שיטת מדידה של קינטיקס Fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד
September 7th, 2009
אנו מציגים במבחנה, שני צבעים assay הקרינה לדמיין את היתוך של חלקיקי נגיף יחיד עם bilayer היעד נוזל. על ידי תיוג חלקיקים נגיפיים עם fluorophores כי דיפרנציאלי כתם הממברנה ויראלי הפנים שלה, אנו יכולים לפקח על קינטיקה של hemifusion היווצרות נקבוביות.
החלקות הכיסוי המשמשות בבדיקה זו מתפקדות עם דקסטרין ואז משולבות בתאי זרימה מיקרופלואידיים. לאחר מכן, כל תא זרימה מודגר עם תרחיף של ליפוזומים, המתמזגים ליצירת שכבת שומן דו-שכבתית על גבי הדקסטרין המיובש. תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי מוסיפים וירוס פלואורו ארבע וסטרפטווידין עם תווית פלואורסצין והנגיף מורשה לעגון לשכבה הדו-שכבתית.
זרם של מאגר חומצי יוזם היתוך ויראלי עם הדו-שכבתי ומצלמה דיגיטלית מתעדת את השינויים בקרינה לאורך כל הבדיקה. היי, אני דניאל פלויד ואני במעבדה של אנין וניאן במחלקה לכימיה ביולוגית ופרמקולוגיה מולקולרית באוניברסיטת הרווארד. היום אני הולך להראות לכם שיטה להמחשת קינטיקה של היתוך ויראלי ברמת החלקיק הבודד.
אנו משתמשים בהליך הזה במעבדה כדי לחקור את האופן שבו הווירוס מגיע לתאים מארחים. אז בואו נתחיל. התחל פרוטוקול זה על ידי הכנת פתקי הכיסוי הפונקציונליים של דקסטרין.
השלב הראשון הוא סוניקציה של החלקות הכיסוי בתמיסות של 10% חומר ניקוי, אצטון אשלגן הידרוקסיד מולארי אחד ו-100% אתנול סוניקט למשך 30 דקות לכל תמיסה. ולשטוף במים נטולי יונים בין היונים. לאחר הסוניקציה האחרונה, יש לשטוף את החלקות הכיסוי במים, ואז לייבש אותם בחממה של 80 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, הכניסו את החלקות הכיסוי לחשפנית פלזמה חמצן למשך שלוש דקות. שלב זה מחמצן את פני המגלשות, מה שהופך את הזכוכית להידרופילית ותגובתית באופן אחיד בשלבי האילוץ הבאים. לאחר מכן, טבלו את החלקות הכיסוי בתמיסה טרייה של 0.2% גלי אוקסי פרופיל טרימת' אוקסיפרו לקצץ מתוקסי באיזופרופנול ודגרו למשך חמש דקות.
לאחר מכן שוטפים את הכיסוי מחליק מספר פעמים עם איזופרופנול. הנח את החלקות הכיסוי המצופות Slan, בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך שעה. כדי לרפא שלב זה מאפשר לסלאן להיקשר באופן קוולנטי לזכוכית.
לאחר הריפוי, סדרו את החלקות הכיסוי שטוחות בחלק הפנימי של קופסת מקפיא מפלסטיק. מכסים את המשטח העליון של כל החלקת כיסוי בכמיליליטר אחד של תמיסת דקסטרין. 30% משקל לנפח במים.
סגור את קופסת המקפיא והשאיר את המכסה מחליק במקום שקט למשך 24 עד 36 שעות. למחרת שפכו את עודפי הדקסטרין, תפסו את החלקות הכיסוי בעזרת מלקחיים מפלסטיק והחזירו אותם למתלה הקרמיקה. שוטפים אותם במים מספר פעמים ונותנים להם להשרות במים למשך 48 שעות.
ניתן לערבב את המיכל בעדינות על מסובב שולחן, לייבש את המכסה בתנור המוגדר ל-80 מעלות צלזיוס ולאחסן במייבש ואקום עד שתהיה מוכן לשלב הבא. ציפוי הכיסוי מחליק בתערובת של ליפוזומים ליצירת שכבה דו-שכבתית. השלב הבא הוא להכין את הליפוזומים ליצירת שכבת השומנים הדו-שכבתית במכסה המנוע, לשלב את כל השומנים המומסים בכלורופורם במבחנה מזכוכית.
