Gene Expression גלובל ניתוח באמצעות פלטפורמה דג הזברה microarray oligonucleotide
10 באוגוסט 2009
Microarrays ג'ין הם כלים רבי עוצמה באפיון ביטוי גנים ברמת הגנום כולו. טכנולוגיה זו יישומים במגוון רחב של תחומים לרבות ביולוגי ביולוגיה התפתחותית הרעלים. בסרטון הזה, אנחנו פרט פרוטוקול ניתוח ביטוי גנטי גלובלי באמצעות פלטפורמה מקיפה microarray oligonucleotide על דג הזברה.
הליך זה מתחיל עם cDNA שסונתז מתבנית של RNA באיכות גבוהה. תחילה מסמנים את ה-cDNA באמצעות הצבע הפלואורסצנטי Cy3. עם השלמת תגובת הסימון, מנקים ומבודדים את ה-cDNA המסומן, ומעריכים את איכות תגובת הסימון.
ה-CDNA המסומן עובר היברידיזציה על גבי מערך זעיר (microarray). לאחר ההיברידיזציה, המערכים מנותחים כדי לקבוע את רמות הביטוי הגני היחסיות בדגימות. שלום, שמי סם פטרסון מהמעבדה של ד"ר ג'ניפר פרימן בבית הספר למדעי הבריאות באוניברסיטת פורדו.
בעבר הדגמנו כיצד להפיק RNA מעוברי דג zebrafish ולהפוך RNA זה ל-CDNA. היום נציג את הפרוצדורה לסימון והibridiization של CDNA זה על פלטפורמת microarray של oligonucleotides עבור zebrafish, במטרה לחקור פרופילי ביטוי גנתי גלובליים. בדרך כלל, אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי לחקור ביטוי גנתי דיפרנציאלי בתגובה לחשיפה לרעלן.
אם כן, נתחיל. ניסוי המיקרו-מערך דורש סביבה בעלת תאורה מינימלית כדי למנוע דהייה פוטוכימית של הצבע הפלואורסצנטי Cy3 המשמש לסימון. כדי להתחיל בסימון ה-CDNA באמצעות Cy3, השתמש ברכיבים הבאים מתוך מערכת הסימון הגנומי BioPrime Array CGH: בופר random primer בריכוז 2.5x, תערובת dCTP בריכוז 10X ומים ללא נוקליאז. בנוסף, הפשר את מלאי ה-dCTP המסומן ב-Cy3 בריכוז 1 mM. לאחר ההפשרה, סובב קצרת בצנטריפוגה את הריאגנטים ושלב אותם בתוך מבחנה בעלת דפנות עבות בנפח 0.6 ml.
500 nanograms של CDNA, 40 µL, 2.5 x random primer buffer ומים נקיים מנוקלאז (nuclease free water) להשגת נפח כולל של 86 µL. ערבבו היטב וסובבו קצרות בצנטריפוגה, ולאחר מכן דגרו את התגובה בטמפרטורה של 100 °C בטרמוסייקלר למשך חמש דקות. בסיום הדגירה, העבירו מיד את התגובה לאמבט קרח למשך 10 דקות.
בשלב הבא, הוציאו את ה-exo DNA polymerase מהמקפיא והניחו על קרח. לאחר מכן, הוסיפו למבחנת התגובה 10 µL של 10 X-D-C-T-P Mix, 2 µL של SI 3D CTP בריכוז 1 mM ו-2 µL של XO cleanout DNA polymerase. ערבבו היטב וסובבו קצרת במערך צנטריפוגלי. לבסוף, דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 °C למשך 16 שעות בטרמוסייקלר עד לסיום הסימון.
המשיכו לניקוי ולהשקעה של ה-CDNA המסומן. כדי להתחיל בניקוי ה-CDNA המסומן, הכניסו עמודת MicroCon לתוך מבחנה של 1.5 milliliter.
הוסיפו 300 µL של 0.1 XSSC לעמודה ולאחר מכן הוסיפו את תגובת הסימון. סובבו את העמודה בצנטריפוגה ב-16,100 G למשך 10 דקות ב-4 °C. שימו לב שהנוזל העובר עשוי להיות בצבע ורוד בהיר.
שפכו את הנוזל שעבר דרך העמודה והוסיפו לעמודה 300 microliters נוספים של 0.1 XSSC. לאחר מכן, חזרו על הסבוב ב-16,100 G למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius. שפכו שוב את הנוזל שעבר והוסיפו לעמודה 300 microliters נוספים של 0.1 XSSC; כעת סובבו בצנטריפוגה ב-16,100 G למשך 12 דקות בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius לאחר שטיפה אחרונה זו.
