Denaturing polyacrylamide דשן ג'ל אלקטרופורזה (עמוד דשן)
October 29th, 2009
Denaturing polyacrylamide אוריאה ג'ל אלקטרופורזה משמשת נפרד חד גדילי דנ"א או רנ"א עד לגבול של 500 נוקלאוטידים. אוראה בשילוב עם denatures דגימות חום גדילי יחיד מובנה נודדים בתוך המטריצה ג'ל לפי משקל מולקולרי שלהם.
באופן כללי, סוג זה של ג'ל נדרש להפרדת שברי DNA או RNA חד-גדיליים כגון אוליגונוקלאוטידים או מוצרים מסונתזים או מסומנים מתגובות מחשוף אנזימטיות. טווח ההפרדה תלוי בריכוז הפוליאמיד, אוריה בשילוב עם דנאס חום לדגימה ומולקולות חד-גדיליות נודדות בתוך מטריצת הג'ל בהתאם למשקל המולקולה שלהן. סרטון זה מציג את המזיגה, הריצה והעיבוד של ג'ל טיפוסי.
שלום, שמי האקי. אני באוניברסיטה הטכנולוגית של נאנג. בהדגמה זו, אני הולך להראות לכם כיצד לבצע אלקטרופורזה של פולי ג'ל Denaturing.
השתמש בצלחות זכוכית נקיות והרכיב את כריך הג'ל לפי תיאור היצרן. תקן את הג'ל בתא הסטנדרטי של יציקת הג'ל. הניחו את צלחות הזכוכית של ג'לים גדולים אם הג'ל נוטה להיצמד לצלחות הזכוכית.
בחר גודל ועובי ג'ל בהתאם לדרישות ההפרדה שלך. הכן את תמיסת הג'ל. על פי הפרוטוקולים הנוכחיים בביולוגיה מולקולרית.
בחר ריכוז של פוליאמיד המתאים לדרישות ההפרדה שלך. האחוז הגבוה ביותר של אקרילאמיד יפתור שברי משקל מולקולרי נמוכים יותר. יש להשתמש ב-Alta UIA טהור ולערבב עם הכמות הרצויה של פולי אקרילאמיד בכוס או בבקבוק.
הוסף מאגר 10 XTBE לתמיסה ומלא עד לנפח הנדרש במים. יש לחמם את התמיסה למשך 20 שניות במיקרוגל ולערבב בעדינות עד להמסת כל ה-UIA. ניתן לאחסן את התמיסה במידת הצורך לנפחי ג'ל גדולים יותר.
חזור על שלב המיקרוגל עד שהתמיסה חמה ביד. הימנע מחימום התמיסה יותר מדי. אין להתחמם יתר על המידה מכיוון שאוריה תתחיל להתפרק לאחר 60 מעלות.
ניתן לזהות צלזיוס על ידי ריח האמוניה. כאשר התמיסה צלולה והתקררה לטמפרטורת החדר בערך, הוסיפו PS ו-tamid לתמיסת הג'ל וערבבו אותה בעדינות. אם תמיסת הג'ל חמה מדי, הג'ל יתפלמר בתוך הפיפטה.
יוצקים את הג'ל בעזרת פיפטה סרולוגית ולאחר מכן בעזרת פיפטה בין שתי צלחות הזכוכית. הימנע מהכנסת בועות אוויר. הכנס את טקום בזהירות.
נסו לא ללכוד בועות אוויר ותנו לג'ל להתפלמר במשך 30 עד 60 דקות. נתק את הג'ל ממעמד היציקה והרכיב אותו לתא החיץ העליון. על פי פרוטוקול היצרן, הכניסו את הג'ל לתא החיץ התחתון ומלאו את המאגר התחתון במאגר ריצת ג'ל, שהוא בדרך כלל 0.5 עד XTBE אחד.
באותו ריכוז כמו לג'ל, מלאו את תא החיץ העליון במאגר רץ ג'ל עד לקצה צלחת הזכוכית. לפני שתוכל לטעון את הדגימות שלך, עליך להפעיל מראש את הג'ל למשך 30 דקות לפחות כדי לחמם את הג'ל ולהסיר שאריות מהג'ל. הטמפרטורה האופטימלית צריכה להיות בין 45 ל-55 מעלות צלזיוס, כמו עבור ריצת הג'ל בפועל.
הימנע מטמפרטורות גבוהות מ-60 מעלות מכיוון שרצועות עלולות להימרח או שלוחות הזכוכית עלולים להיסדק בזהירות. הסר את הרוגע מבלי להפריע לקצוות ושטוף דרכו את הבארות כדי להסיר אורות שדלפו לתוכם. השתמש בטיפים לטעינת ג'ל וצנר אותו למעלה ולמטה מספר פעמים.
עבור כל אחד מהם, חבר היטב את המכסה של מערכת הג'ל וחבר את הכבלים לאספקת חשמל במתח גבוה. בחר וואט קבוע להפעלה מוקדמת, כ-15 עד 20 וואט לג'ל. כאשר ספק הכוח נדלק, בועות אוויר מצביעות על מוליכות טובה.