נוסחת הליפוזום כוללת צד דיא גנגליון, הקושר חלקיקי נגיף ושומן ביוטיניל, הקושר את מחוון ה-pH המצומד של סטרפטווידין פלואורסצאין. לאחר מכן, אידוי הממס מתחת לזרם ארגון או גז חנקן. והסר את הממס שנותר על ידי השארת המבחנה בייבוש ואקום למשך שעתיים.
השעו מחדש את סרט השומנים המיובש במאגר HNE של 400 מיקרוליטר. לאחר מכן העבירו את המתלה לצינור מיקרו צנטריפוגה מפלסטיק. מקפיאים את המתלה באמבט חנקן נוזלי ומפשירים באמבט מים חמים.
חזור על מחזור ההפשרה בהקפאה זה ארבע פעמים לאחר מחזורי ההפשרה בהקפאה. השתמש במכבש שומנים המצויד במסנן ממברנה של 100 ננומטר כדי להוציא את מתלה השומנים. 25 פעמים לאחר האקסטרוזיה, המתלה אמור להיראות שקוף יותר.
אחסן את הליפוזומים בטמפרטורת החדר והשתמש ביום ההכנה. כעת, כשהשומנים מוכנים לפעולה, הכינו את תא הזרימה המיקרופלואידי. ראשית, קח מגלשת קוורץ בגודל 20 על 20 על שלושה מילימטר והשתמש בבור יהלום כדי לקדוח שני חורים של מילימטר אחד בצדדים מנוגדים.
חותכים ריבוע של 20 מילימטר מגיליון סרט מקל כפול ובעזרת סכין גילוח. גזרו קטע של 15 על שני מילימטר מהמרכז. קלף צד אחד של גב הסרט והדבק את הסרט למגלשת המגרש.
הדביקו את הצד השני להחלקת כיסוי פונקציונלית שנחתכה כעת לאורכים של 20 סנטימטר של צינורות פוליאתילן והכניסו אותם לחורים במגלשת הקוורץ. לבסוף, אטום את תא הזרימה עם דבק אפוקסי של חמש דקות. מורחים את הדבק סביב דפנות מגלשת הקוורץ כדי להדביק אותו להחלקת הכיסוי.
השתמש בשתי טיפות דבק נוספות כדי לאטום את החיבור בין הצינור למגלשת הקוורץ. כאשר הדבק נרפא, יש להניח את תא הזרימה והצינורות עם מאגר HNE. לאחר מכן כדי ליצור את שכבת השומנים הדו-שכבתית, קח את תרחיף הליפוזום המוחצן ושאב כ-80 מיקרוליטר לתעלות ביום שלפני ניסוי האיחוי.
התחל לתייג את חלקיקי הנגיף כדי לסמן את פנים הנגיף באדום. שלב 20 מיקרוליטר של רומין גופרית טרי או תמיסת SRB שהוכנה עם 10 מיקרוליטר מהתרחיף הנגיפי והשאיר בטמפרטורת החדר למשך 20 שעות. למחרת, הסר את עודפי הצבע על ידי העברת תרחיף הנגיף דרך עמוד התפלה PD 10 ודילול ב-800 מיקרוליטר של מאגר HNE.
העמודה צריכה להיות בעלת פס צבעוני ברור, המכיל את הווירוס המסומן. אסוף את השבר הזה במהלך השלב האלוסיאני הבא, סמן את המעטפת הנגיפית בירוק על ידי הוספת 13 מיקרוליטר של מדבקת אוקטה, RUMINE אחד 10 או RH אחד 10 C 18 לתרחיף הנגיפי המסומן SRB. מערבבים את המתלה על ידי הצמדת הצינור למסובב מעבדה ומשאירים למשך שלוש שעות.
לאחר מכן, הסר עודף RH אחד 10 C 18 באמצעות עמודת התפלה PD 10. כמו בעבר, הנגיף מוכן לבדיקת ההיתוך. בצע את בדיקת קינטיקה של היתוך באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במטרת טבילת שמן עם צמצם מספרי גבוה.
לייזר קריפטון ארגון מעורר את ארבע הפלואורו בקרום הנגיפי ובפנים. לאחר מכן, מראה דיכרואית מפצלת את פליטות הקרינה האדומה והירוקה וממקדת באופן עצמאי את התמונות על חצאים נפרדים של מצלמת CCD או מצלמת מכשיר מצמד מטען. התקן את החלקת הכיסוי על המיקרוסקופ stage וחבר את צינור היציאה למשאבת מזרק המוגדרת לזרימה במהירות של 100 מיקרוליטר לדקה.
