Name: שיטת מדידה של קינטיקס Fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: למד שיטת מיקרוסקופיית פלואורסצנציה דו-צבעית לניטור קינטיקת Fusion ויראלי ברמת חלקיק יחיד. השיטה מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר תהליכי הימיפיוז'ן ויצירת נקבוביות בזיהומים ויראליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה נתמכה על ידי NIH מענקים AI57159 (עד SCH) ו AI72346 (עד AMvO). SCH הוא הווארד יוז חוקר רפואי במכון.

<ol><li>Elender, G., Kuhner, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalisation+of+Si%2FSiO2+and+glass+surfaces+with+ultrathin+dextran+films+and+deposition+of+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Functionalisation of Si/SiO2 and glass surfaces with ultrathin dextran films and deposition of lipid bilayers.</a> Biosens Bioelectron. 11, 565-577 (1996).</li>
<li>Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+kinetics+of+influenza+virus+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).</li>
</ol>

הכנת נוזל רציפה bilayers השומנים נתמך יכול להיות מאתגר. כמויות זעירות של חומר מזהם פגמים או משטח תמנע הפצת bilayers. בתצהיר ניקוי זהיר של שכבה אחידה של dextran חיוניים. הדמיה ממושכת של חלקיקי הנגיף יכול להלבין את תוויות ניאון או לגרום להם להיות מובטל. Photo-נזק מסוג זה ידוע היטב ביו הדמיה שדות מולקולה בודדת הוא האמין בדרך כלל נובעות הדור של מינים החמצן מגיב על ידי fluorophores נרגש. כדי למזער את הנזק צילום, אנחנו...

<table><tbody><tr><td>ריבועי זכוכית כיסוי של Corning, ‏25 מ"מ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS286525</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות סיליקה מותכת</td><td>זכוכית טכנית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתקן צביעה</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>(3-גליסידוקסיפרופיל)טרימתוקסיסילאן</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIG5840.1</td><td></td></tr><tr><td>Dextran T-500</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 4006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-די-אולאאוליל-&lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית בשימור (EM)&gt;נא לספק את הטקסט המקור לתרגום.&lt;/em&gt;-גליסרו-3-פוספוכולין (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>1-פאלמיטויל-2-אולאאויל-&lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית* (Electron Microscopy) או פליטה אלקטרומגנטית, בהתאם להקשר המדעי.&gt;סנ׳ (sn)&lt;/em&gt;1-פאלמיטויל-2-אולאיל-גליצרו-3-פוספוכולין (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM)&gt;N&lt;/em&gt;-((6-(ביוטינויל)אמינו)הקסנויל)-1,2-דיהקסדקנויל-&lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית בשימור (EM)&gt;נראה כי השארת את ההודעה ריקה או ששלחת רק את האותיות "sn". אנא ספק את הטקסט באנגלית שברצונך לתרגם, ואשמח לבצע את התרגום המקצועי לעברית בהתאם להנחיות שקיבלתי.&lt;/em&gt;גליסרו-3-פוספו&amp;#8211;תנולאמין, מלח טריאתילאמוניום (biotin-X DHPE)</td><td>Invitrogen</td><td>B1616</td><td></td></tr><tr><td>סטראפטידין, צמוד פלואורסצאין</td><td>Invitrogen</td><td>S-869</td><td></td></tr><tr><td>דיסיהלוגנגליוזיד GD&lt;sub&gt;1א&lt;/sub&gt; ממוח בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2392</td><td></td></tr><tr><td>מיני-אקסטרודר</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>מסנני קמימות פוליקרבונט בנקבוביות של 0.1 מיקרון</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>דיסקי ניקוז בקוטר 10 מ"מ (תמיכות ממбраנה)</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>230300</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרק של סולפורודמין b</td><td></td><td>S1402</td><td></td></tr><tr><td>אוקטדציל רודמין 110 (Rh110C18)</td><td></td><td></td><td>&lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית בשימור (EM)&gt;ראה&lt;/em&gt; פלויד &lt;מיקרוסקופ אלקטרוני (EM)&gt;ואחרים.&lt;/em&gt; 2008 עבור פרוטוקול סינתזה</td></tr><tr><td>עמודי הסרת מלחים PD-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנציה של Nikon</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>עדשה אובייקטיבית Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>לייזר Ar/Kr מדגם Innova 70C Spectrum</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702213</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת מדידה של קינטיקס fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