בינתיים, הכן את הדגימות שלך, לכן בכמות המתאימה של טעינת שני x ג'ל לדגימה שלך. בסיום הריצה המוקדמת, הסר את המכסה ושטוף את הכיס היטב כמתואר קודם, חשוב מאוד לשטוף בזהירות את כיסי הג'ל. כדי להסיר שאריות אוריה כאוריה תיצור שכבה צפופה המונעת מהדגימה להיכנס לג'ל.
ממש לפניכם. החל את אופי חימום המדגם שלך, את הדגימה שלך על ידי דגירה ל-70 מעלות צלזיוס לפחות למשך מספר דקות. מרחו את הדגימות בזהירות מתחתית הכיס.
עבור יישומים מסוימים, הצבע מפריע לדגימה שלך ועלול לגרום לרצועות מפוזרות, או שהצבע מראה את האות הפלואורסצנטי. אז כדאי להסיר צבע אחד או את כל הצבעים ולטעון את הצבע הסטנדרטי המכיל חיץ. בבאר ריקה בגודל סטנדרטי, כמות הדגימה שעליך לטעון עבור להקות חדות היא באופן אידיאלי בין 1 ל-5 מיקרוליטר, אך ניתן לטעון גם נפחים גבוהים יותר עד 15 מיקרוליטר.
פחות נפח דגימה מביא ללהקות יפות יותר. הימנע מהכנסת בועות אוויר ותן לדגימה לשקוע בכיס לאט עד שנוצרת שכבה מאוחדת. אם אתה משתמש בתווית פלורסנט, ארוז את מערכת הג'ל לנפילת אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור, מה שעלול לגרום להלבנת פוטו של הדגימה שלך.
הרכיבו את המכסה והפעל את ספק הכוח. הפעל את הג'ל עד שחזית ה-DIA תגיע לקצה התחתון של הג'ל. משך הריצה תלוי באחוז האקרילאמיד.
אתה בוחר את חוזק ה-iion של עובי ואורך ג'ל החיץ שלך. ריצה יכולה להימשך בין שעה למספר שעות. שימו לב לנדידת המשווקים כדי לקבוע את משך ההקפאה החשמלית.
השתמש בוואט קבוע ובדוק את הטמפרטורה על הג'ל. מדחום ג'ל יכול לעזור לנטר את הטמפרטורה הנכונה במהלך הריצה או לבדוק את המדריך של מכשיר הג'ל כאשר הדרון הגיע לסוף. כבה את אספקת החשמל והסר את המכסה של מנגנון הג'ל.
לאחר מכן, הוציאו את כריך הג'ל מתא החיץ התחתון. יוצקים את המאגר מתא החיץ העליון. ממלאים צלחת בתמיסת קיבוע ג'ל.
תמיסה זו צריכה להיות בעלת אותו ריכוז של שחפת ובין חמישה ל-10% מתנול וחומצה אסתטית. הסר את כריך הג'ל מהמנגנון ושחרר את המהדקים. משוך את המרווחים ופרק בזהירות את לוחות הזכוכית באמצעות מרית במידת הצורך, חתוך את המשקולת לחלק ג'ל המכיל היטב או את חלק הג'ל הריק התחתון והשליך את חתיכות הג'ל המיותרות כמו נתיבים המכילים צבע.
עבור דגימות פלורסנט, נתק בזהירות את הג'ל מצלחת הזכוכית והעביר אותו לכלי מלא בתמיסת קיבוע ג'ל. השאירו את הג'ל בתמיסה למשך חמש עד 10 דקות והחליפו את המאגר פעמיים. יש לאכול בעדינות את המנה כדי לשטוף את המנה מהג'ל או לשים את הג'ל בתמיסת מכתים בהתאם ליישום שלך.
איכות הג'ל תלויה גם בעובי הג'ל. ג'לים דקים יותר כמו 0.75 מילימטר מראים תוצאות טובות יותר מג'לים בעובי 1.5 מילימטר, אך קשה יותר לטפל בהם. חדות הלהקות תלויה במספר גורמים.
מתח נמוך בתחילת הריצה יכול לעזור לקבל רצועות יפות יותר כמו גם הדגימה נכנסת לחזית הג'ל בצורה חלקה, וזה מונע שכיסי הג'ל יקרסו בגלל מתח גבוה. ג'ל ערימת אקרילאמיד קצר באחוז נמוך יכול להיות בעל אותו אפקט השחזת רצועה, כולל 10% גליצרול מסייע גם במהלך העמסת הג'ל והדגימה שוקעת לבאר. החל ביתר קלות את חוצץ הטעינה על כיסים ריקים כדי לשמור על תנאים שווים במהלך הריצה.
