבון באמצעות anodic כוס טעינה באמצעות כוסות המדגם. נפח כוס הוא 100 μl (כוסות סעפת לאפשר עד μl 150). הערה: אתה יכול לטעון כמויות מדגם גדול יותר אם תוסיף צעד מתח נמוך בתחילת פרוטוקול התמקדות ולמלא את הכוסות כל עוד יש סרט הנוזל בכוס! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע isoelectric התמקדות עבור קו&quot;ה 11.1 במצב שיפוע ביחידה אלקטרופורזה Multiphor השנייה. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איזון ו SDS-PAGE <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר IEF, רצועות IPG ​​היו נתונים הפחתת אלקילציה, בכל פעם 15 דקות על שייקר, באמצעות dithiothreitol 1% ו 2.5% בהתאמה iodoacetamide בפתרון איזון [50 מ&quot;מ Tris-HCl/pH 8.8, 6 M אוריאה, גליצרול 30% ו -2% SDS]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את רצועות equilibrated עם H 2 O ו - כתם אותם על גבי נייר whatman להסיר חיץ איזון עודף. לאחר מכן טובלים את רצועות חיץ SDS ריצה (1X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הממד השני מבוצע על ידי SDS-PAGE על מערכות אלקטרופורזה אנכי עם ריכוז acrylamide סך של 12%. רצועות IPG ​​equilibrated הונחו על החלק העליון של ג&#39;לים להפריד קבוע עם פתרון agarose חם [agarose 0.5% בניהול מאגר המכיל כחול bromophenol]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלבונים הופרדו עבור 2.5 שעות, החל מהשעה V 80 ל -15 דקות ואחריו V 120 עד הכניסה לצבוע מגיע התחתון של הקלטת ג&#39;ל. </li></ul></li></ol> חלק 2: Colloidal מכתים Coomassie עם CBB G-250 1. מכתים פתרונות הערה: להכנת הפתרונות מכתים, להשתמש בחומרים כימיים עם איכות גבוהה כגון כיתה אנליטית (רש&quot;פ) ומים של טוהר גבוה ככל שאתה מקבל Millipore מערכות (מילי-Q מים). <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> Coomassie פתרון: </td><td> מודעה 2000 מ&quot;ל H 2 O </td></tr><tr><td> 0.02% (w / v) </td><td> CBB G-250 </td><td> 0,4 גרם </td></tr><tr><td> 5% (w / v) </td><td> אלומיניום סולפט (14-18), מימה </td><td> 100 גרם </td></tr><tr><td> 10% (V / V) </td><td> אתנול (96%) </td><td> 200 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 2% (V / V) </td><td> orthophosphoric חומצה (85%) </td><td> 47 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> הערה: להכנת הפתרון מכתים, הוספת רציפים המרכיבים לפי הסדר הבא חייב להישמר: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> first לפזר סולפט אלומיניום במים מילי-Q </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן להוסיף אתנול, homogenize, ומערבבים CBB G-250 לפתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי לאחרונה כמו הפתרון הוא נמס לגמרי, מוסיפים חומצה זרחתית (שילוב של חומצה לתקשורת אלכוהוליים מאפשר מולקולות Coomassie המצרפי למצב colloidal שלהם) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוף סוף להתמלא מים מילי-Q </li></ol> הערה: הפתרון הסופי מכתים יש מראה כהה ירוק כחלחל מלא חלקיקים שחייה סביב: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תסנין פתרון זה! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם שינית את סדר ההכנה, היית מקבל פתרון יותר סגול כחלחל כי הוא רגיש פחות. </li></ul><table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> Destaining פתרון: </td><td> מודעה 2000 מ&quot;ל H 2 O </td></tr><tr><td> 10% (V / V) </td><td> אתנול (96%) </td><td> 200 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> 2% (V / V) </td><td> orthophosphoric חומצה (85%) </td><td> 47 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> 2. מכתים נוהל <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההפרדה המימד השני, בזהירות להסיר את הג&#39;לים של לוחות זכוכית ולהעביר אותם לתוך צלחת מכתים מלא מים מילי-Q. