קבלת RNA איכות גבוהה מאוכלוסיות תא בודד בתוך רקמות המוח האנושי שלאחר המוות

אנו מתארים תהליך באמצעות לייזר ללכוד microdissection לבודד תמצית RNA מתוך אוכלוסייה הומוגנית תא, עצב פירמידליים, בשכבה III של gyrus הזמני מעולה במוח האנושי שלאחר המוות. לאחר מכן אנו להגביר באופן ליניארי (T7 מבוססי) mRNA, ועל להכליא את המדגם כדי האנושית Affymetrix X3P microarray.

הליך זה מתחיל בחיתוך שמונה בלוקים של רקמות קפואות אדי חנקן נוזלי מיקרומטר על קריוסטט המוגדר במינוס 17 מעלות צלזיוס על שקופיות זכוכית רגילות לא טעונות. לאחר מכן, החלקים מוכתמים בערכת צביעת הגנים של היסטו. לאחר זיהוי הנוירונים הפירמידליים, התאים כ-500 נלכדים בלייזר על מכסה לכידת HS.

המכסה עם התאים מונח בצינור מיקרו צנטריפוגה המכיל 50 מיקרוליטר של מאגר מיצוי הפוך ומונח בצינור פלקון שהוצב בעבר בעיראק, יושב באמבט מים מכוון ל-42 מעלות צלזיוס. לאחר שלב צנטריפוגה קצר מסירים את הכובע. לאחר מכן הפתרון הנותר מוכן לבידוד RNA.

היי, אני שרמיין פיטרסון מהמעבדה של וילסון וו במחלקה למדעי המוח המבניים והמולקולריים בבית החולים מקלין. היום אנו הולכים להראות לכם הליך ללכידת נוירונים פרמטאליים בלייזר מרקמת מוח אנושית לאחר המוות. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור ביטוי גנים דיפרנציאלי בממונים ובפיתול הגרוע של נבדקי סכיזופרניה באמצעות טכנולוגיית מיקרו-מערך.

אז בואו נתחיל. רקמות המוח התקבלו ממרכז משאבי רקמות המוח של הרווארד כבלוקים קפואים של אדי חנקן נוזלי לפני חתך הרקמות. חשוב להפחית את זיהום ה-RNA כל המשטחים, כולל אזור העבודה, להב החיתוך והמגלשות מטופלים בתמיסת טיהור RNA, כגון RNA SAP ומנוגבים ב-100% אתנול.

הליך זה מתחיל בחיתוך גושי רקמה קפואים של אדי חנקן נוזלי על קריוסטט המוגדר במינוס 17 מעלות צלזיוס על שקופיות זכוכית רגילות לא טעונות. חלקי הרקמה מוכנים כעת לזיהוי נוירונים פירמידליים באמצעות ערכת הצביעה המהירה של גן היסטו. הכן את סדרת התייבשות האתנול המכילה 25 מיליליטר מריכוזי האתנול המתאימים ומים נטולי RNA לצנצנות הצביעה המסופקות עם ערכת הגנים של היסטו.

מניחים את כל הצנצנות בדלי קרח למעט צנצנת אתנול אחת של 75%. מניחים את האתנול של 75% במקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו את תמיסת הצביעה על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של מעכב RNA לכל 100 מיקרוליטר של תמיסת צביעה.

מכיוון שנצבע ארבעה קטעי רקמה בשתי שקופיות, ארבעה מיקרוליטרים של מעכב RNA מתווספים ל-400 מיקרוליטר של תמיסת הצביעה בצינור מיקרו צנטריפוגה. שמור את תמיסת הצביעה על קרח. מתחת למכסה אדים.

הוסף מסננות מולקולריות לצנצנת הקסילן כדי להסיר עודפי מים, מה שעלול לפגוע בהרמת רקמות. הפעל את אמבט המים כשהטמפרטורה מוגדרת ל-42 מעלות צלזיוס והנח צינור פלקון בנפח 50 מיליליטר הנתמך על ידי מתלה באמבט המים. מוציאים שתי שקופיות מהמקפיא במינוס 80 מעלות צלזיוס ומפשירים אותן על מגבון קים.