הנוזל העובר (flow through) צריך להיות צלול, וניתן לראות את ה-CDNA המסומן בוורוד על העמודה. שוב, השליכו את הנוזל העובר משטיפה סופית זו כדי להפריד את ה-CD NA המסומן. הוסיפו 100 µL מים נקיים מנוקליאז (nuclease free water) לעמודה. הוציאו את העמודה מתוך מבחנת המיקרו-צנטריפוגה והפכו אותה לתוך מבחנה חדשה.
לאחר מכן, סובב במערך צנטריפוגה את העמודה ההפוכה ב-2,300 G למשך שתי דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. ה-CDNA המסומן מומס במים בתחתית המבחנה. בדוק את ה-CDNA שהתקבל באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop ND 1000 בהתאם להוראות היצרן.
חשבו את ריכוז ה-DNA והעריכו את שילוב הצבע כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף. אם ה-CDNA מסומן מספיק, העבירו ששה מיקרוגרמים למבחנה חדשה כדי להשקיע את תערובת ה-CD NA המסומנת ב-0.1 x נפח של נתרן אצטט בריכוז שלושה מולר ב-pH 5.2 ונפח של one x של Isopropanol, תוך דגירה בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
יש לזכור כי כל השלבים עד כה בוצעו בסביבה עם תאורה מינימלית. לאחר מכן, יש לסבב את הדגימה בצנטריפוגה ב-16,100 G למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, יש להסיר בזהירות את הנוזל העליון (SUP natant) מבלי להשפיע על משקע ה-DNA, שצבעו ורוד.
לבסוף, שטפו על ידי הוספת 500 µL של 70% ethanol וערבבו באמצעות היפוך עדין, ולאחר מכן צנטריפוגו ב-16,100 G למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, הסירו את הנוזל העליון (supernatant), הפכו את המבחנה והניחו למשקע להתייבש למשך חמש דקות. ה-CDNA המסומן מוכן להיברידיזציה.
לפני תחילת ההכלאה, הפעילו את מערכת ההכלאה של nimble gen והמתינו עד שתגיע לשיווי משקל בטמפרטורה של 42 °C. התחילו בהמסה של כדור ה-CD NA המסומן בחמישה µL של מים נקיים מנוקלאז (nuclease free water). הוסיפו רכיבי הכלאה מהערכה Roche Nimble Gen Hybridization kit – באפר הכלאה hybrid A ואוליגו יישור (alignment oligo) – עד לנפח כולל של 18 µL, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף.
ערבבו היטב וסבבו את המבחנה לזמן קצר במצנטרגה כדי לרכז את התוכן בתחתית. לאחר מכן, דנטורציה של ה-CDNA המסומן על ידי הנחת המבחנה בטמפרטורה של 95 °C למשך חמש דקות. העבירו מיד את המבחנה למערכת ההיברידיזציה nimble gen עד להכנת המערכים.
שים לב כי המערכים המיקרוסקופיים (microarrays) דורשים טיפול ואחסון זהירים. מערכי Roche nimble gen מאוחסנים בחושך עם חומר מייבש בטמפרטורת החדר. טען את המערך למכשיר יישור מערבב הדיוק (precision mixer alignment tool).
העמס את ה-mixer של PMA T לתוך ה-PMA T והסר את פס הדבק באמצעות פינצטה. כאשר המערך וה-mixer מוכנסים, סגור את ה-PMA T בצורה מאובטחת. לאחר מכן, נתק את המערך ואת ה-mixer מה-PMA T על ידי הפעלת לחץ על ה-mixer דרך החור ב-PMA t.
לבסוף, השתמשו בגלגלת (brayer) כדי להפעיל לחץ מסביב לחלק החיצוני של המערבל, על מנת לוודא שהמערך אטום ולהסיר בועות אוויר. לאחר מכן, הניחו את קומפלקס מערבל המערך על מערכת ההיברידיזציה לחימום, כדי להטעין את דגימת ה-CDNA אל המערך. השתמשו בבקר ההעתקה (displacement perpet) באיטיות ובלחץ קבוע.
הוסיפו 15 µL מהדגימה המסומנת לפתח המילוי במרכז המערבל. נגבו שאריות דגימה מחורי הפתח ואטמו אותם באמצעות רצועות דביקות. לאחר מכן, סגרו את התפס.