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הג&#39;לים שלוש פעמים במים מילי-Q במשך 10 דקות על שייקר האופקי (שטיפה לא מספקת גורמת רגישות העניים כי SDS הנותרים על הג&#39;לים מפריעה התוחמת של הצבע לחלבון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake הפתרון Coomassie לפני השימוש כדי לפזר את חלקיקי colloidal שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ג&#39;לים מכוסה היטב על ידי תסיסה על שייקר עם פתרון Coomassie במשך 2-12 שעות. מכתים זה יוצר רקע שולית, כך שתוכל לבחון את התקדמות מכתים שביניהם. הערה: לאחר 10 דקות ניתן לראות כתמי חלבון הראשון המופיע בתוך 2 שעות הדגירה כ 80% מכתים את זהרמה מקסימלית של הושלמה. עבור מכתים כמעט 100%, הדגירה לילה מומלץ. במקרים מסוימים, כאשר כמות החלבון להיות מוכתם הוא עצום פתרון הופך כחול בהיר, רענון של הפתרון מכתים הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההליך מכתים להסיר את הפתרון Coomassie ולשטוף את הג&#39;לים פעמיים עם מים מילי-Q. הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר פתרון מכתים עוד חלקיקים עדיין הנותרים, אחרת לבטל את זה (יש לזכור כי במעבדה שלך יכול להיות תקנות מיוחדות עבור סילוק פסולת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת דבק חלקיקי צבע מצלחת מכתים במגבת-מוך חופשי נייר destain עבור 10 - 60 דקות. הערה: ניתן גם לשטוף את הג&#39;לים רק עם מים מילי-Q אבל זה מומלץ רק עבור preparative ג&#39;לים כי תימשך לא סדיר, חלש הסרט Coomassie על ג&#39;לים שתקום במהלך הליך הסריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף לשטוף את הג&#39;לים פעמיים עם מים מילי-Q: ג&#39;לים יגיע עובי המקורי שלהם (את האלכוהול חומצה התקשורת עושה את התכווצות ג&#39;לים) ו נטרול במים בנוסף משפר את עוצמת הצבע של Coomassie. </li></ul> חלק 3: תוצאות נציג אם אתה מבין את הפרוטוקול המתואר לעיל תקבל על 2-D שלך הייחודי ג&#39;ל נקודות נפתרה גם מוכתם כחול כהה חלבון. אפילו בהשוואה ג&#39;ל 2-D מוכתם כסף לפי שבצ&#39;נקו et al. 5, פרוטוקול בטענה רגישות תאימות טובה עם ספקטרומטריית מסה, אנחנו משיגים תוצאות מכתים שווים. <img src="/files/ftp_upload/1431/fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: התוצאה הסופית של הניסויים שתוארו לעיל. Coomassie קאנג של פרוטוקול (א) מבצע חזק כמו מכתים את הכסף על פי שבצ&#39;נקו et al. (ב) באיתור חלבונים לאחר אלקטרופורזה 2 D-ג&#39;ל. חלק 4: טיפים וטריקים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו כמה stainings בדיקה לפני עיבוד דגימות משלך. מסיבות בלתי מוסברים דיווחנו כי לפעמים חלבון של עניין לא ניתן היה לזהות בהצלחה גם כאשר מיליגרם יושמו. במקרה זה אנו ממליצים להכין כמה סדרות דילול כדי לבדוק רגישות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש לך נמוך ג&#39;ל זיהוי של חלבון (ים) העברה, בכלל לא מוצלח מן הערמה על ג&#39;ל המפריד במהלך SDS-PAGE יהיה להיות הסיבה. אתה יכול לבדוק חלבונים דביק כזה על ידי מכתים את הג&#39;ל מלא כולל באזור הערמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אימות מהיר של תוצאות isoelectric שלך התמקדות, אתה יכול ישירות הכתם IPG, רצועות ללא הפרדה ממד נוסף בכל שנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדי פעם להפוך את ג&#39;לים במהלך ההליך מכתים ולכן הם מוכתמים באופן שווה משני הצדדים (אם אתה שומר הג&#39;לים מתרגשים, לצבוע רק נקשר בצד אחד של הג&#39;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חווינו את זה אחסון של הפתרון מכתים בבקבוק כהה מגביר את חייה (בבקבוקים שקופים עד חודש 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכתים ותיעוד אתה יכול לשמור את ג&#39;ל במקרר במשך כמה שנים (אם תוסיף פתרון חומצי לך למנוע זיהומים על ידי פטריות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Destaining של אטמי ג&#39;ל למשך לעכל tryptic יכול להיות מואץ על ידי חימום בתנור אבן. </li></ul>