למשך כ-30 שניות או רק עד שפינות השקופיות מתחילות להפשיר, קבע לזמן קצר את הרקמה באתנול 75% למשך 30 שניות במקפיא מינוס 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן בעזרת מלקחיים נטולי RNA, העבירו את השקופיות למים נטולי נוקלאז לשטיפה 32 לאחר שטיפת השקופיות, מתאר את החלקים עם עט מחסום PAP כדי לרכז את תמיסת הצביעה על הקטע מכתים את ארבעת החלקים בתמיסת צביעת הגן ההיסטו למשך 20 שניות. עם 97 מיקרוליטר של מעכב ה-RNA של חתך הכתם, בכל חתך, מייבשים את החלקים באתנול שהוכן קודם לכן על קרח למשך 30 שניות לכל שלב.

יש להאריך את השלב האחרון של 100% אתנול לשלוש דקות כדי להשיג התייבשות מספקת להרמת רקמות נאותה. לבסוף, טבלו את השקופיות בקסילן למשך חמש דקות, ואפשרו לשקופיות להתייבש לחלוטין באוויר לפני שתמשיכו ללכידת לייזר מיקרו-דיסקציה, יש להסיר את הנוירונים הפירמידליים מיד לאחר צביעת ההליך ללכידת לייזר תא בודד. MICRODISSECTION או LCM דורש אמבט מים של 42 מעלות צלזיוס המכיל צינור פלקון של 50 מיליליטר הנתמך על ידי a, שהוקם קודם לכן.

LCM תא יחיד מושג באמצעות מערכת לכידת הלייזר והתוכנה ARCTURUS XT. כדי להתחיל בהליך זה, טען את השקופיות והכובעים על מכשיר arcturus XT. השתמש במכסי HS לכידה, אך השאר את הגדרת התוכנית במאקרו.

לחץ על טעינת התיבה עם סקירה כללית כדי לקבל תמונת סקירה כללית של כל שקופית. כוונן את מיקוד הבהירות בהגדלה של פי שניים כדי לקבוע את הקטע האופטימלי לצילום לייזר. הימנע מקטעי רקמות עם קיפול מוגזם, אך בחר חלקים שלמים, חלקים ומוכתמים.

ובכן הניחו כובע על האזור הכללי שבו תלכדו, והקפידו לכלול את האזור שיש ללכוד במקרה שלנו. שכבה שלישית של קליפת המוח. ודא שמסילות המכסה אינן מונחות על קפלים כלשהם מכיוון שהדבר יטה את המכסה וכתוצאה מכך גדלי ספוט משתנים.

לאחר מכן, אשר את המיקום של נקודת לייזר ה-IR באופן ידני בהגדלה של פי 40. הצלב הכחול צריך להיות מרוכז בתוך נקודת הלייזר IR. אם לא, התאם את מיקומו על ידי לחיצה ימנית על הנקודה ובחירת נקודת IR ממוקמת.

בהגדלה של פי 40, זהה נוירונים פירמידליים על פי הקריטריונים הבאים, אחד שתאים את צורת הפירמידה שלנו ושניים, ניתן לזהות את החלק הפרוקסימלי של הדנדריטים האפיקליים או הבסיסיים. שמור את מיקום הכובע על ידי לחיצה על סימן הפלוס בפונקציית המיקום. בדרך זו, אם מכסים מוזזים, הם תמיד יחזרו בדיוק לאותה נקודה שעבורה התאמת את גודל הספוט.

הזן ערכים אלה בתיבת הבקרה 70 לכוח ו-16 למשך. מכיוון שפרמטרים אלה ספציפיים לרקמה שלנו, אנו ממליצים לבדוק ולהתאים למשתנים אלה בהתאם לדגימת הרקמה הספציפית שלך לפני שמתחילים. עם לכידת הלייזר של תאים בודדים, בטל את הלחיצה על אפשרות ההזזה האוטומטית של השלב וודא שסמל הגודל הנכון תואם את הסמל בלוח מימין.

בחר באפשרות העיגול בפינה השמאלית התחתונה כדי לבחור נוירון שברצונך לבדוק את הלכידה. ולאחר יישור הצלב הכחול עם העיגול, הפעל את הלייזר על ידי לחיצה על נקודת ה-IR לבדיקה. הנקודה שנוצרה על ידי הלייזר צריכה להיות ראשית טבעת כהה חדה סביב האובייקט שנלכד.