היתוך ממברנה היא מהווה נדבך חיוני במהלך כניסה של וירוסים עטופים לתוך התאים. מבחני היתוך קונבנציונלי בדרך כלל לדווח על מספר רב של אירועים היתוך, ולכן קשה לנתח באופן כמותי את רצף הפעולות המולקולריים המעורבים. פיתחנו במבחנה, שני צבעים assay הקרינה לפקח קינטיקה של פיוזינג חלקיקי נגיף יחיד עם bilayer היעד על תמיכה נוזל בעיקרו. חלקיקים שפעת נגיפית מודגרת עם fluorophore lipophilic ירוק להכתים את הממברנה fluorophore הידרופילי אדום להכתים את פנים ויראלי. אנו פיקדון bilayer ganglioside המכילים שומנים על פני השטח dextran-functionilized הזכוכית של התא זרימה, דגירה חלקיקים נגיפיים על bilayer את התמונה מישוריים את הקרינה של 100 x 100 מיקרומטר אזור 2, המכיל כמה מאות של חלקיקים, על CCD המצלמה. על ידי הדמיה הן פלואורסצנטי אדום וירוק, אנחנו יכולים בו זמנית לפקח על התנהגותם של לצבוע את הממברנה (ירוק) לבין תוכן מימית (אדום) של חלקיקים. לאחר הפחתת ה-pH מתחת לערך pH המיזוג, חלקיקים יהיה הפתיל עם הממברנה. Hemifusion, מיזוג של עלון החיצוני של קרום ויראלי עם עלון החיצוני של קרום היעד, יהיה גלוי כשינוי פתאומי פלואורסצנטי ירוק של חלקיק. עם היתוך הבאים של שני כרוזים דיסטלי הנותרים נקבוביות תוקם ואת fluorophore אדום פולטות חלקיק נגיפי ישוחררו תחת קרום היעד. אירוע זה יהיה להצמיח ירידה של הקרינה האדום של חלקיקים בודדים. לבסוף, פלואורסצנציה משולב מ fluorophore pH רגיש המוטבע קרום היעד מדווחת על הזמן המדויק של ירידה ה-pH. מתוך שלושת זמן פלואורסצנציה-עקבות, את כל האירועים החשובים (ירידה pH, שומנים ערבוב על תוכן hemifusion, ערבוב על היווצרות נקבוביות) כעת ניתן לחלץ בצורה ישירה עבור כל חלקיק בנפרד. על ידי איסוף פעמים שחלף על מעברים שונים עבור חלקיקים בודדים רבים היסטוגרמות, אנו יכולים לקבוע את תקופות חיים של ביניים המקביל. אפילו ביניים נסתרים אין הנצפה פלורסנט ישיר ניתן דמיינו ישירות היסטוגרמות אלו.

אנו מציגים<em&gt; במבחנה,</em&gt; שני צבעים assay הקרינה לדמיין את היתוך של חלקיקי נגיף יחיד עם bilayer היעד נוזל. על ידי תיוג חלקיקים נגיפיים עם fluorophores כי דיפרנציאלי כתם הממברנה ויראלי הפנים שלה, אנו יכולים לפקח על קינטיקה של hemifusion היווצרות נקבוביות.

שיטת מדידה של קינטיקס Fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד

היתוך ממברנות הוא שלב חיוני במהלך חדירתם של נגיפים מעטפתים לתאים. בדיקות היתוך קונבנציונליות מדווחות בדרך כלל על מספר גדול של אירועי היתוך...