<ol><li>Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+new+staining+procedures+for+quantitative+estimation+of+proteins+on+electrophoretic+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips.</a> Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).</li>
<li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).</li>
<li>Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+Silver%3A+A+very+sensitive+colloidal+Coomassie+G-250+staining+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis.</a> Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).</li>
<li>Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Sensitive+and+Fast+Protein+Detection+with+Coomassie+Brilliant+Blue+in+Sodium+Dodecyl+Sulfate-Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+Korean+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.</a> Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).</li>
<li>Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+sequencing+of+proteins+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels.</a> Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).</li>
</ol>

חדשני או רק עוד פרוטוקול Coomassie? כרגע קיימים פרוטוקולים מרובים עבור מכתים נהלים Coomassie כחול מבריק. רובם תוצאה של שינויים קלים או גדולים של אחד הפרוטוקולים הנפוצים ביותר על ידי נייהוף ועמיתיו 2. כמו כן, פרוטוקול של קאנג מבוסס על נוסחה של נייהוף. אבל האם זה באמת שיטה חלופית מכתים Coomassie למחקר proteomic? אנו התמונה בשני נושאים עיקריים, גבול הגילוי ושימושיות, על ראיות כי זה בהחלט פרוטוקול מכתים מו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> שם המוצר </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> עבור IEF ו SDS-PAGE: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip ג&#39;לים </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6001-94 </td><td> יכול גם לשמש 2 שנים לאחר פקיעת תאריך. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip מגש Reswelling </td><td> GE Healthcare </td><td> 80-6371-84 </td><td> אין לנקות עם ממסים אורגניים. עוצב עבור 7-18 ס&quot;מ IPG, רצועות. </td></tr><tr><td> Immobiline DryStrip Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1004-30 </td><td> כולל מגש, מחזיק אלקטרודות, אנודה קתודה אלקטרודות, aligner וכוס בר מדגם כוסות המדגם. </td></tr><tr><td> EPS 3501 XL ספק כוח </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1130-05 </td><td> ספקי מתח עד 3500 V. </td></tr><tr><td> Multiphor II יחידת אלקטרופורזה </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1018-06 </td><td> אלקטרודות Movable לאפשר IEF ברצועות IPG ​​אורך הכול (7-24 ס&quot;מ IPG רצועות) </td></tr><tr><td> PerfectBlue ג&#39;ל מערכת Twin S </td><td> Peqlab </td><td> 45-1010-C </td><td> SDS-PAGE בפורמט 10x10 ס&quot;מ מיני ג&#39;ל. ג&#39;ל קאמרית כולל מערכת קירור. </td></tr><tr><td> עבור colloidal מכתים Coomassie G-250: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> מכתים מנות עם מכסים </td><td> VWR </td><td> 216-3412 </td><td> מתאים עבור מיני ג&#39;לים. Stackable על שייקר. </td></tr><tr><td> אלומיניום סולפט-18-מימה </td><td> מרק </td><td> 1.01102.5000 </td><td> עשינו את החוויה הטובה ביותר עם מרק. זמין רק בחבילה 5 ק&quot;ג. </td></tr><tr><td> orthophosphoric חומצה </td><td> Prolabo </td><td> 20 624.295 </td><td> נמכר בתוך בקבוקי זכוכית. </td></tr></table>

מהיר רגיש colloidal coomassie g-250 מכתים עבור חלבונים ג&#39;ל polyacrylamide

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Coomassie מבריק כחול (CBB) הוא צבע נפוץ עבור להדמיה של חלבונים מופרדים על ידי SDS-PAGE, המציע הליך מכתים פשוט quantitation גבוהה. יתר על כן, הוא תואם לחלוטין עם הזדהות המונית חלבון spectrometric. אך למרות יתרונות אלה, CBB נחשב להיות רגישים פחות כסף או stainings הקרינה ולכן רק לעתים נדירות נעשה שימוש לצורך זיהוי של חלבונים הג&#39;ל מבוסס גישות אנליטיות proteomic. שיפורים אחדים המקורי Coomassie פרוטוקול 1 נעשו כדי להגדיל את הרגישות של CBB. שני השינויים העיקריים שהוכנסו על מנת לשפר את הזיהוי של נמוכה שפע חלבונים ידי המרת מולקולות צבען לחלקיקים colloidal: בשנת 1988 חל נייהוף ועמיתיו מתנול 20% ו ריכוזים גבוהים יותר של אמוניום סולפט לתוך פתרון ה-G-250 מכתים CBB מבוסס 2, ובשנת 2004 Candiano et al. הוקמה כסף כחול באמצעות CBB G-250 עם חומצה זרחתית בנוכחות סולפאט אמוניום, מתנול 3. עם זאת, כל השינויים האלה רק לאפשר זיהוי של חלבון כ 10 ננוגרם. פרוטוקול fameless נרחב מכתים Coomassie colloidal פורסם על ידי קאנג et al. בשנת 2002 שונה שם הם מכתים פרוטוקול colloidal של נייהוף CBB לגבי חומרים complexing. במקום אמוניום סולפט הם השתמשו סולפט אלומיניום מתנול הוחלף 4 אתנול פחות רעיל. אלומיניום מבוסס הרומן מכתים במחקר של קאנג הראו רגישות מעולה שמזהה נמוך כמו 1 ng / להקה (phosphorylase ב) עם וריאציה קצת רגישות בהתאם חלבונים. הנה, אנחנו מדגימים יישום פרוטוקול של קאנג עבור מכתים מהיר ורגיש Coomassie colloidal של חלבונים למטרות אנליטיות. נדגים את פרוטוקול מהירה וקלה באמצעות דו מימדי ג&#39;לים ביצע באופן שגרתי בקבוצת העבודה שלנו.