כאשר הג'ל שלך נמצא בתמיסת קיבוע, אתה יכול לייבש את הג'ל שלך באמצעות מייבש ג'ל ואקום להדמיה נוספת או לסרוק את הג'ל שלך ישירות בהתאם לתווית הירך או הכתם שבו אתה משתמש. דף U זה שימושי לניתוח או בידוד דגימות DNA או RNA חד-גדיליות. ניתן לאחסן ג'לים בטמפרטורת החדר.
לכן, עטפו את הג'ל במגבת נייר והשרו אותו במים או במאגר זורם. הכניסו את הג'ל העטוף והרטוב לשקית ניילון בגובה האיטום והשתמשו בו תוך 48 שעות. בעיה שנצפית לעתים קרובות היא חיוך ג'ל.
זאת בשל פיזור חום לא אחיד דרך הג'ל. אם הג'ל אינו מוקף במאגר, הצמדת לוחית מתכת יכולה להגביר את איכות הג'ל. היי, אני היי קאסם.
אני באוניברסיטה הטכנולוגית N Yang. הראיתי לך כיצד לבצע דנטור של פרזיס פולימיל. נתראה בפעם הבאה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד אוריאה מדנן היא טכניקה המשמשת להפרדת קטעי DNA או RNA חד-גדיליים. שיטה זו מסתמכת על השילוב של אוריאה וחום כדי לדנן דגימות, ומאפשרת לגדילים בודדים לא מובנים לנוע דרך מטריצת הג'ל על פי משקלם המולקולרי.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביוכימיה
- ביולוגיה מולקולרית
- גנטיקה
רקע
- טכניקה זו חיונית לניתוח אוליגונוקלאוטידים מסונתזים או מסומנים.
- היא משמשת גם למוצרים הנובעים מתגובות פיצול אנזימטיות.
- טווח ההפרדה מושפע מריכוז הפוליאקרילאמיד.
- הבנת המשקל המולקולרי חיונית לפרשנות תוצאות הג'ל.
מטרת המחקר
- להדגים את תהליך האלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד מדנן.
- להמחיש את יציקת הג'ל, הפעלתו ועיבודו של ג'ל טיפוסי.
- לספק מדריך חזותי לחוקרים בביולוגיה מולקולרית.
שיטות ששימשו
- הכנת הג'ל באמצעות אוריאה ופוליאקרילאמיד.
- יישום חום לדנן את הדגימות.
- העמסת DNA או RNA חד-גדיליים לתוך הג'ל.
- הפעלת הג'ל כדי להקל על הפרדה על פי המשקל המולקולרי.
תוצאות עיקריות
- הפרדה מוצלחת של חומצות גרעין חד-גדיליות.
- ויזואליזציה של דפוסי תנועה התואמים למשקל מולקולרי.
- הדגמה של יעילות התהליך המדנן.
- הצגה ברורה של שלבי עיבוד הג'ל.
מסקנות
- אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד אוריאה מדנן היא שיטה אמינה לניתוח חומצות גרעין.
- הטכניקה היא חיונית ליישומים שונים בביולוגיה מולקולרית.
- ביצוע נכון של השיטה מוביל לתוצאות שניתן לשחזרן ולפרשן.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE) is a foundational analytical tool for separating and purifying single-stranded DNA or RNA fragments with single-nucleotide resolution. This capability is critical for early discovery workflows, enabling precise characterization of oligonucleotides and enzymatic cleavage products that underpin target validation and assay development. Reliable nucleic acid separation supports predictive confidence and reduces ambiguity in molecular biology-driven biopharma R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-resolution analysis of synthesized or labeled oligonucleotides for target validation studies.
- Supports mechanistic de-risking by confirming the integrity and size of nucleic acid fragments.
- Facilitates functional validation of enzymatic cleavage products in pathway interrogation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-stranded DNA or RNA for downstream screening assays.
- Delivers reproducible, quantitative separation essential for assay standardization.
- Enables reliable evaluation of nucleic acid-based reagents and controls.
Translational & Preclinical Research
- Aligns nucleic acid fragment analysis with translational biomarker development when relevant.
- Ensures continuity from molecular discovery to preclinical nucleic acid characterization.
- Reduces risk in advancing nucleic acid-based candidates by confirming molecular identity.
Pipeline & Workflow Integration
Urea PAGE is positioned at the interface of early discovery and assay development, providing a critical quality control step before lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Confirms the size and purity of oligonucleotides and cleavage products for hypothesis testing.
- Screening: Ensures assay readiness by delivering reproducible, quantitative nucleic acid separation.
- Analytics: Provides high-resolution readouts for comparing experimental conditions and optimizing protocols.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by validating nucleic acid fragment integrity when applicable.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable analytical platform across multiple nucleic acid workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in nucleic acid analysis.
- Operational Value: Standardizes nucleic acid separation with scalable, reproducible protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by ensuring molecular quality at key inflection points.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of nucleic acid-based assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in gel preparation, sample handling, and temperature control.
- Needs access to electrophoresis instrumentation and gel imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of gel concentration and running conditions.
- Must adapt protocols for different fragment sizes and labeling strategies.
- Careful temperature and buffer management are essential to avoid gel artifacts and ensure reproducibility.