כיסיי הזכוכית המשמשים במבחן זה עוברים פונקציונליזציה באמצעות דקסטרין ולאחר מכן משולבים בתאי זרימה מיקרופלואידיים. לאחר מכן, כל תא זרימה מדגיר עם תרחיף של ליפוזומים, המתאחים ליצירת שכבה ליפידית כפולה מעל הדקסטרין ההידרטי. תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה, מוסיפים נגיף המסומן ב-fluoro four וסטרפטאבידין המסומן בפלואורסצאין, ומאפשרים לנגיף להיקשר לשכבה הכפולה.הזרמה של בופר חומצי מתניעה את ההיתוך הויראלי עם השכבה הכפולה, ומצלמה דיגיטלית מתעדת את השינויים בפלואורסצנציה לאורך הבדיקה. שלום, אני דניאל פלויד ואני במעבדה של אנין וניאן במחלקה לכימיה ביולוגית ופרמקולוגיה מולקולרית באוניברסיטת הרווארד. היום אדגים לכם שיטה לוויזואליזציה של קינטיקת היתוך ויראלי ברמת החלקיק הבודד.אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה כדי לחקור את הדרך שבה הווירוס מגיע לתאי המארח. אם כן, בואו נתחיל. התחילו את הפרוטוקול על ידי הכנת כיסויי זכוכית (cover slips) פונקציונליים עם דקסטרין.השלב הראשון הוא סוניקציה של כיסויי הזריקה (cover slips) בתמיסות של 10% דטרגנט, אשלגן הידרוקסיד 1M באצטון, ו-100% אתנול; יש לבצע סוניקציה למשך 30 דקות לכל תמיסה. יש לשטוף במים דאיוניים בין הפעולות. לאחר הסוניקציה האחרונה, שטפו את כיסויי הזריקה במים, ולאחר מכן ייבשו אותם באינקובטור בטמפרטורה של 80 °C.בשלב הבא, הכניסו את לבישורי הזכוכית למכשיר לניקוי בפלזמה של חמצן למשך שלוש דקות. שלב זה מחמצן את פני השטח של השקופיות, ובכך הופך את הזכוכית להידרופילית באופן אחיד ומגיבה לשלבי הסיליליזציה הבאים. לאחר מכן, טבלו את לבישורי הזכוכית בתמיסה רעננה של 0.2%gly oxy propyl trimeth oxypro trim methoxy באיזופרופנול והדגירו למשך חמש דקות.לאחר מכן, שטפו את לוחות הכיסוי מספר פעמים עם isopropanol. הניחו את לוחות הכיסוי המצופים ב-Slan בטמפרטורה של 80 degrees Celsius למשך שעה אחת. שלב האשפרה זה מאפשר ל-slan ליצור קשר קובלנטי עם הזכוכית.לאחר הפעלה (curing), סדרו את לבישי הזכוכית (cover slips) בצורה שטוחה בתוך קופסת הקפאה מפלסטיק. כסו את פני השטח העליון של כל לביש בערך ב-1 mL של תמיסת דקסטרין בריכוז 30% weight per volume במים.סגרו את קופסת ההקפאה והשאירו את כישורי הכיסוי במקום שקט למשך 24 עד 36 שעות. למחרת, שפכו את עודפי הדקסטרין, אחזו בכישורי הכיסוי בעזרת פינצטה מפלסטיק והחזירו אותם למסבך הקרמי. שטפו אותם במים מספר פעמים והשאירו אותם להשריה במים למשך 48 שעות.ניתן לנער בעדינות את המכל על גבי רוטטור שולחני; ייבשו את לביות המכסה בתנור שחומם ל-80 °C ואחסנו אותן במייבש ואקום עד לשלב הבא. ציפוי לביות המכסה בתערובת ליפוזומים ליצירת דו-שכבה מישורית. השלב הבא הוא הכנת הליפוזומים ליצירת דו-שכבת השומנים; בתוך מCב, ערבבו את כל השומנים המומסים בכלורופורם בתוך מבחנה מזכוכית.פורמולציית הליפוזום כוללת צד של dia ganglia, הקושר חלקיקי נגיף, ושומן (ליפיד) ביוטינילי, הקושר אינדיקטור pH של פלואורסצאין המשורשר לסטרפטאבידין. לאחר מכן, אידו את הממס תחת זרם של גז ארגון או חנקן. והסירו את שאריות הממס על ידי השארת מבחנת הבדיקה במייבש ואקום למשך שעתיים.