Name: Denaturing polyacrylamide דשן גל אלקטרופורזה (עמוד דשן) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-29T07:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: למדו אלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילאמיד מדשן עם אוריאה לניתוח DNA ו-RNA חד-גדילי. השיטה מאפשרת הפרדה לפי משקל מולקולרי ושימושית בביוכימיה ובביולוגיה מולקולרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר האקדמי סינגפור (ARC) [מספר מענק 90/07]. אנו מודים Radiodurans על התמיכה.

פרוטוקול טקסט מלא ומפורט עבור הליך זה ניסיוני זמין הפרוטוקולים נוכחי בביולוגיה מולקולרית. מפורט צעד אחר צעד הוראות הרכבה של הכריך ג&#39;ל ועל מנגנון ג&#39;ל ניתן למצוא באתר האינטרנט של BioRad 3. ציוד חובה: צלחות זכוכית (פנימית וחיצונית) תא 10 ס&quot;מ: 10.1 x 7.3 ס&quot;מ (צלחת הפנימי), 10.1 x 8.2 ס&quot;מ (צלחת החיצוני), BioRad תא 20 ס&quot;מ: 20 x 20 ס&quot;מ (צלחת פנימי), 20 x 22.3 ס&quot;מ (צלחת החיצוני), BioRad 0.5-1.5 ג&#39;ל מסרק מ&quot;מ מפרידי ג&#39;ל לעמוד הליהוק ג&#39;ל מנגנון עם מכסה וכבלים כבלי מתח האספקה חימום לחסום או מי האמבט Pipettes סרולוגית וסיוע פיפטה פיפטה ו פיפטה טיפים הג&#39;ל מייבש או סורק ריאגנטים פתרונות: דשן (ultrapure) Polyacrylamide פתרון 40% (29:1) 10 x TBE פתרון (טריס-borate, EDTA חיץ) Deionized, מים מזוקקים TEMED 30% (w / v) persulfate פתרון אמוניום 0.5 x פתרון TBE לפוראמיד EDTA קסילן cyanol Bromphenol כחול מתנול אתנול <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נפח </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 50 מ&quot;ל </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 60 מ&quot;ל </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 10 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Acrylamide ריכוז </td><td> 10% </td><td> 12.5% </td><td> 15% </td><td> 10% </td><td> 12.5% </td><td> 15% </td><td> 10% </td><td> 12.5% </td><td> 15% </td></tr><tr><td> גרם אוריאה </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 28.8 </td><td> 28.8 </td><td> 28.8 </td><td> 4.8 </td><td> 4.8 </td><td> 4.8 </td></tr><tr><td> אקריל מ&quot;ל 40% (29:1) </td><td> 12.5 </td><td> 15.625 </td><td> 18.75 </td><td> 15 </td><td> 18.75 </td><td> 22.5 </td><td> 2.5 </td><td> 3.125 </td><td> 3.75 </td></tr><tr><td> ul 30% APS </td><td> 166 </td><td> 166 </td><td> 166 </td><td> 199.2 </td><td> 199.2 </td><td> 199.2 </td><td> 33 </td><td> 33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> ul TEMED </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 10 x TBE </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="10"> מלאו את עוצמת הקול עם מים מזוקקים deionized </td></tr></tbody></table> טבלה 1: ריאגנטים והפתרונות הדרושים ריכוזי acrylamide ואמצעי אחסון שונים לפתרון oligonucleotides תקועים אחד כריך ג&#39;ל הרכבה ג&#39;ל הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את הג&#39;ל על פי התיאור יצרנים לתקן את ג&#39;ל הג&#39;ל הליהוק קאמרית 3. השתמש 0.5-1.5 מפרידי עבה מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון המתאים polyacrylamide פי פרוטוקולים הנוכחי בביולוגיה מולקולרית או כמפורט בטבלה 1. עבור ג&#39;ל acrylamide denaturing של 20 ס&quot;מ X 22 ס&quot;מ X 1.5 מ&quot;מ, 60 מ&quot;ל של תמיסת ג&#39;ל ובמשך 10.1 x 8.2 ס&quot;מ x 1 מ&quot;מ ג&#39;ל 5 מ&quot;ל ג&#39;ל פתרון מספיק. ג&#39;ל מוגדלת משמשים כאשר המוצרים צפוי / להקות נמצאים בטווח של כמה בסיסים, אז ג&#39;ל כבר יפתור להקות עם הבדל של נוקלאוטיד בודד. אם להקות צפוי שונים יותר מ -10 נוקלאוטידים, ג&#39;לים קטן יהיה מתאים כדי לפתור את שברי. בחר את אחוז