כעת התחילו לערבב את תמיססת ההיברידיזציה באמצעות תוכנית B במערכת ההיברידיזציה של nimble gen. הניחו למערך המיקרו-מערך (microarray) לעבור היברידיזציה למשך 16 עד 20 שעות. לאחר ההיברידיזציה, המיקרו-מערך יישטף וייסרק כאשר תהליך ההיברידיזציה יגיע לסיומו. הכינו את הסריקה על ידי הדלקת סורק המערכים gene picks 4, 000 B והניחו לו להתחמם למשך כ-15 דקות.
בשלב הבא, הכין תמיססי שטיפה אחד A, אחד B, שניים ושלוש כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב המצורף. חמם מראש את תמיסס השטיפה אחד A ל-42 °C, אך השאר את שאר התמיססים בטמפרטורת החדר. כאשר תמיסס השטיפה אחד A יגיע לטמפרטורה הרצויה, שפוך אותו לתוך צלחת.
טבול מתקן שקופיות בבופר שטיפה 1 B. כעת הוצא את קומפלקס מערבב המערך ממערכת ההיברידיזציה NimbleGen והחלק אותו לתוך הג'יג. התחל את השטיפה על ידי טבילת המכלול בבופר שטיפה 1 A שחומם מראש, והסר בזהירות את המערבב על ידי קילופו מהשקופית. לאחר מכן, הוצא את המערך מהג'יג ונער אותו במשך 15 שניות בבופר שטיפה 1 A. העבר במהירות את המערך למתקן שקופיות הטבול בבופר שטיפה 1 B ונער את מתקן השקופיות בעוצמה למשך שתי דקות.
לאחר מכן, העבירו את מתקן השקופיות לתוך תמיסת השטיפה השנייה וערבבו במשך דקה אחת. לבסוף, העבירו את מתקן השקופיות לתוך תמיסת השטיפה השלישית וערבבו במשך 15 שניות. השלימו את שלבי השטיפה על ידי העברת המערך לצנטריפוגת ייבוש שקופיות וסובבו במשך שתי דקות לאחר הצנטריפוגציה.
סרוק את המערך באופן מיידי מכיוון שה-D רגישה לאור ולאוזון; התחל את הסריקה על ידי טעינת המערך עם הברקוד כלפי מטה לתוך סורק המערכים gene picks 4, 000 B. בתיבת הדו-שיח של הגדרות החומרה, קבע עבור הלייזר בעל 532 nanometer ערך PMT של 500, הגדר את העוצמה ל-100%, את גודל הפיקסל לחמישה מיקרונים, את מספר השורות לממוצע ל-1 ואת מיקום המיקוד ל-0 מיקרונים. עם השלמת ההגדרות, בצע תצוגה מקדימה של המערך.
בחרו אזור לסריקה ולאחר מכן סרקו אותו. עם השלמת הסריקה, בדקו את ההיסטוגרמה של התמונה. באופן אידיאלי, ערך של E מינוס חמישה בספירות מנורמלות צריך להיות בגבול הרוויה של 65,000, מה שמעיד על כך שבערך 1% עד 2% מהמאפיינים נמצאים ברוויה.
אם הספירות הנורמליזיות נמוכות מ-1E-5, הגבירו את הגבירה של ה-PMT וסרקו מחדש את השקופית. אם הספירות הנורמליזיות גבוהות מ-1E-5, הנמיכו את הגבירה של ה-PMT וסרקו מחדש את השקופית, שמרו את התמונה והשתמשו בתוכנה לניתוח נתונים לצורך נורמליזציה של הנתונים וחישוב ערכי העוצמה. תגובת הסימון מניבה באופן שגרתי לפחות 10 µg של cDNA מסומן.
ניתן לחשב את שילוב הצבע באמצעות יחס צבע בסיסי פשוט, שבו היחס בין הנוקלאוטיד ל-SI three שווה ליחס בין A two 60 ל-a five 50 כשהוא מוכפל ב-23.15. תגובה טובה תניב ערך שבין 50 ל-80. היברידיזציה מקובלה תהיה בעלת 1% עד 2% מהמאפיינים הרוויים.
ערכי ספירה מנורמלים של 1E-5 בגבול הרוויה של 65,000. כאשר ערך ה-PMT נקבע, בסביבות 500, ניתן להעריך באופן איכותי גם את איכות ההיברידיזציה על ידי צפייה בתמונה הסרוקה של המיקרומערך והערכת העוצמה של האוליגואים המסודרים ביחס למאפיינים אחרים במערך. יש לבחון את התמונה הסרוקה גם לאיתור נקודות ספציפיות או כתמי אבק בתוך שטח המערך.
