מהיר רגיש Colloidal Coomassie G-250 מכתים עבור חלבונים ג'ל polyacrylamide

בסרטון זה, נדגים את יעילותו של פרוטוקול צביעת Coomassie משופר לזיהוי של מספר ננוגרמים של חלבון בג'לים של polyacrylamide. באמצעות דוגמה של אלקטרופורזה של ג'לים דו-ממדיים לפני ההפרדה בממד הראשון, רצועות של Immobilized pH gradient עוברות רהידרטציה בתנאי באפר דנטורציה.

לאחר השריה מחדש של הפסים למשך לילה, דגימות החלבון מוכנסות באמצעות טעינה בכוס אנודית. במהלך תהליך המיקוד, החלבונים מופרדים בהתאם לנקודות האיזואלקטריות שלהם. הפרדה בממד שני מבוצעת באמצעות SDS page.

לאחר מכן מעבירים את הג'ל לכלי צביעה ומזהים את החלבונים באמצעות צביעה ב-colloidal kumasi. שלום, אני נדין דה בלה מהמעבדה של סבינה מקה במרכז למחקר ביולוגי רפואי באוניברסיטת אולור. היום אכוון את תשומת לבכם להליך שאינו מוכר באופן נרחב על פי עמיתי קנגאן; Cy Brilliant Blue הוא צבע המשמש בדרך כלל להדמיה של חלבונים לאחר הפרדות אלקטרופורטיות, אך לעיתים קרובות מניחים כי הוא פחות רלוונטי עבור פרוטאומיקה השוואתית.

עם זאת, צביעה קולואידית ב-cos מציעה יתרונות משמעותיים מבחינת רגישות, עלויות ופרקטיקה. במעבדה שלנו אנו משתמשים בפרוטוקול צביעה ב-K עבור כמעט כל יישום מבוסס ג'ל, ובמיוחד בפרוטאומיקה אנליטית כדי לקבוע שינויים בביטוי של חלבונים בשריר הלב. אני הדגים את השימוש בשיטה זו לזיהוי חלבונים בשריר הלב בטווח pH בסיסי של ג'לים של אלקטרופורזה דו-ממדית.

אם כך, נתחיל. הממד הראשון של אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדי הוא מיקוד איזואלקטרי או IEF, ולצורך ניתוח זה משתמשים ברצועות עם מדרג pH מקובע או רצועות IPG.

לפני ביצוע IEF, ארבעה פסי IPG עוברים רהידרציה באופן פרטני ב-125 µL של תמיסת רהידרציה באמצעות מגש הנפחת פסים יבשים של IM Mobilly למשך 10 שעות לפחות, עד שהפסי IPG עוברים רהידרציה ומוכנים להעמסת דגימות החלבון. דגימות חלבון שהושקעו באמצעות TCA מארבע הכנות לב שונות מומסות בבופר דגימות ל-IEF עד לריכוז של 100 µg חלבון ל-100 µL. תהליך ההמסה של דגימות החלבון יימשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר על וורטקס.

בינתיים, הכינו את הרכיבים הנוספים של ערכת ה-IM Molene dry strip לביצוע IEF ביחידת האלקטרופורזה multi four. ראשית, הגדירו את טמפרטורת יחידת הקירור ל-20 °C, טפטפו בעזרת פיפט 3 עד 4 mL של נוזל כיסוי על פלטת הקירור והניחו עליה את מגש ה-Immobilen dry strip כאשר חיבור האלקטרודה האדום פונה לעבר האנודה. שפכו כ-10 mL של שמן כיסוי לתוך מגש ה-Immobilen dry strip והניחו את מיישר ה-Immobilen dry strip, כאשר צד החריץ פונה כלפי מעלה, על המגש המכוסה בשמן.

בשלב הבא, הוצא את הרצועה שעברה רהידרציה מתבנית ההנפחה והעבר אותה, כאשר צד הג'ל פונה כלפי מעלה, אל החריצים של המיישר. הקצה החומצי של הרצועה צריך לפנות לכיוון האנודה. בסיום, כל הרצועות צריכות להיות מיושרות כך שקצותיהן האנודיים פונים לאותו כיוון.

