קבלת RNA איכות גבוהה מאוכלוסיות תא בודד בתוך רקמות המוח האנושי שלאחר המוות

התהליך מתחיל בחיתוך של בלוקים של רקמה שהוקפאו באדי חנקן נוזלי, בעובי של 8 מיקרון, באמצעות קריוסטט המכוון למינוס 17 מעלות צלזיוס, על גבי שקופיות זכוכית פשוטות ללא מטען. לאחר מכן, הצביעות נצבעות באמצעות ערכת צביעת histo gene. לאחר זיהוי הנוירונים הפירמידליים, כ-500 תאים נלכדים באמצעות לייזר אל תוך מכסה הלכידה HS.

הפקק עם התאים מוצב בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה המכילה 50 µL של בופר מיצוי, מועמד הפוך ומונח בתוך מבחנת Falcon שמיקמה מראש בתוך מקלח מים שחומם ל-42 °C. לאחר שלב צנטריפוגה קצר, מסירים את הפקק. התמיסה שנותרה מוכנה כעת לבידוד RNA.

שלום, אני שארמיין פטרסון מהמעבדה של וילסון וו במחלקה למדעי העצבים המבניים והמולקולריים בבית החולים מקליאן. היום נראה לכם הליך לדגימה בלייזר (laser capturing) של נוירונים פראמטליים מרקמת מוח אנושית לאחר המוות. אנו משתמשים בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור ביטוי גנים דיפרנציאלי ב-superior and poor gyrus של נבדקים עם סכיזופרניה באמצעות טכנולוגיית מיקרו-מערכים (microarray).

אם כך, נתחיל. רקמות מוח התקבלו ממרכז משאבי רקמות המוח של הרווארד (Harvard Brain Tissue Resource Center) כבלוקים שהוקפאו באדי חנקן נוזלי לפני חיתוך הרקמה. כדי לצמצם את זיהום ה-RNAs, חשוב לטפל בכל המשטחים, כולל אזור העבודה, להב החיתוך והשקופיות, בתמיסה לדה-קונטמינציה של RNA, כגון RNA SAP, ולנגב אותם ב-100% ethanol.

ההליך מתחיל בחיתוך בלוקים של רקמה שהוקפאו באדי חנקן נוזלי באמצעות קריוסטט המכוון למינוס 17 מעלות צלזיוס, על גבי שקף זכוכית רגיל ללא מטען. חיתוכי הרקמה מוכנים כעת לזיהוי נוירונים פירמידליים באמצעות ערכת הצביעה המהירה histo gene. להכנת סדרת התייבשות באתנול, יש להקצות 25 מיליליטר של ריכוזי האתנול המתאימים ומים נקיים מ-RNA אל תוך צנבקי הצביעה המסופקים בערכת ה-histo gene.

הנח את כל הצנצנות בתוך דלי קרח, למעט צנצנת אחת של 75% ethanol. הנח את צנצנת ה-75% ethanol במקפיא בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius. לאחר מכן, הכן את תמיסת הצביעה על ידי הוספת 1 µL של מעכב RNA לכל 100 µL של תמיסת צביעה.

מכיוון שנסמן ארבעה חתכי רקמה על שתי זכוכיות, מוסיפים 4 µL של מעכב RNA ל-400 µL של תמיסת הצביעה בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה. יש לשמור את תמיסת הצביעה על קרח. יש לעבוד תחת מ㠃 פuming (fume hood).

הוסיפו נשאי מולקולריים (molecular sieves) לצנצנת ה-xylene כדי להסיר עודפי מים, שעלולים לפגוע בהרמת הרקמה. הפעילו את מקבץ המים כאשר הטמפרטורה מכוונת ל-42 °C והניחו מבחנת Falcon של 50 ml נתמכת על ידי מעמד בתוך מקבץ המים. הוציאו שתי שקופיות מהמקפיא בטמפרטורה של 80- °C והפשירהן על נייר Kim wipe.

במשך כ-30 שניות, או עד שפינות השקופיות יתחילו להפשיר, קבעו את הרקמה לזמן קצר ב-75% ethanol למשך 30 שניות במקפיא בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius. לאחר מכן, בעזרת פינצטה נקייה מ-RNA, העבירו את השקופיות למים נקיים מנוקלאז (nuclease free water) לשטיפה של 30 שניות. לאחר שטיפת השקופיות, סמנו את מסביב לחתכים בעזרת עט PAP barrier כדי לרכז את תמיסת הצביעה על החתך, וצבעו את ארבעת החתכים עם תמיסת הצביעה histo gene למשך 20 שניות. בעזרת 97 µL של צבע/מעכב RNA לכל חתך, בצעו דהידרציה לחתכים בתוך ה-ethanol שהוכן מראש על קרח, למשך 30 שניות בכל שלב.