נקה את תעלות הזרימה מעודפי ליפוזומים על ידי זרימה פנימה של 300 מיקרוליטר HNE. מקדו את המיקרוסקופ והתאימו את עוצמת הלייזר כדי להאיר את פני השטח ב-350 וואט לסנטימטר רבוע של אור 488 ננומטר כדי לעורר את הפלורה האדומה, ארבעה ו-70 וואט לסנטימטר רבוע של אור 568 ננומטר כדי לעורר את הצמחייה הירוקה. ארבע. כעת, כשהמיקרוסקופ מוכן, וירוס עם תווית משאבה מדולל בין 1 למאה לתוך תא הזרימה.
כאשר הנגיף מתפזר למשטח התחתון של תעלת הזרימה, חלקיקים מתחילים לעגון. נצמד לצד הגרעינים של DIA, משולב בהחלקות הכיסוי, דו-שכבתי מישורית. כאשר צפיפות החלקיקים המעוגנים מגיעה לככמה מאות חלקיקים לשדה ראייה, התחל לזרום בתמיסה של שני מיקרוגרם למיליליטר.
פלואורסצאין תייג סטרפטווידין, פלואורופור רגיש ל-pH שכן הסטרפטווידין המסומן נקשר למולקולות שומנים מצומדות ביוטין בשכבה הדו-שכבתית. רקע ירוק עמום מופיע שוב, שטפו את ערוץ הזרימה עם 300 מיקרוליטר HNE. כעת, לאחר שהנגיפים עגנו והמשטח הדו-שכבתי מצופה בפלואורסצאין, הגיע הזמן להתחיל בבדיקה.
בחר אזור הדמיה, מקד את המיקרוסקופ והכן את מצלמת ה-CCD לרכישת תמונה בזמן. הגדר את זמן החשיפה ל-100 אלפיות השנייה ואסוף פריימים בקצב של 10 הרץ. התחל היתוך קרום הנגיף על ידי זרימה במאגר נתרן ציטראט חומצי.
כאשר ה-pH יורד, הקרינה הפלואורסצנטית מתעמעמת ומציינת את זמן ההחמצה. מצלמת ה-CCD מתעדת את הנתונים לאורך כל הבדיקה, בהם ניתן להשתמש כדי לקבוע את זמן איחוי המי והיווצרות לקויה כפי שתועד על ידי מצלמת ה-CCD. לאחר ירידת ה-pH, יש התפרצויות של פלואורסצנטיות ירוקה כאשר הממברנות הנגיפיות והפלנריות מתמזגות, השומנים מתערבבים והצבע הירוק במעטפת הנגיפית מדולל בקרום המישורי.
לעומת זאת, יש דעיכה בקרינה האדומה לאחר ירידת ה-pH מכיוון שהממברנות הוויראליות והשומניות יוצרות נקבוביות המאפשרות לצבע האדום מהפנים הנגיפי לברוח לחלל המימי מתחת לשכבה הדו-שכבתית המישורית ומחוץ לטווח הראייה, ניתן לדמיין מגמות אלה גם על ידי תמונות פלואורסצנטיות לפני ובמהלך האיחוי. כמו כן, גרף את מסלולי עוצמת הקרינה עבור כל חלקיק כפי שמוצג בדוגמה זו, היתוך המי מוגדר כנקודה שבה שיפוע עוצמת הקרינה הירוקה נמצא בהיווצרות הנקבוביות התלולה ביותר שלו כנקודה שבה מתרחשת דעיכת הקרינה האדומה. נתונים משולבים מניסויים מרובים ליצירת היסטוגרמות של היתוך המי וזמני פיגור היווצרות נקבוביות כפי שמוצג כאן, תוך שימוש בזמן ירידת ה-pH כ-t שווה לאפס כדי לסנכרן נתונים מניסויים שונים.
זה עתה הראיתי לכם דרך למדוד קינטיקה של היתוך ויראלי ברמת החלקיק הבודד. בעת ביצוע הליך זה. הקפד להשתמש בהחלקות כיסוי נקיות כך שיהיה לך שכבה דו-שכבתית הומוגנית ונוזלית.
כמו כן, נסה למזער את כמות האור שאתה משתמש בה במהלך הדמיית פלואורסצנטי כדי שתוכל למזער את נזקי הצילום. אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מחקר זה מציג תבחין פלואורוסצנטי דו-צבעוני in vitro שנועד להמחיש את היתוך של חלקיקי וירוס בודדים עם דו-שכבת נוזלית. על ידי שימוש בפלואורופורים שמכתימים רכיבים שונים של חלקיקי הווירוס, ניתן לעקוב באופן יעיל אחר הקינטיקה של חצי-היתוך ויצירת נקבובית.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- וירולוגיה
- מיקרוסקופיה פלואורוסצנטית
- כימיה ביופיזית
רקע
- הבנת ההיתוך הנגיפי היא חיונית לפיתוח אסטרטגיות אנטי-ויראליות.