polyacrylamide שמתאים לדרישות ההפרדה שלך, ריכוזים גבוהים polyacrylamide יפתור שברי משקל מולקולרי נמוך. השתמש אוריאה ultrapure ומערבבים עם הסכום הרצוי acrylamide. הוסף חוצץ TBE לערבב את הג&#39;ל לקבל ריכוז סופי של 0.5-1 x TBE ולמלא את עוצמת הקול עם מים, deionized מזוקקים. מחממים את הפתרון למשך 20 שניות במיקרוגל ומערבבים בעדינות. עבור אמצעי אחסון ג&#39;ל גדול לחזור על שלב זה עד הפתרון הוא חם ביד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הג&#39;ל באופן מיידי באמצעות פיפטה סרולוגיות וכן סיוע פיפטה אוטומטית בין שני לוחות זכוכית. הימנע החדרת בועות אוויר. הכנס את המסרק ולתת הג&#39;ל לפלמר במשך 30-60 דקות. </li></ol> הגדרת מנגנון אלקטרופורזה ו prerun את הג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרדת את הג&#39;ל מהאולם הליהוק והרכבה אותו מנגנון ג&#39;ל לפי ההוראות מייצרת 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החדר מלא שנינות נמוך חיץ חיץ ריצה (0.5-1 x TBE) כי לוחות הזכוכית יהיה תתהתמזגה 2-3 ס&quot;מ עם חיץ. מלאו את תא חיץ העליון עד החלק העליון של הג&#39;ל עם ריצה חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את המסרק ולשטוף את הבארות עם חיץ פועל באמצעות פיפטה וג&#39;ל טעינת עצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את המכסה של מערכת ג&#39;ל וחבר בכבלים כדי לספק מתח גבוה חשמל. לפני שתוכל לטעון דגימות שלך אתה צריך prerun את הג&#39;ל על לפחות 30 דקות כדי לחמם את הג&#39;ל מעלה כדי להסיר אוריאה שנותרה מן הג&#39;ל. הטמפרטורה האופטימלית צריכה להיות בין 45-55 ° C. הימנע טמפרטורות גבוהות יותר מאשר 60 ° C כמו להקות למרוח או לוחות הזכוכית יכול יכול לפצח. בחר וואט קבוע עבור prerun (15-25 וואט לכל ג&#39;ל). </li></ol> לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים להכין דגימות שלך. לכן, הוסף את הכמות המתאימה של 2 x לערבב ג&#39;ל טעינת המדגם שלך. תמהיל טעינת לפוראמיד מכיל בדרך כלל 90%, 0.5% EDTA, cyanol קסילן 0.1% וכחול bromphenol 0.1%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני דגימות ניתן לטעון על הג&#39;ל, דגימות חייב להיות חום מפוגל ידי חימום הדגימות בין 70-90 מעלות צלזיוס במשך כמה דקות. </li></ol> לטעון ולהפעיל את הג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר prerun נגמר, להסיר את המכסה ולשטוף ביסודיות את כיסי כפי שתואר קודם כמו אוריאה חילחלה בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את דגימות בזהירות מהחלק התחתון של הכיס. הימנע החדרת בועות אוויר. טוען חיץ צריך להיות מיושם כיסים ריקים כדי לשמור על תנאים שווים במהלך הריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את המכסה ולהפעיל את הג&#39;ל על וואט קבוע כדי לשמור על טמפרטורה של 55 ° ג&#39;ל דומה prerun ה-C. שימו לב ההגירה של צבעים סמן עד הכניסה לצבוע הגיע לסוף התחתון של הג&#39;ל. משך לרוץ תלוי באחוז acrylamide בשימוש, חוזק היוני של למאגר ועובי ג&#39;ל. ריצה יכולה להימשך בין 2-4 שעות. בדיקת טמפרטורה של הג&#39;ל. מדחום ג&#39;ל יכול לעזור לפקח על הטמפרטורה הנכונה בזמן הריצה. </li></ol> תהליך ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר החזית לצבוע הגיע לסוף של הג&#39;ל לשים את הג&#39;ל מתוך החדר חיץ נמוך. הסר את ג&#39;ל מבית הבליעה וגם לשחרר את המלחציים. משוך ממנו את מפרידי ובזהירות להסוות לוחות הזכוכית. אם יש צורך לחתוך העליון המכיל גם חלק ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להעביר את הג&#39;ל לתוך צלחת עם פתרון ג&#39;ל קיבעון (ריכוז זהה של TBE בתוספת מתנול% אתנול ו 5-10). השאירו את הג&#39;ל לתוך התמיסה למשך 5-10 דקות ולשנות את חיץ פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הג&#39;ל הוא מוכן להמשך עיבוד באמצעות ג&#39;ל ואקום מייבש או סריקה ישירה של הג&#39;ל. </li></ol>