ודא שהטבעת גדולה מספיק כדי להקיף את התא, אך קטנה מספיק כדי שלא תכלול רקמות לא רצויות או תאים אחרים. אם הטבעת הזו קלה מדי, התא לא נלכד. אם יש כתם כהה באמצע הטבעת הכהה, משך הלוכסן בעוצמת הלייזר גדול מדי.

חזור על תהליך זה על חלקים שונים של הרקמה בתוך השכבה שברצונך ללכוד. כדי לבדוק שגודל הנקודה אינו משתנה בהתאם למיקום, התאם בהתאם. זהה נוירונים פירמידליים ללכידת כ-500 תאים.

לחץ על כפתור לכידת הלייזר כדי ללכוד תאים. העבר את המכסה לתחנת QC. ודאו שלפחות 90% מתאי העצב הוסרו.

אם לא, לכוד תאים נוספים באזור שבו נלכדו רוב התאים. הנח את המכסה לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר המכיל 50 מיקרוליטר של מאגר מיצוי. הפקק תוכנן כך שיתאים בצורה מושלמת כדי למנוע דליפת המאגר.

הפוך את המכלול הפוך, וודא שמאגר החילוץ מכסה את כל המכסה והנח אותו בתחתית צינור ה-Falcon בנפח 50 מיליליטר באמבט המים המוגדר ב-42 מעלות צלזיוס. דגרו את הנוירונים למשך 30 דקות כדי להסיר את הרקמה מהכובע לאחר הדגירה, צנטריפוגה, מכלול הצינור והכובע למשך שתי דקות ב-800 גרם. לאחר הצנטריפוגה, הסר את המכסה.

אם בידוד RNA יבוצע רק במועד מאוחר יותר. יש לאחסן את תמצית התאים הנותרת בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. אחרת המשך בבידוד RNA מתמצית התא כפי שמוצג בסעיף הבא, בידוד RNA מתבצע באמצעות ערכת הבידוד הטהורה של PICO, שנועדה לבודד מספר קטן של תאים מדגימות LCM ולשמור על mRNA בשפע נמוך.

כדי להתחיל בהליך זה, הוסף 70% אתנול המסופק עם הערכה לתמצית התא ולצנטריפוגה על עמודת טיהור מותנית מראש. על מנת לקשור את ה-RNA למסנן העמודה לאחר הכביסה, יש לטפל ב-RNA ב-D Ns כדי למנוע את הסיכון להפרעות DNA. שלב זה חשוב במיוחד ביישומים במורד הזרם כגון R-T-P-C-R בזמן אמת.

לאחר עיכול ה- DNA הוסף 40 מיקרוליטר של מאגר כביסה אחד וצנטריפוגה את עמוד הטיהור למשך 15 שניות ב 8, 000 Gs.לאחר מכן, המשך עם השטיפות על פי הפרוטוקול המצורף לערכה, אך הארך את שלב הכביסה הסופי עם מאגר כביסה שתיים בין שתיים לשתיים וחצי דקות כדי להבטיח שלא יישאר מאגר כביסה בעמודה, מה שיכול להפחית את תפוקת ה-RNA שלך. העבירו את העמודה לצינור מיקרו צנטריפוגה אחר. הוסף את המאגר האלוציאני ודגירה על המסנן בעמודה למשך דקה אחת צנטריפוגה את העמודה כדי להוציא את ה-RNA.

לבסוף, בדוק את איכות ה-RNA המופק על ידי הפעלת שבב מעבדה Experian High Sense, המספק ג'ל וירטואלי ופיפטת אלקטרופרוגרמה 1.3 מיקרוליטר מהדגימה לתוך שפופרת של 0.5 מיליליטר. לבדיקת בקרת האיכות, הקפיאו את שאר הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר אימות איכות ה-RNA, ניתן להגביר אותו על ידי תיוג והכלאה.

לניתוח פרופיל ביטוי גנים, יבוצעו שני סבבים של הגברה ליניארית עם ערכת ribo amp HS plus, שאמורה לגרום לכ-50 מיקרוגרם של RNA מוגבר המספיקים לביצוע ניסויי מיקרו-מערך ו-Q-R-T-P-C-R. ערכת התיוג והתיוג של טורבו ביוטין ממכשירים מולקולריים משמשים לתיוג ה- RNA המוגבר. לבסוף, יבוצע פרופיל ביטוי גנים באמצעות שבב הגן האנושי X three P pro beret מבית atrix.