יש להאריך את השלב האחרון של 100% ethanol לשלוש דקות כדי להשיג דהידרטציה מספקת להרמה הולמת של הרקמה. לבסוף, טבול את השקופיות ב-xylene למשך חמש דקות, והשאר את השקופיות להתייבש לחלוטין באוויר לפני המעבר ל-laser capture microdissection; יש להוציא את הנוירונים הפירמידליים מיד לאחר הצביעה כחלק מהפרוצדורה ל-single cell laser capture MICRODISSECTION או LCM, הדורשת אמבט מים בטמפרטורה של 42 °C המכיל מבחנה מסוג Falcon של 50 milliliter הנתמכת על ידי מעמד, שהוכנה מוקדם יותר.

ביצוע LCM של תא בודד מתבצע באמצעות מערכת התוכנה והלייזר ARCTURUS XT. כדי להתחיל בהליך זה, טענו את השקופיות ואת המכסים למכשיר ה-arcturus XT. השתמשו במכסי capture HS, אך השאירו את הגדרות התוכנית על macro.

לחצו על תיבת הטעינה עם הסקירה הכללית כדי לקבל תמונת סקירה של כל שקופית. כוונו את הפוקוס והבהירות בהגדלה של 2x כדי לקבוע את הנתח האופטימלי עבור לכידה בלייזר. הימנעו מנתחי רקמה עם קיפולים מרובים, ובחרו בנתחים שלמים, חלקים וצבועים.

הנח את המכסה מעל האזור הכללי שבו תבצע את הלכידה, וודא כי השטח המיועד ללכידה כלול בתוכו; במקרה שלנו, שכבה שלוש של קליפת המוח (cortex). וודא שפסי המכסה אינם נשענים על קפלים כלשהם, שכן הדבר יגרום להטיית המכסה ולהשגת גדלי נקודות משתנים.

בשלב הבא, אששו ידנית את מיקומו של נקודת לייזר ה-IR בהגדלה של 40 x. על הצלב הכחול להיות ממורכז בתוך נקודת לייזר ה-IR. אם לא, התאימו את מיקומו על ידי לחיצה ימנית על הנקודה ובחירה ב-located IR spot.

בהגדלה של 40x, זהו נוירונים פירמידליים על פי הקריטריונים הבאים: ראשית, תאים בעלי צורה פירמידלית, ושנית, ניתן לזהות את החלק הפרוקסימלי של הדנדריטים האפיקליים ו/או הבזאליים. שמור את מיקום ה-cap על ידי לחיצה על סימן הפלוס בפונקציית המיקום. באופן זה, אם ה-cap יזוז, הוא תמיד יחזור בדיוק לאותה נקודה עבורה כווננת את גודל הנקודה.

הזינו ערכים אלו לתיבת הבקרה: 70 עבור העוצמה (power) ו-16 עבור המשך (duration). מכיוון שפרמטרים אלו ספציפיים לרקמה שלנו, אנו ממליצים לבחון ולהתאים משתנים אלו לפי דגימת הרקמה הספציפית שלכם לפני התחלת העבודה. בעת לכידה של תאים בודדים באמצעות הלייזר, בטלו את הסימון של אפשרות הזזת הבמה האוטומטית (auto move stage) וודאו שסמל הגודל הנכון תואם לסמל המופיע בפאנל מימין.

בחרו באפשרות העיגול בפינה הימנית התחתונה כדי לבחור נוירון שתרצו לבחון את הלכידה שלו. לאחר יישור הצלב הכחול עם העיגול, הפעילו את הלייזר על ידי לחיצה על test IR spot. הנקודה שנוצרה על ידי הלייזר צריכה להציג תחילה טבעת כהה וחדה מסביב לאובייקט הנלכד.

ודאו שהטבעה גדולה מספיק כדי להקיף את התא, אך קטנה מספיק כדי שלא תכלול רקמה בלתי רצויה או תאים אחרים. אם הטבעה בהירה מדי, התא לא נלכד. אם יש נקודה כהה במרכז הטבעה הכהה, הרי שחוזק הלייזר או משך פעולתו היו גבוהים מדי.