<ol><li>Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chain+length+determination+of+small+double-+and+single-stranded+DNA+molecules+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).</li>
<li>Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlbright%2C+LM+%22Curr+Protoc+Nucleic+Acid+Chem%22">Curr Protoc Nucleic Acid Chem</a>. , (2001).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PROTEAN+II+xi+Cell+and+PROTEAN+II+xi+2-D+Cell+Instruction+Manual%22">PROTEAN II xi Cell and PROTEAN II xi 2-D Cell Instruction Manual</a>. , Biorad. (2001).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החדות הלהקה תלוי במספר גורמים. היקף המדגם טעון ללהקות חדה צריך להיות קטן ככל האפשר, כלומר באופן אידיאלי בין μl 1-5. עם זאת, עד 15 μl ניתן לטעון שעדיין מבטיח פתרון מקובל. פחות נפח דגימה תוצאות להקות חדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איכות הלהקה תלוי גם בעובי ג&#39;ל. ג&#39;ל רזה יותר, כגון 0.75 מ&quot;מ להראות תוצאות טובות יותר מאשר 1.5 ג&#39;ל סמיך מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצורה של להקות יכולים גם להי...

denaturing polyacrylamide דשן ג&#39;ל אלקטרופורזה (עמוד דשן)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

PAGE דשן או denaturing polyacrylamide אוריאה ג&#39;ל אלקטרופורזה מעסיקה 6-8 אוריאה M, אשר denatures DNA משני מבנים או RNA, והוא משמש להפרדה שלהם במטריצה ​​polyacrylamide ג&#39;ל על בסיס משקל מולקולרי. שברים בין 2-500 בסיסים, עם הבדלי אורך קטנים כמו נוקלאוטיד יחיד, ניתן להפריד בשיטה זו: 1. ההגירה של המדגם תלוי בריכוז acrylamide הנבחר. אחוז גבוה יותר של polyacrylamide פותר שברי משקל מולקולרי נמוך. השילוב של אוריאה וטמפרטורות של 45-55 מעלות צלזיוס בזמן הריצה ג&#39;ל מאפשר להפריד את ה-DNA לא מובנים או מולקולות RNA. באופן כללי שיטה זו נדרש לנתח או לטהר גדילי דנ&quot;א בודדות או קטעי RNA, כמו oligonucleotides או מוצרים מסונתז או תווית של תגובות אנזימטיות מחשוף. במאמר זה אנו מציגים וידאו כיצד להכין ולהפעיל polyacrylamide ג&#39;לים denaturing אוריאה. טיפים טכניים כלולים, בנוסף 1,2 הפרוטוקול המקורי.