יש להשעות מחדש את שכבת הליפידים המיובשת ב-400 microliters של תמיסת HNE buffer. לאחר מכן, העבירו את התסמין למבחנה פלסטית למיקרו-צנטריפוגה. הקפיאו את התסמין באמבט חנקן נוזלי והמיסו אותו באמבט מים חמים.חזור על מחזור הקפאה-הפשרה זה ארבע פעמים לאחר מחזורי ההקפאה-הפשרה. השתמש במבצ (extruder) של ליפידים המצויד בממברנת סינון של 100 nanometer כדי לבצע אקסטרוזיה לתמיסת הליפידים. לאחר 25 פעמים של אקסטרוזיה, התמיסה צריכה להיראות שקופה יותר.יש לאחסן את הליפוזומים בטמפרטורת החדר ולהשתמש בהם ביום ההכנה. כעת, כאשר הליפידים מוכנים, יש להכין את תא הזרימה המיקרופלואידי. ראשית, קחו פרוסת קוורץ בגודל 20 על 20 על 3 מילימטר ולהשתמש במקדח יהלום כדי לקדוח שני חורים בקוטר של 1 מילימטר בצדדים מנוגדים.גזרו ריבוע של 20 מילימטרים מגיליון של סרט דבק דו-צדדי באמצעות להב תער. גזרו חלק של 15 על שני מילימטרים ממרכז הריבוע. קלפו צד אחד של גב הסרט והדביקו את הסרט לסרטית הזכוכית (slide).הדביקו את הצד השני לזכוכית כיסוי פונקציונלית שגזו כעת לאורכי של 20 centimeter של צינור פוליאתילן והכניסו אותם לחורים בנסף הקוורץ. לבסוף, אטמו את תא הזרימה עם דבק אפוקסי בעל זמן ייבוש של חמש דקות. מרחו את הדבק מסביב לצדדי נסף הקוורץ כדי להדביקו לזכוכית הכיסוי.השתמשו בשתי טיפות דבק נוספות כדי לאטום את החיבור בין הפיתול לבין שקף הקוורץ. לאחר שהדבק התקשח, הזרמו HNE buffer למשאבת הזרימה ולפיתול כדי להכינם. כדי ליצור את השכבה הליפידית הנתמכת, קחו את תגשית הליפוזומים שהוצאו בבליעה (extruded) ושאבו כ-80 µL אל תוך התעלים ביום שלפני ניסוי ההיתוך.התחילו בסימון חלקיקי הנגיף כדי לסמן את פנים הנגיף באדום. ערבבו 20 µL של תמיסת sulfur rumine או SRB שהוכנה טרי לפני כן עם 10 µL של תמיחת הנגיפים והשאירו בטמפרטורת החדר למשך 20 שעות. למחרת, הסירו את עודפי הצבע על ידי העברת תמיחת הנגיפים דרך עמודת הסמכה (desalting column) מסוג PD 10 ודילול עם 800 µL של בופר HNE.בעמודה אמור להופיע פס צבעוני בולט, המכיל את הנגיף המסומן. אסוף פרקציה זו במהלך שלב האלוציה הבא, סמן את המעטפת הנגיפית בירוק על ידי הוספת 13 µL של Octa decal, RUMINE one 10 או RH one 10 C 18 לתמיחת הנגיפים המסומנת ב-SRB. ערבב את התמיחה על ידי חיבור המבחנה למסובב מעבדה והשאר למשך שלוש שעות.בשלב הבא, הסר עודפי RH one 10 C 18 באמצעות עמודת התמלחות PD 10. כפי שנעשה קודם לכן, הווירוס מוכן כעת לבדיקת ההיתוך. בצע את בדיקת קינטיקת ההיתוך באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה המצויד בעדשת שמן בעלת מפתח מספרי גבוה.לייזר קריפטון של Argonne מעורר את הפלואורופורים בממברנה ובפנים הויראלית. מראת דיכרואיקה מפצלת לאחר מכן את פליטות הפלואורסצנציה באדום ובירוק, וממקדת באופן עצמאי את התמונות על שני חצאים נפרדים של מצלמת CCD (מכשיר מצומד מטען) עם הכפלה אלקטרונית. התקן את לביש הכסית על משטח המיקרוסקופ וחבר את צינור היציאה למשאבת מזרק המכוונת לזרימה של 100 µL לדקה.