חזור על תהליך זה בחלקים שונים של הרקמה בתוך השכבה שברצונך לדגום. כדי לוודא שגודל הנקודה אינו משתנה בהתאם למיקום, בצע התאמות בהתאם. זהה כ-500 נוירונים פירמידליים לצורך דגימה.

לחצו על כפתור לכידת הלייזר כדי ללכוד תאים. העבירו את המכסה לתחנת ה-QC. ודאו שלפחות 90% מהנוירונים הוסרו.

אם לא, לכדו תאים נוספים באזור שבו נלכדו רוב התאים. העבירו את המכסה לתוך מבחנה מיקרו-צנטריפוגית בנפח 0.5 milliliter המכילה 50 microliters של תמיסת מיצוי (extraction buffer). המכסה תוכנן להתאים באופן מושלם כדי למנוע דליפה של התמיסה.

הפכו את המכלול, וודאו שבאפר המיצוי מכסה את כל המכסה, והניחו אותו בתחתית של מבחירת פלקון בנפח 50 מיליליטר במקלח מים שמוגדר ל-42 °C. דגרו את הנוירונים למשך 30 דקות כדי להסיר את הרקמה מהמכסה. לאחר הדגירה, סבבו במערך צנטריפוגה את המבחנה והמכסה למשך שתי דקות ב-800 g. לאחר הסבב, הסירו את המכסה.

אם בידוד ה-RNA יבוצע רק במועד מאוחר יותר, יש לאחסן את תמצית התאים הנותרת בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. אחרת, יש להמשיך בבידוד ה-RNA מתמצית התאים כפי שמוצג בסעיף הבא; בידוד ה-RNA מבוצע באמצעות ערכת הבידוד PICO pure, שנועדה לבודד מספרים קטנים של תאים מדגימות LCM ולשמר mRNA בריכוז נמוך.

כדי להתחיל בהליך זה, יש להוסיף את ה-70% ethanol המסופק בערכה לתמצית התאים ולצנטריפוגה בעמודה לניקוי שעברה התנייה מוקדמת. כדי לקשור את ה-RNA למסנן העמודה לאחר השטיפה, יש לטפל ב-RNA באמצעות DNase כדי לבטל את הסיכון להפרעה של DNA. שלב זה חשוב במיוחד ביישומים המשכיים כגון real-time R-T-P-C-R.

לאחר עיכול ה-DNA, הוסף 40 µL של wash buffer one וסבב את עמודת הניקוי בצנטריפוגה למשך 15 שניות ב-8,000 Gs. לאחר מכן, המשך בשטיפות בהתאם לפרוטוקול המצורף לערכה, אך הארך את שלב השטיפה הסופי עם wash buffer two משתי דקות לשתי דקות וחצי כדי להבטיח ששום תמיסת שטיפה לא נשארת בעמודה, דבר שעלול להפחית את תבואת ה-RNA. העבר את העמודה למבחנת מיקרו-צנטריפוגה אחרת. הוסף את תמיסת an elution buffer והדגרה על המסנן בעמודה למשך דקה אחת, ולאחר מכן סבב את העמודה בצנטריפוגה כדי להפיק את ה-RNA.

לבסוף, בדקו את איכות ה-RNA שהוצא על ידי הרצת שבב מעבדה מסוג Experian High Sense, המספק ג'ל וירטואלי ואלקטרופורוגרמה; פלפלו 1.3 µL מהמדגם אל תוך מבחנה של 0.5 mL. עבור בדיקת בקרת האיכות, הקפיאו את שאר המדגם בטמפרטורה של 80°C-. לאחר שאיכות ה-RNA אומתה, ניתן להגבירו, לסמן אותו ולבצע היברידיזציה.

עבור ניתוח פרופיל ביטוי גנים, יבוצעו שני סבבים של הגברה ליניארית באמצעות ערכת ribo amp HS plus, אשר צפויים להוביל לכ- 50 micrograms של RNA מוגבר, כמות המספיקה לביצוע ניסויי microarray ו-Q-R-T-P-C-R. לסימון ה-RNA המוגבר משמשת ערכת turbo biotin labeling kit and labeling מבית Molecular Devices. לבסוף, יבוצע ניתוח פרופיל ביטוי גנים באמצעות ה-human X three P gene chip pro beret מבית Atrix.