- ניתוח של חלקיק יחיד מספק תובנות לגבי הדינמיקה של אינטראקציות ויראליות.
- טכניקות פלואורוסצנטיות מאפשרות תצפית בזמן אמת של אירועים מולקולריים.
- שיטה זו משפרת את הרזולוציה של הקינטיקה של ההיתוך בהשוואה לתבחינות בתפזורת.
מטרת המחקר
- להמחיש את תהליך ההיתוך של חלקיקי וירוס בודדים.
- לאנליזה את הקינטיקה של חצי-היתוך ויצירת נקבובית.
- לשפר את ההבנה של מנגנוני הכניסה הנגיפית.
שיטות ששימשו
- פונקציונליזציה של ציפוי מכסה עם דקסטרין.
- שילוב ציפויי מכסה בתאי זרימה מיקרופלואידיים.
- דגירה עם ליפוזומים ליצירת דו-שכבת שומנים.
- שימוש במיקרוסקופיה פלואורוסצנטית כדי לעקוב אחר אירועי היתוך נגיפיים.
תוצאות עיקריות
- המחשה מוצלחת של היתוך נגיפי ברמת חלקיק יחיד.
- תצפית בזמן אמת על הקינטיקה של חצי-היתוך ויצירת נקבובית.
- הוכחת הרגישות והספציפיות של התבחין.
- תובנות לגבי מנגנוני הכניסה הנגיפית לתאי מארח.
מסקנות
- התבחין הפלואורוסצנטי דו-הצבעוני הוא כלי רב-ערך לחקר ההיתוך הנגיפי.
- שיטה זו יכולה לשמש לסוגים שונים של נגיפים לתובנות רחבות יותר.
- מחקרים עתידיים עשויים לנצל את הטכניקה הזו כדי לחקור את יעילות התרופות האנטי-ויראליות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of viral fusion kinetics at the single particle level addresses a critical gap in understanding the mechanistic sequence of viral entry, enabling higher predictive confidence in target validation for antiviral discovery. This assay provides granular kinetic data that informs early-stage de-risking and supports portfolio decisions by distinguishing between fusion intermediates and their lifetimes. The approach enhances translational continuity from mechanistic insight to preclinical model alignment in virology-focused R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of viral entry mechanisms at the molecular level.
- Supports functional target validation by resolving hemifusion and pore formation steps.
- Facilitates mechanistic de-risking through quantitative lifetime measurements of fusion intermediates.
- Improves predictive confidence for antiviral target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated, reproducible platform for single-particle fusion event quantification.
- Delivers standardized, quantitative outputs for downstream compound screening workflows.
- Enables assay scalability and platform reuse for diverse viral systems.
- Supports reliable evaluation of fusion inhibitors and mechanistic probes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanistic fusion data with disease-relevant viral entry processes.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic findings to preclinical model validation.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for antiviral candidates targeting fusion steps.
- Enhances translational biomarker development by linking kinetic signatures to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This single-particle fusion assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging mechanistic studies and translational research in antiviral R&D.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for viral entry mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for compound evaluation and assay standardization.
- Analytics: Enables extraction of kinetic parameters and statistical distributions for fusion intermediates.
- Translational Research: Connects mechanistic fusion kinetics to preclinical model validation and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable assay platform adaptable to multiple viral targets and entry pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in viral target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible single-particle kinetic measurements.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management in antiviral discovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates targeting viral fusion.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and single-particle analysis.
- Demands access to high-sensitivity imaging instrumentation and microfluidic flow cell infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of labeling and imaging protocols.
- Adaptation to other viral systems may require optimization of fluorophore selection and bilayer composition.
- Photodamage and bilayer homogeneity are practical limitations that must be managed for assay reliability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Introduction
1:12
Preparing Dextran-Functionalized Coverslips
4:29
Preparing the Liposomes
8:28
Labeling the Virus Particles
6:41
Setting Up the Microfluidic Flow Cell
10:16
Observing Viral Fusion Kinetics Under the Microscope
13:10
Viral Hemifusion and Pore Formation Data: Microscope Footage, Fluorescence Intensity Trajectories, and Lag Times for Viral Hemifusion and Pore Formation
14:30
Conclusion