בניתוח המשכי, ניתן להשתמש בתרשים פיזור כדי להמחיש את הנתונים המנותחים, על מנת לקבוע את רמות הביטוי היחסי של הגנים בדגימות ולזהות גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי. גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי יסטו באופן משמעותי מקו המגמה. בהליך משלים, הצגנו כיצד למצות RNA מעוברי דגי ปลา זברה (zebrafish) ולסנתז cCDNA. כאן הצגנו כיצד לסמן ולהכליל (hybridize) cDNA על פלטפורמת מערך מיקרו-אוליגנוקלאוטידים כדי לחקור פרופילי ביטוי גנים גלובליים.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, זכרו תמיד להשתמש ב-CD NA באיכות גבוהה ולהימנע מחשיפת הצבע השלישי (site three dye) לתאורה ישירה. זה הכל. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מדגים את התהליך של ניתוח ביטוי גנים גלובלי באמצעות פלטפורמת מערך ז probes (microarray) של אוליגונוקליאוטידים הספציפיים לדג הזבבורד (zebrafish). הפרוטוקול כולל סימון פלואורסצנטי של cDNA, היברידיזציה למערך ה-microarray וסריקה לרכישת אותות, המאפשרים לחוקרים לבצע פרופיל כמותי של רמות השחול (transcript levels) בקנה מידה גנומי בדגימות של דג הזבבורד.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- גנומיקה
- ביולוגיה מולקולרית
- ניתוח ביטוי גנים
- טרנסקריפטומיקה
רקע
- טכנולוגיית מערכי גנים (microarray) מאפשרת מדידה כמותית של ביטוי גנים בכל רחבי הגנום.
- היא נמצאת בשימוש נרחב לחקר שינויים בביטוי גנים הקשורים להתפתחות, למחלות ולתגובות רעילות.
- פלטפורמת מערכי הגנים של דג הזברה בוחנת למעלה מ-37,000 מטרות עם כיסוי מקיף של התעתיק (transcriptome).
- נתונים ממסדי נתונים גנומיים מרובים שימשו לתכנון המערך, ובכך הובטחה ישימות רחבה למחקרים על דג הזברה.
מטרת המחקר
- להדגים פרוטוקול חסון לסימון והכלאה של cDNA על מערך מיקרו-שבבים של אוליגונוקלאוטידים של דג הזברה.
- לאפשר פרופיל ביטוי גנים גלובלי בדג הזברה, במיוחד בתגובה לחשיפות סביבתיות או רעילות.
- לספק שלבים מפורטים עבור חוקרים לשחזור התהליך והשגת נתוני ביטוי גנים באיכות גבוהה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סינתזה של cDNA מ-RNA באיכות גבוהה שהופק מעוברים של דגי זברה.
- סימון פלואורסצנטי של cDNA באמצעות צבע Cy3 ומערכת סימון גנומית.
- טיהור והערכת איכות של cDNA מסומן, כולל בדיקות של שילוב הצבע.
- היברידיזציה של cDNA מסומן למערך המיקרו-מערך (microarray) תחת תנאים מבוקרים.
- שטיפה לאחר היברידיזציה וסריקה של המערך באמצעות סורק מיקרו-מערכים.
- נורמליזציה וניתוח נתונים לקביעת רמות ביטוי גנים יחסיות.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מניב לפחות 10 µg של cDNA מסומן המתאים להיברידיזציה.
- שילוב צבע אופטימלי מושג, כאשר היחס בין נוקלאוטיד ל-Cy3 הוא בין 50 ל-80.
- היברידיזציה באיכות גבוהה מקבלת ביטוי ברוויית פיצ'רים (feature saturation) של 1–2% ובעוצמת אות מתאימה.
- סריקת תמונות וניתוח נתונים מאפשרים זיהוי של גנים המבטאים ביטוי דיפרנציאלי בדגימות של zebrafish.
מסקנות
- הפרוטוקול המתואר מאפשר ביצוע אמין וניתן לשחזור של פרופיל ביטוי גנים גלובלי בדגי zebrafish.
- טיפול זהיר בצבעים פלואורסצנטיים ושימוש ב-cDNA באיכות גבוהה הם קריטיים להשגת תוצאות מוצלחות.