חיתוך הרקמה צריך להסתיים בשתי שקופיות עם שניים חיתוכים לכל שקופית, ארבעה חיתוכים בסך הכל לכל מקרה. כל חיתוך צריך להיות חלק עם מינימום קרעים, סדקים או קיפולים. הנוירונים הפירמידליים צריכים להיות צבועים בצבע כהה, בגודל של כ-20 עד 25 micrometers, בעלי צורה פירמידלית ודנדריטים אפיקליים נראים.

במהלך LCM, לאחר פולס הלייזר דרך קולקול הטרמופלסטי, התאים נצמדים למכסה ולפיכך אינם נמצאים עוד על הפיתחית, בעוד שהרקמה הסובבת נשארת מאחור. בשימוש במכסי HS למלכוד במיגדרים מאקרויים ובכיוון נכון של עוצמת הלייזר וכוחו, כ-85 עד 100% מהנוירונים צריכים להיצמד למכסה. עבור כל חתך, יש להשיג כ-500 עד 700 תאים, מה שיניב לפחות 500 picograms של total RNA לכל מקרה.

לאחר בידוד RNA כולל, איכות ה-RNA מוערכת באמצעות אלקטרופורוגרמה וג'ל וירטואלי באמצעות מערכת BioRad Experian. באלקטרופורוגרמה, ניתן לראות שני שיאים נפרדים המתאימים ליחידות ה-ribosomal RNA 18 s ו-20 a s ברקמות לאחר המוות. עם זאת, אין זה תמיד המצב, שכן הרקמה עלולה להיות מעוכבת בשל גורמים שהתרחשו לפני החיתוך.

בדרך כלל תראו בליטה גדולה המעידה על דגרדציה, עם פיסגה גדולה סביב 18 s ופיסגה קטנה יותר של 28 s, כפי שמוצג על ידי החצים האדומים. לעומת זאת, RNA באיכות נמוכה עם דגרדציה מרובה יתבטא באלקטרופורוגרמה עם שטח גדול תחת העקומה. בנוסף להזזה כלפי מטה במיקום הפיזור כדי לבחון את איכות ה-mRNA לאחר שני סבבים של הגברה ליניארית, אנו משתמשים הן בצ'יפ BioRad Experian standard Sense lab והן בספקטרופוטומטר NanoDrop.

טכנולוגיית המערכים של Atrics המסורתית דורשת שהפריסה של תמלילי ה-mRNA תהיה באורך של לפחות 600 נוקלאוטידים כדי שניתן יהיה לזהותה באמצעות פרוטוקול זה. פריסת ה-mRNA הגיעה לטווח של 1000 נוקלאוטידים, כפי שעולה מהאלקטרופורוגרם, שבו נראים שיאים גבוהים היורדים בהדרגה כפונקציה של הזמן. תוצאה זו מאושרת גם על ידי הג'ל הווירטואלי.

אם אורך התמלילים קצר מ-600 נוקלאוטידים, אין לכלול את הדגימה. עבור ההכשרה להיברידציה, קריאות ה-NanoDrop הראו יחס ממוצע של 260 ל-280, המעיד על רמת טהרה של 2.5 בין הדגימות. הריכוז הממוצע היה 1.7 µg/µL, מה שהביא לכ-50 µg של mRNA לדגימה, כמות המספיקה הן לניתוח במערך מיקרו (microarray) והן לאישוש עוקב של התוצאות באמצעות qRT-PCR, הדורש בין 15 ל-20 µg של mRNA. התוצאות שלנו מצביעות על כך שבשימוש בפרוטוקול זה, הן הכמות והן האיכות של ה-RNA שהתקבל טובות מספיק כדי לבחון הבדלים בביטוי גנים באמצעות שבב ה-atrix human X3P.

לאחר היברידיזציה לשבב Atrics Human X three P, השגנו אחוזי קריאה (percent calls) ממוצעים של 26.6%, המעידים על היברידיזציה ועוצמות פרובים נאותות. הרגשנו להדגים לכם כיצד לבצע לכידה בלייזר (laser capture) של נוירונים פרא-מטליים מרקמת מוח אנושית לאחר המוות, במטרה להשתמש ב-RNA שהופק מתאים אלו. בעת ביצוע הליך זה למחקרי פרופיל גנטי באמצעות מיקרו-מערכים (microarray G profiling), חשוב לבצע את כל השלבים בסביבה נקייה מ-RNase ולהשלים את השלבים בלוח זמנים מהיר כדי לשמור על שלמות ה-RNA.

זהו זה. תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים שלכם.