הנח רצועות אלקטרודות רוויות במים מזוקקים באופן רוחבי על קצות רצועות הג'ל, תוך וידוא שרצועות האלקטרודות באות מגע, לפחות באופן חלקי, עם פני השטח של הג'ל. לבסוף, מקם את האלקטרודות על רצועות האלקטרודות כך שהסימון הצבעוני פונה לעבר מגע האלקטרוני התואם. מקם את מוט כוסות הדגימה ליד האנודה במגש רצועות הייבוש של immobilien והנח כוס דגימה מעל כל רצועת IPG.

לחצו בעדינות על כוסות הדגימה כלפי מטה כדי להבטיח מגע טוב עם רצועת ה-IPG. שפכו 70 עד 80 milliliters של שמן כיסוי אל תוך התבנית כדי לכסות את רצועות ה-IPG. אין לאפשר לשמן לדלוף אל תוך כוסות הדגימה.

אם שמן דולף לתוך הכוס, הסר אותו באמצעות פיפט וכוון את הכוסות שוב. לבסוף, הוסף כ-150 milliliters של שמן כיסוי כדי לכסות לחלוטין את כוסות הדגימה. כעת העבר את דגימות החלבון אל כוסות הדגימה באמצעות פיפט, מתחת לפני השטח של נוזל הכיסוי.

נפח הגביע הוא 100 µL. לאחר שכל דגימות החלבון הועברו, חברו את כל המוליכים. חברו את יחידת ה-multi four לספק הכוח ובצעו מיקוד איזואלקטרי למשך 11.1 kVh במצב גרדיאנט. לאחר ה-IEF, הניחו את רצועות ה-IPG בתבנית כאשר צד הג'ל פונה כלפי מעלה, והעבירו אותן תהליכי רדוקציה ואלקילציה במהלך השיווי (equilibration).

לצורך רדוקציה, השתמש ב-2.5 milliliters של תמיסת שיווי משקל 1% DTT לכל רצועה. לאחר מכן, נער במשך 15 דקות, ואז החלף לחלוטין את תמיסת ה-DTT ובצע אלקילציה לרצועות בתמיסת שיווי משקל 2.5% iodoacetamide תוך כדי ניעור למשך 15 דקות נוספות. שטוף את הרצועות שעברו שיווי משקל פעם אחת בכלי כימי מלא במים וספוג אותן בנייר סינון כדי להסיר עודפי תמיסת שיווי משקל.

בשלב הבא, העבירו את הפסים לתוך תמיסת ריצה אחת של XSDS. החלבונים שבפסים מוכנים כעת לממד השני של האלקטרופורזה במג'ל דו-ממדי (2D gel electrophoresis). הממד השני מבוצע באמצעות SDS-PAGE במערכת אלקטרופורזה אנכית.

מכינים מספר מתאים של ג'לים בערך של 12% acrylamide בעובי של מילימטר אחד יום לפני השימוש, ושומרים אותם מכוסים בנייר רטוב. בטמפרטורת החדר, מניחים את רצועות ה-IPG שעברו שיווי משקל על גבי ג'לי ההפרדה ומקבעים אותם בעזרת תמיסת agarose חמה. החלבונים מופרדים במשך 2.5 שעות, החל מ-80 volts למשך 15 דקות, ולאחר מכן ב-120 volts עד שחזית הצבע מגיעה לתחתית קסת הג'ל.

בזמן שהחלבונים מופרדים באמצעות SDS page, הכין את התמיסות לצביעת colloidal kumasi של הג'ל. בעת הכנת תמיסת הצביעה, חשוב מאוד לשמור על סדר ההוספה הרצף של הרכיבים באופן הבא. ראשית, המס 100 grams של aluminium sulfate ובער בתוך כוס כימית עם כ-1.5 liters של milli cube water. לאחר שה-aluminium sulfate נמס, ערבב 200 milliliters של ethanol והוסף לתמיסה 0.4 grams של CBG two 50.

ברגע ש-CBB G two 50 התמוסס לחלוטין, יש להוסיף 47 milliliters של ortho phosphoric acid. שלב זה מאפשר למולקולות ה-kamasi להצטבר למצב הקולואידי שלהן. לבסוף, יש להוסיף milli Q water עד לנפח סופי של two liters.