וידאו זה יהיה פופולרי colloidal Coomassie G-250 פרוטוקול מכתים פי קאנג<em&gt; Et al.</em&gt; לצורך זיהוי של חלבון 4 ממוצע ng ב ג&#39;לים. מכתים הושלם בתוך 2 שעות ללא כל מאמץ. אנו משתמשים באופן שגרתי פרוטוקול של קאנג למטרות אנליטיות הג&#39;ל מבוסס proteomics.

מהיר רגיש Colloidal Coomassie G-250 מכתים עבור חלבונים ג&#39;ל polyacrylamide

Coomassie Brilliant Blue (CBB) הוא צבע המשמש באופן נפוץ להדמיה של חלבונים שהופרדו ב-SDS-PAGE, ומציע הליך צביעה פשוט ו...

בסרטון זה, נדגים את יעילותו של פרוטוקול צביעת Coomassie משופר לזיהוי של מספר ננוגרמים של חלבון בג'לים של polyacrylamide. באמצעות דוגמה של אלקטרופורזה של ג'לים דו-ממדיים לפני ההפרדה בממד הראשון, רצועות של Immobilized pH gradient עוברות רהידרטציה בתנאי באפר דנטורציה.לאחר השריה מחדש של הפסים למשך לילה, דגימות החלבון מוכנסות באמצעות טעינה בכוס אנודית. במהלך תהליך המיקוד, החלבונים מופרדים בהתאם לנקודות האיזואלקטריות שלהם. הפרדה בממד שני מבוצעת באמצעות SDS page.לאחר מכן מעבירים את הג'ל לכלי צביעה ומזהים את החלבונים באמצעות צביעה ב-colloidal kumasi. שלום, אני נדין דה בלה מהמעבדה של סבינה מקה במרכז למחקר ביולוגי רפואי באוניברסיטת אולור. היום אכוון את תשומת לבכם להליך שאינו מוכר באופן נרחב על פי עמיתי קנגאן; Cy Brilliant Blue הוא צבע המשמש בדרך כלל להדמיה של חלבונים לאחר הפרדות אלקטרופורטיות, אך לעיתים קרובות מניחים כי הוא פחות רלוונטי עבור פרוטאומיקה השוואתית.עם זאת, צביעה קולואידית ב-cos מציעה יתרונות משמעותיים מבחינת רגישות, עלויות ופרקטיקה. במעבדה שלנו אנו משתמשים בפרוטוקול צביעה ב-K עבור כמעט כל יישום מבוסס ג'ל, ובמיוחד בפרוטאומיקה אנליטית כדי לקבוע שינויים בביטוי של חלבונים בשריר הלב. אני הדגים את השימוש בשיטה זו לזיהוי חלבונים בשריר הלב בטווח pH בסיסי של ג'לים של אלקטרופורזה דו-ממדית

fast-sensitive-colloidal-coomassie-g-250-staining-for-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בעקבות ההפרדה על ידי שיטות electrophoretic, חלבונים בג'ל ניתן להבחין באמצעות שיטות צביעה שונות. הכתמה של חלבונים עם Coomassie כחול, מכתים כסף, SYPRO אורנג', SYPRO רובי הם הפגינו וידאו.

מכתים חלבונים ג&#39;ל

פרוטוקול קצר מכתים חלבון עם Coomassie מבריק כחול (CBB) G-250 ב ג'לים polyacrylamide מתואר ללא שימוש בממיסים אורגניים או חומצה אצטית כמו הנהלים מכתים קלאסית עם CBB.