- שיטה זו תומכת ביישומים מגוונים בביולוגיה של התפתחות, רעילות ומחקר מחלות באמצעות מודלים של zebrafish.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח ביטוי גנים גלובלי באמצעות מערכים של אוליגו-נוקלאוטידים של דגי זברה מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית בשלבים מוקדמים של הגילוי, על ידי אספקת פרופיל תעתוקי ברחבי הגנום. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות ובסריקה פנוטיפית ביישומים של רעלנות וביולוגיה התפתחותית. הפלטפורמה מספקת נתונים כמותיים הניתנים לשחזור, המעניקים ביטחון חיזוי לצורך זיהוי מובילים (leads) והחלטות לגבי תעדוף תיק הפיתוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות פרופילי ביטוי רחבי-גנום כדי להבהיר מעורבות של מסלולים ומנגנונים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי זיהוי גנים בעלי ביטוי שונה בתגובה לחשיפה לרעלים או למודלים של מחלות.
- ערך ניבוי: תומך בביטחון ניבויי ובסינון תיקי פיתוח על ידי חשיפת תובנות מנגנוניות המפחיתות סיכון בבחירת מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקות המשך על ידי ביסוס פרופילי ביטוי בסיסיים במודלים של דגי זבראפש (zebrafish).
- ערך תפעולי: מספק פלטים כמותיים סטנדרטיים בעלי הדירות גבוהה, הודות לתכנון גשים (probes) חסון ובקרות נורמליזציה.
- מוכנות לסריקה: מאפשר הערכה מהימנה של תרכובות באמצעות תהליכי עבודה ניתנים להרחבה ולשימוש חוזר בפלטפורמה, התואמים למערכות היברידיזציה וסריקה אוטומטיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מחברת ממצאי גילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על דפוסי ביטוי הרלוונטיים למחלה במערכות מודל שונות.
- סנכרון סממנים ביולוגיים: תומכת בגילוי סממנים ביולוגיים תרגומיים באמצעות קריאות טרנסקריפטומיות עקביות המתואמות עם תוצאות פנוטיפיות.
- קידום מותאם סיכונים: מספקת בסיס להחלטות go/no-go על ידי אספקת אותי בטיחות ויעילות המבוססים על ביטוי בשלב מוקדם של תהליך הפיתוח.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות על מטרות, דרך זיהוי מובילים ועד לוולידציה פרה-קלינית, ובכך מאפשרת זיקוק איטרטיבי של ההבנה הביולוגית.
- ביולוגיה של תגליות: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי זיהוי שינויים בביטוי לאורך כל הטרנסקריפטום בתגובה להפרעות.
- סריקה (Screening): מבטיחה את מוכנות הבדיקה באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של סימון, היברידיזציה וסריקה, המניבים ערכי עוצמה ניתנים לשחזור.
- אנליטיקה: מייצרת נתוני ספירה מנורמלים וערכי עוצמה המאפשרים השוואה סטטיסטית בין תנאים וזיהוי של מאפיינים בעלי ביטוי דיפרנציאלי.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי שימור חתימות טרנסקריפטומיות ספציפיות לדגי zebrafish הרלוונטיות למסלולי מחלה אנושיים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כבסיס ליכולת ניתנת לשימוש חוזר בין פרויקטים השונים, הודות לעיצוב מערך סטנדרטי, כימיה של סימון ופרמטרי סריקה אחידים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזואי באמצעות הפחתת סיכונים מכניסטית וצמצום העמימות הביולוגית בבחירת המטרה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת התרחבות באמצעות שלבי סימון, היברידיזציה ובקרת איכות מובחנים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go), את יעילות ההון ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים על ידי אספקת תובנות מוקדמות מבוססות ביטוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון על בסיס פרופילי ביטוי כלל-גנומיים ואנליזה דיפרנציאלית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה מולקולרית, סימון חומצות גרעין ועבודה עם מערכי מיקרו-מערכים (microarrays) כדי להבטיח את שלמות הנתונים.
- תלוי במכשור מתמחה הכולל תרמוציקלרים, מערכות היברידיזציה של מיקרו-מערכים וסורקי לייזר לגילוי אותות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של ספי רכיב יעילות הסימון, פרוטוקולי שטיפה והגדרות הגב Verstärkung של ה-PMT לקבלת תוצאות עקביות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הפלטפורמה על זני דגי זהב (zebrafish) שונים, שלבים התפתחותיים או תנאי חשיפה שונים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון רגישות לאור של צבעים פלואורסצנטיים והצורך בכמויות אופטימליות של cDNA ובקירוב יחסי של שילוב הצבעים.