בתמיסה הסופית שתישארו חלקיקים ששוחים סביב. אין לסנן תמיסה זו. ניתן להכין את תמיסת הצביעה מראש ולאחסנה בחושך עד לשימוש.

עם סיום הרצת ג'ל ה-SDS, הוצא בעדינות את הג'ל מבין לוחות הזכוכית והעברה אותו לכלי צביעה מלא במי Milli Q. הנח את הכלי עם הג'ל על מנער אופקי ונער למשך 10 דקות.

חזור על השטיפה פעמיים נוספות למשך כ-5 עד 10 דקות. השתמש במים מזוקקים טריים (milli cube); חשוב לשטוף את הג'ל היטב כיוון ששאריות של SDS על הג'ל עלולות לשבש את קישור הצבע לחלבון ולגרום לרגישות נמוכה. בסיום השטיפה השלישית, שפוך את המים מהצלוחית.

הג'ל מוכן כעת לצביעה. ראשית, נערו את תמיסת ה-Kumasi כדי לפזר את החלקיקים הקולואידיים באופן שווה. לאחר מכן, הוסיפו תמיסה בכמות מספקת כדי לכסות את הג'ל.

הניחו את הצלחת עם תמיסת ה-Kumasi כשהיא מכוסה. הניחו את הג'ל על שייקר וערבבו למשך שעתיים עד 12 שעות. לאחר 10 דקות, יופיעו נקודות החלבון הראשונות.

ניתן להגיע ל-80 עד מאה אחוזים מהצביעה בתוך שעתיים של אינקובציה. עם זאת, אנו ממליצים על אינקובציה למשך לילה כדי להגיע לצביעה קרובה ל-100%. כאשר הצביעה הושלמה, יש להסיר את תמיסת ה-Kamasi ולשטוף את הג'ל פעמיים במים מזוקקים מסוג Milli Q.

לאחר שטיפת הג'ל, הסר חלקיקי צבע שנדבקו לכלי הצביעה באמצעות נייר סופג ללא סיבים. הוסף לג'ל תמיסת הסרת צבע (destaining solution) והשאר ל-10 עד 60 דקות על השייקר. לבסוף, שטוף את הג'ל פעמיים במים מזוקקים מסוג Milli Q.

הג'ל יחזור לעוביו המקורי ועצימות הצבע של צביעת ה-kumasi תגבר. אם תפעלו לפי פרוטוקול זה, הג'ל הדו-ממדי שלכם אמור להיות מופרד בבירור וצבוע היטב עם כתמי חלבון כחולים כהים. תוצאת צביעת ה-kumasi שביצענו בג'לים דו-ממדיים דומה לזו של צביעת כסף.

בהתאם לפרוטוקול של Chef Chenko et al, אשר מדווח כבעל רגישות גבוהה ותאימות למספקטרומטריית מסות. באמצעות הדוגמה של אלקטרופורזה של ג'ל דו-ממדי, הראינו לכם כעת עד כמה תstaining ב-kangs cooma הוא מהיר, פשוט ורגיש. גביעת חלבונים בג'לי po acrylamide יכולה להסתיים בתוך שעתיים.

הפרוצדורה עצמה דורשת מעט עבודה. ולבסוף, ייתכן שתוכלו לזהות כמות קטנה של ננוגרם אחד של חלבון. לכן, פרוטוקול זה מהווה בהחלט חלופה טובה לשיטות ללא סימון של פרוטאומיקה מבוססת ג'ל.

בעת שימוש בפרוצדורת הצביעה, חשוב לזכור להשתמש בחומרים כימיים בדרגת ניתוח (analytical grade) ובמים בדרגת טהרה גבוהה ביותר. יתרה מכך, הוספה רצפית של הרכיבים לתמיסת הצביעה היא שלב קריטי בהכנה. לבסוף, אין לשכוח לשטוף ביעילות את שאריות ה-SDES מהג'לים לאחר ההפרדה האלקטרופורטית.

אחרת, לא תראו דבר על הג'לים שלכם. זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.