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

בסרטון זה, אנו מתארים את האפיון של מתחמי multiprotein (MPCs) על ידי כחול אלקטרופורזה בג'ל יליד polyacrylamide (BN-PAGE). במימד ראשון, lysates הסלולר dialyzed מופרדים על ידי-BN לזהות MPCs בודדים. במימד השני SDS-PAGE, MPCs עניין מחולקים נוספת לנתח בוחריהם ידי immunoblotting.

ג&#39;ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

בסרטון זה, אנו מדגימים שיטת צביעת כסף של ג'לים polyacrylamide עבור הדמיה של חלבון הכולל באמצעות בדיקות פלואורוגניות.

צביעת כסף פלואורסצנטית: טכניקה להמחשת סך החלבון בג'ל פוליאקרילאמיד

סרטון זה מדגים טכניקת הפרדה מבוססת פוליאקרילאמיד דנטורינג עבור חלבונים. טכניקה זו מסייעת בזיהוי ראשוני של חלבונים על בסיס משקלם המולקולרי.

נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה לניתוח חלבונים: טכניקה להפריד ולדמיין חלבונים על בסיס משקל מולקולרי

בסרטון זה אנו מדגימים שיטת אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל המפרידה חלבונים בודדים מתערובת חלבונים מורכבת המתקבלת מרקמות גידוליות של אדנומת יותרת המוח האנושית הלא תפקודית (NFPA). החלבונים מופרדים על בסיס המטען החשמלי שלהם בממד הראשון ובהמשך מופרדים על בסיס משקלים מולקולריים בממד השני.

אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד דו-מימדי: טכניקת הפרדה לניתוח חלבונים בתערובת חלבונים מורכבת המבוססת על מטען ומשקל מולקולרי

כאן, אנו מציגים דו-ממדית בג'ל (2DE) בשילוב עם ספקטרומטר מסה (MS) להפריד ולזהות פרוטאום רקמת גידול בבלוטת יותרת המוח האנושי, אשר מציג תבנית לשחזור וטוב 2DE. חלבונים רבים שנצפו במקום כל 2DE בעת ניתוח סרטן מורכב פרוטאום עם השימוש של MS רגישות גבוהה.

אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל בשילוב עם שיטות ספקטרומטר מסה על ניתוח של רקמת גידול בבלוטת יותרת המוח האנושי פרוטאום

כאן, אנו מדווחים על כסף ופשוט נמוכים מכתים פרוטוקול אשר דורש רק שלושה ריאגנטים, 7 דקות של עיבוד, מתאימה לדור מהירה של נתונים איכותיים הסובייטית בניתוח גנטי.

מהר כסף מכתים פרוטוקול המאפשר פשוטה וסמנים יעיל לזיהוי של הסובייטית באמצעות ג'ל לזיהוי Non-denaturing

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט חלוקה לרמות של פלורסנט חדש מכתים טכניקה לגילוי חלבון סה בג'לים לזיהוי. הפרוטוקול מנצל בדיקה קרינה פלואורסצנטית ספציפיים יון כסף מדליק, אשר מגלה Ag+-חלבון מכלולי ומונע הגבלות מסוימות של כתמי כסף הדפסות כסף מסורתי.

צביעת כסף פלורסנט של חלבונים בג'לים לזיהוי

כדי להתגבר על המגבלות של מוטגנזה קלאסית מכוונת אתר, אנלוגים פרולין עם שינויים ספציפיים שולבו במספר חלבונים פלואורסצנטיים. אנו מראים כיצד החלפת מימן על ידי פלואור או של היחיד על ידי קשרים כפולים בשאריות פרולין ("ניתוח מולקולרי") משפיעה על תכונות חלבון בסיסיות, כולל קיפולם ואינטראקציה עם אור.

חילופי פרולין ספציפיים לשאריות על ידי אנלוגים פרולין בחלבונים פלואורסצנטיים: כיצד "ניתוח מולקולרי" של עמוד השדרה משפיע על קיפול ויציבות

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניתוח של סופרקומפלקסים נשימתיים כאשר רק כמויות קטנות של דגימות זמינות.

בידוד מיטוכונדריה לניתוח סופר-קומפלקס מיטוכונדריאלי מדגימות רקמה קטנה ותרביות תאים 

למדו פרוטוקול צביעה מודיפיקציה של Coomassie G-250 לזיהוי חלבונים ברמות ננוגרם בג'לי פוליאקרילאמיד. השיטה מאפשרת השלמת צביעה תוך שעתיים ומתאימה ליישומים אנליטיים בפרוטאומיקה מבוססת ג'ל.

מהיר רגיש Colloidal Coomassie G-250 מכתים עבור חלבונים ג'ל polyacrylamide

גלה סרטונים נוספים