נקה את תעלות הזרימה מעודפי ליפוזומים על ידי הזרמת 300 µL של HNE. כוון את המיקרוסקופ והתאם את הספק הלייזר כדי להאיר את הפני השטח בעוצמה של 350 W/cm² של אור באורך גל של 488 nm להעשרת הפלואור czerwום, ו-70 W/cm² של אור באורך גל של 568 nm להעשרת הפלואור ירוק. כעת, כאשר המיקרוסקופ מוכן, נחובב לתוך תא הזרימה נגיף מסומן המדולל ביחס של 1:100.כאשר הנגיף מפעפע אל פני השטח התחתונים של תעלת הזרימה, החלקיקים מתחילים להיקשר. הם נצמדים לצדו של ה-DIA ganglia, המשולב בתוך לוחות הכיסוי, בשכבה דו-שכבתית מישורית (planar bilayer). כאשר צפיפות החלקיקים הנקשרים מגיעה לכמה מאות חלקיקים לשדה ראייה, יש להתחיל להזרים תמיסה בריכוז של 2 µg/mL.סטראפטאבידין מסומן בפלואורסצאין, פלואורופור הרגיש ל-pH, כאשר הסטראפטאבידין המסומן נקשר למולקולות ליפידים המצומדות לביוטין בשכבה הכפולה. רקע ירוק עמום מופיע שוב, שטפו את תעלת הזרימה עם 300 microliters של HNE. כעת, לאחר שהווירוסים עגנו ופני השכבה הכפולה מצופים בפלואורסצאין, הגיע הזמן להתחיל את הבדיקה.בחרו אזור הדמיה, התמקדו בעזרת המיקרוסקופ והכינו את מצלמת ה-CCD לרכישת תמונות בשיטת time-lapse. הגדירו את זמן החשיפה ל-100 milliseconds ואספו פריימים בקצב של 10 hertz. התניעו את היתוך ממב ratification של הווירוס על ידי זרימה של באפר נתרן ציטראט חומצי.ככל שה-pH יורד, פלואורסצנציית הפלואורסצאין דועכת, מה שמאפשר לדייק את זמן ההחמצה. מצלמת ה-CCD מקליטה את הנתונים לאורך הבדיקה, וניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את זמן ההמי-פיוז'ן (hemi fusion) ואת היווצרות הנקבים כפי שתועדו על ידי מצלמת ה-CCD. לאחר ירידת ה-pH, מופיעים פרצי פלואורסצנציה ירוקה כאשר הממברנות הוויראליות והמישוריות מתמזגות, הליפידים מתערבבים והצבע הירוק במעטפת הוויראלית מדלל בתוך הממברנה המישורית.לעומת זאת, חלה דעיכה בפלואורסצנציה האדומה לאחר ירידת ה-pH, שכן הממברנות הויראליות והליפידיות יוצרות נקבים המאפשרים לצבע האדום מהחלק הפנימי של הווירוס לדלוף אל המרחב המימי שמתחת לשכבה הדו-שכבתית המישורית ומחוץ לטווח הראייה; מגמות אלו ניתנות להדמיה גם באמצעות תצלומי פלואורסצנציה לפני ובמהלך ההיתוך. כמו כן, יש להפיק גרף של מסלולי עוצמת הפלואורסצנציה עבור כל חלקיק כפי שמוצג בדוגמה זו. היתוך חלקי (Hemi fusion) מוגדר כנקודה שבה השיפוע של עוצמת הפלואורסצנציה הירוקה הוא התל ביותר, ויצירת נקבים מוגדרת כנקודה שבה מתרחשת דעיכת הפלואורסצנציה האדומה. יש לשלב נתונים ממספר ניסויים כדי להפיק היסטוגרמות של זמני השיהוי של היתוך חלקי ויצירת נקבים כפי שמוצג כאן, תוך שימוש בזמן ירידת ה-pH כ-t שווה לאפס כדי לסנכרן נתונים מניסויים שונים.הרגע הצגתי בפניכם דרך למדוד קינטיקה של היתוך נגיפי ברמת החלקיק הבודד. בעת ביצוע פרוצדורה זו, וודאו שאתם משתמשים בכיסויי זכוכית (cover slips) נקיים כדי להבטיח קבלת דו-שכבה הומוגנית ונוזלית.בנוסף, נסו לצמצם את כמות האור שבה אתם משתמשים במהלך הדמיית פלואורסצנציה כדי למזער נזק פוטו-כימי. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