חיתוך רקמות צריך לגרום לשתי שקופיות עם שני חלקים לכל שקופית, ארבעה חלקים בסך הכל לכל מקרה. כל חלק צריך להיות חלק עם מינימום קריעה, סדקים או קיפול. הנוירונים הפירמידליים צריכים להיות מוכתמים כהה בגודל של 20 עד 25 מיקרומטר עם צורה פירמידלית ודנדריטים אפיקליים גלויים.

במהלך LCM, לאחר שהלייזר פועם דרך הסרט התרמופלסטי, התאים נצמדים לכובע ולכן אינם עוד על המגלשה ומשאירים את הרקמה שמסביב. מאחורי כ-85 עד 100% מהנוירונים צריכים להיצמד לכובע עם מכסי ה-HS של הלכידה בהגדרות המאקרו והתאמה נכונה של עוצמת הלייזר ועוצמתו. עבור כל סעיף, עליך להשיג כ-500 עד 700 תאים לכל חתך, וכתוצאה מכך לפחות 500 פיקוגרם של סך ה-RNA לכל מארז.

לאחר בידוד RNA מלא, איכות ה-RNA מוערכת באמצעות אלקטרופרוגרמה וג'ל וירטואלי באמצעות BioRad Experian. באלקטרופרוגרמה, אתה אמור לראות שתי פסגות נפרדות המתאימות ליחידות ה-RNA הריבוזומלי של 18 שניות ו-20 שניות עם רקמה שלאחר המוות. עם זאת, זה לא תמיד המקרה מכיוון שהרקמה עלולה להתפרק עקב גורמים לפני החיתוך.

בדרך כלל תראה בליטה גדולה המעידה על השפלה עם שיא גדול בסביבות 18 שניות ושיא קטן יותר של 28 שניות כפי שמצוין על ידי החצים האדומים. לעומת זאת, RNA באיכות גרועה עם השפלה רבה מדי יצוין על ידי אלקטרופרוגרמה עם שטח גדול מתחת לעקומה שלה. בנוסף להורדת הילוך במיקום ההתפשטות כדי לבדוק את איכות ה-mRNA לאחר שני סבבים של הגברה ליניארית, אנו משתמשים הן בשבב המעבדה הסטנדרטי BioRad Experian והן בספקטרופוטומטר NanoDrop.

טכנולוגיית המיקרו-מערך המסורתית של Atrics דורשת שהתפשטות תעתיק ה-mRNA תהיה באורך של לפחות 600 נוקלאוטידים על מנת להיות מזוהה בפרוטוקול זה. התפשטות ה-mRNA הגיעה לטווח של 1000 נוקלאוטידים כפי שמצוין על ידי האלקטרופרוגרמה עם פסגות גדולות היורדות לאט לאט כפונקציה של זמן. תוצאה זו מאושרת גם על ידי הג'ל הווירטואלי.

אם אורכי התעתיק קצרים מ-600 נוקלאוטידים, אין לכלול את הדגימה לצורך הכלאה, קריאות ה-NanoDrop הצביעו על ממוצע של 2 60 על פני יחס של 2.5 80 או טוהר של 2.5 על פני דגימות. הריכוז הממוצע היה 1.7 מיקרוגרם למיקרוליטר, וכתוצאה מכך כ-50 מיקרוגרם של mRNA לדגימה, מספיק הן לניתוח מיקרו-מערך והן לאימות לאחר מכן, הדורש בין 15 ל-20 מיקרוגרם של mRNA ואימות לאחר מכן של התוצאות עם QR TPCR. התוצאות שלנו מצביעות על כך שעם פרוטוקול זה, הן הכמות והן האיכות של ה-RNA המתקבל טובות מספיק כדי לחקור הבדלים בביטוי גנים באמצעות שבב atrix human X three P.

לאחר הכלאה לשבב Atrics Human X three P, השגנו אחוז קריאות של 26.6% בממוצע המצביע על הכלאה ועוצמות בדיקה נאותות. זה עתה הראינו לכם כיצד ללכוד בלייזר נוירונים פרמטאליים מרקמת מוח אנושית לאחר המוות כדי להשתמש ברנ"א המתקבל מהתאים האלה. עבור מחקרי פרופיל מיקרו-מערך G בעת ביצוע הליך זה, חשוב לבצע את כל השלבים בסביבה נטולת RNA ולהשלים את השלבים בזמן על מנת לשמור על שלמות ה-RNA.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.