Denaturing polyacrylamide אוריאה ג&#39;ל אלקטרופורזה משמשת נפרד חד גדילי דנ&quot;א או רנ&quot;א עד לגבול של 500 נוקלאוטידים. אוראה בשילוב עם denatures דגימות חום גדילי יחיד מובנה נודדים בתוך המטריצה ​​ג&#39;ל לפי משקל מולקולרי שלהם.

Denaturing polyacrylamide דשן ג&#39;ל אלקטרופורזה (עמוד דשן)

אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד עם Urea או Urea PAGE (אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד דנטורטיבית עם Urea) עושה שימוש ב-6-8 M urea, אשר דנטוריביזציה של מבנים שניוניים של DNA או RNA, ומשמשת עבור ה...

באופן כללי, סוג זה של ג'ל נדרש להפרדה של מקטעי DNA או RNA בעלי גדיל יחיד, כגון אוליגונוקלאוטידים מסנתזים או מסומנים, או תוצרים של תגובות פילוח אנזימטי. טווח ההפרדה תלוי בריכוז הפוליאמיד; Urea בשילוב עם דנטורציה תרמית של הדגימות גורמת למולקולות בעלות גדיל יחיד לנדוד בתוך מטריצת הג'ל בהתאם למשקל המולקולרי שלהן. סרטון זה מציג את תהליכי היציקה, ההרצה והעיבוד של ג'ל טיפוסי.שלום, שמי הוא Haki. אני מאוניברסיטת Nang Technological. בהדגמה זו, אראה לכם כיצד לבצע אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד דנטורטיבי.השתמש בפלטות זכוכית נקיות והרכב את סנדוויץ' הג'ל בהתאם להוראות היצרן. קבע את הג'ל בתא היציקה הסטנדרטי לג'ל. השתמש בפלטות זכוכית עבור ג'לים גדולים אם הג'ל נוטה להידבק לפלטות הזכוכית.בחרו גודל ועובי של ג'ל בהתאם לדרישות ההפרדה שלכם. הכינו את תמיסת הג'ל בהתאם לפרוטוקולים עדכניים בביולוגיה מולקולרית.בחרו ריכוז פוליאמיד המתאים לדרישות ההפרדה שלכם. אחוז גבוה יותר של אקרילאמיד יאפשר הפרדה טובה יותר של מקטעים בעלי משקל מולקולרי נמוך. השתמשו ב-Alta pure UIA וערבבו עם הכמות הרצויה של פולי-אקרילאמיד בכ كأس או בבקבוק.הוסיפו 10 XTBE buffer לתמיסה והשלימו לנפח הנדרש בעזרת מים. חממו את התמיסה למשך 20 שניות במיקרוגל וערבבו בעדינות עד להמסה מלאה של ה-UIA. ניתן לאחסן את התמיסה במידת הצורך עבור נפחי ג'ל גדולים

denaturing-urea-polyacrylamide-gel-electrophoresis-urea-page

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה, אנו מתארים את האפיון של מתחמי multiprotein (MPCs) על ידי כחול אלקטרופורזה בג'ל יליד polyacrylamide (BN-PAGE). במימד ראשון, lysates הסלולר dialyzed מופרדים על ידי-BN לזהות MPCs בודדים. במימד השני SDS-PAGE, MPCs עניין מחולקים נוספת לנתח בוחריהם ידי immunoblotting.

ג&#39;ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

סרטון זה מדגים טכניקת הפרדה מבוססת פוליאקרילאמיד דנטורינג עבור חלבונים. טכניקה זו מסייעת בזיהוי ראשוני של חלבונים על בסיס משקלם המולקולרי.

נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה לניתוח חלבונים: טכניקה להפריד ולדמיין חלבונים על בסיס משקל מולקולרי

בסרטון זה, אנו מדגימים אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד דנטורינג להפרדת מיני RNA פוספורילציה מעמיתיהם שאינם פוספורילטים. מיני הרנ"א מסומנים באופן פלואורסצנטי לזיהוי לייזר על הג'ל.

דנטורינג אוריאה פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה לניתוח RNA: טכניקה להפרדת אוליגונוקלאוטידים של RNA עם תווית פלואורסצנטית מהמקבילות הלא זרחניות שלהם

בסרטון זה אנו מדגימים שיטת אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל המפרידה חלבונים בודדים מתערובת חלבונים מורכבת המתקבלת מרקמות גידוליות של אדנומת יותרת המוח האנושית הלא תפקודית (NFPA). החלבונים מופרדים על בסיס המטען החשמלי שלהם בממד הראשון ובהמשך מופרדים על בסיס משקלים מולקולריים בממד השני.

אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד דו-מימדי: טכניקת הפרדה לניתוח חלבונים בתערובת חלבונים מורכבת המבוססת על מטען ומשקל מולקולרי

RNA פולימראז II מסנתז RNA מבשר שמשתרע מעבר לקצה '3 של ה-mRNA הבוגרת. סוף RNA הבוגר מופק cotranscriptionally, באתר מוכתב על ידי רצפי הרנ"א, באמצעות פעילות endonuclease של מתחם המחשוף. הנה, אנחנו פירוט את השיטה ללמוד תגובות מחשוף במבחנה.

ניתוח של תגובות RNA עיבוד באמצעות מערכות חינם ניידים: 3 &#39;סוף המחשוף של Pre-mRNA מצעים<em&gt; במבחנה</em

מאמר זה מתאר פרוטוקול פשוט ומהיר להערכת המצב האוליגומרי של חלבון GTPase MxA דמוי דינמין מליזאטים של תאים אנושיים באמצעות שילוב של PAGE שאינו דנטורציה עם ניתוח כתמים מערביים.

אפיון של קומפלקסים חלבונים Multi-למקטע של MxA האדם שימוש ללא denaturing polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה

פרוטוקול זה משתמש בשני Coexpression למקטע ו למקטע postlysis ערבוב לבדיקה יסודית יותר של הרכבת הפרוטאזום רקומביננטי.

בחינת העצרת הפרוטאזום עם רקומביננטי Archaeal הפרוטאזומים ועמוד Nondenaturing: The Case for גישה משולבת

כאן אנו מציגים רגיש, מהיר, ומפלה שיטת להפלות מכתים את התמונה rnas מתויג עם ה-RNA מנגו aptamers I, II, III, או IV, באמצעות מקורי או באמצעות הרפתקאות אלקטרופורזה ג'ל אלקטרופורזה (PAGE) ג'לים. לאחר הפעלת ג'לים סטנדרטיים של דף, מנגו-מתויג RNA יכול להיות מוכתם בקלות עם TO1-Biotin ולאחר מכן ניתח באמצעות קוראי קרינה זמינים נפוץ.

הדמיית פלורסנט של מנגו-מתויג RNA ב-Pvc פוליאקרילאמיד באמצעות שיטת Poststaining

Denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה Gradient (DGGE)

וידאו זה מדגים את פרוטוקול ב assay אנגיוגנזה במבחנה כי משחזר שלבים שונים של אנגיוגנזה. זמן לשגות תמונות של הנבטה, היווצרות לומן, הסתעפות ו השקה - התכונות העיקריות של אנגיוגנזה - מוצגים.

אופטימליים הפיברין ג&#39;ל ביד Assay לחקר אנגיוגנזה

למדו אלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילאמיד מדשן עם אוריאה לניתוח DNA ו-RNA חד-גדילי. השיטה מאפשרת הפרדה לפי משקל מולקולרי ושימושית בביוכימיה ובביולוגיה מולקולרית.

Denaturing polyacrylamide דשן ג'ל אלקטרופורזה (עמוד דשן)

גלה סרטונים נוספים