method-for-measurement-viral-fusion-kinetics-at-single-particle

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ג'נומיקס וירוס אחד (SVG) הוא שיטה לבודד ולהגביר את הגנום של virons בודד. השעיות נגיפיות של מכלול מעורב מסודרים באמצעות cytometry זרימה לשקופית מיקרוסקופ עם בארות בדידות המכילות agarose, ובכך ללכוד את virion והפחתת גז הגנום במהלך עיבוד במורד הזרם. ההגברה הגנום כולו מושגת באמצעות הגברה עקירה מרובה (מד"א) וכתוצאה מכך חומר גנטי שמתאים לסידור.

בידוד ואנליזה של הגנום virions יחיד באמצעות &#39;נומיקס וירוס אחד &quot;

Source: Moore, M. D., et al. Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity. J. Vis. Exp. (2017)The video demonstrates a protocol for monitoring the heat-induced aggregation of virus-like particles using dynamic light scattering (DLS). It begins with preparing a monodisperse suspension of purified particles. The sample is then loaded into a preheated DLS instrument. As the capsid proteins denature with heat, exposed hydrophobic regions cause particle...

Tracking Aggregation of Virus-Like Particles Using Dynamic Light Scattering

סרטון זה מדגים בדיקה להערכת חומרים אנטי-ויראליים המכוונים לשלבים ספציפיים של כניסת הנגיפים לתאי המאכסן ואיחוי עם האנדוזום. התאים מודגרים בטמפרטורה נמוכה ואז נגועים ב- HCV. הטמפרטורה הנמוכה מאפשרת קשירה נגיפית לתאים מארחים אך מעכבת הפנמה באמצעות אנדוציטוזה. התרכובת האנטי-ויראלית של הבדיקה מתווספת, והתאים מודגרים בטמפרטורה פיזיולוגית. מעבר זה לטמפרטורה גבוהה יותר מאפשר כניסה נגיפית ומאפשר להעריך את השפעת תרכובת הבדיקה על איחוי מעטפת נגיפית עם אנדוזומים.

בדיקה להערכת ההשפעה של תרכובות בדיקה על כניסה נגיפית ואיחוי בתאים מארחים

שיטה זו מתארת ​​את השימוש בכימיה לחץ כדי למדוד שינויים בשעתוק תא מארח לאחר הדבקה בנגיף קדחת הבקעה (RVFV) מתח MP-12. תוצאות יכולות להיות דמיינו איכותית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או הושגו כמותית באמצעות cytometry הזרימה. שיטה זו ניתנת להתאמה לשימוש עם וירוסים אחרים.

שימוש בכימיה לחץ כדי למדוד את ההשפעה של זיהום ויראלי בסינתזת RNA Host-Cell

ההחזקה של virions על פני השטח היא דרישה להדמיית virion יחיד על ידי הדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה סופר או מיקרוסקופיה כוח אטומי (AFM). כאן אנו מדגימים שיטת הכנה לדוגמה להדבקה מבוקרת של virions למשטחי זכוכית המתאימים לשימוש AFM והדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה סופר.

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

אנו מתארים את השימוש של וירוס vaccinia כתב ניאון המאפשר מדידה של infectivity הנגיפי וביטוי גנים בזמן אמת דרך הביטוי בשלב מסוים של fluorophores כתב ספקטרלית שונה. אנחנו פירוט שיטה המבוססת על צלחת לזיהוי מדויק השלב שבו שכפול נגיף מושפע בתגובה לעיכוב מולקולה קטן.

וירוסי כתב Vaccinia לכימות פונקציה ויראלי בכל השלבים של ביטוי גנים

אנו מציגים פרוטוקול המתאר שיטה כמותית למחצה למדידת שניהם, היצמדות של נגיף שפעת A לתאי A549, כמו גם הפנמת חלקיקי הנגיף לתאי המטרה על ידי זרימה ציטומטרית.

מדידה מצורף והפנמה של שפעת וירוס בתאי A549 על ידי cytometry הזרימה

השלב הראשון במחזור החיים של וירוס הזירה הוא הצמדה של חלקיקים נגיפיים לתאים מארחים. אנו מדווחים על בדיקה כמותית מבוססת RT-PCR לזיהוי וכימות רגישים במיוחד של אירועי התקשרות ל-arenavirus.

Assay הרגיש ביותר למדידה של Attachment Arenavirus התאים

שיטות איתור שגרתית ניצול גנום ויראלי הגברה מוגבלים על ידי חוסר יכולתם להפלות זיהומיות של חלקיקים שאינן זיהומיות. מטרת מאמר זה נועד לספק נתונים היסטוריים פרוטוקולים עבור שיטות אלטרנטיביות לסייע אפליה של חלקיקים norovirus זיהומיות באמצעות איגוד aptamer, פיזור אור דינאמי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

שיטות אלטרנטיביות במבחנה מצפני Capsid ויראלי המבנית

בכתב יד זה, פרוטוקול מוצג לבצע מדידה מבוססת FACS של וירוס BK-poly, באמצעות שימוש בתאי HEK293T באמצעות כתבת דו-מפלסי של כתב דו-כיווני המבטא tdTomato ו-eGFP. שיטה זו מאפשרת לקבוע את ההשפעה של תרכובות הרומן על תמלול ויראלי.

מדידה של מחוז בקרת וירוס BK-פוליפוניים שאינו קידוד מונחה פעילות באמצעות הזרמת שפות

מאמר זה מספק הוראות שלב אחר שלב לביצוע מדידות FRET מדויקות מתוקנות במלואן על ביומולקולים בודדים, המפזרים בחופשיות באמצעות קוד פתוח, smfBox זול, החל מהפעלת, דרך יישור ומיקוד, לאיסוף וניתוח נתונים.

ביצוע מדידות FRET מדויקות ומדויקות באמצעות smfBox קוד פתוח

למד שיטת מיקרוסקופיית פלואורסצנציה דו-צבעית לניטור קינטיקת Fusion ויראלי ברמת חלקיק יחיד. השיטה מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר תהליכי הימיפיוז'ן ויצירת נקבוביות בזיהומים ויראליים.

שיטת מדידה של קינטיקס Fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד

גלה סרטונים נוספים