Name: בתחום ההדמיה vivo של שכבות קליפתיים עמוק באמצעות Microprism (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: למדו הדמיה עמוקה של שכבות קליפת המוח בעכברים באמצעות מיקרופריזמות זכוכית. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה של כל שש השכבות הקליפתיות בו-זמנית ברזולוציה גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים אנתוני ג&#39;יי Koleske, PhD למתן העכברים YFP.

חלק 1: אופטיקה Microprism ותוכנית ההתקנה מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microprisms אנו משתמשים הינם 1 מ&quot;מ, בזווית ישרה מנסרות מזכוכית BK7 לרכוש חברת Optosigma (איור 1). Microprisms מטופלות באמצעות מלקחיים במידת האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היתר של microprism מצופה כסף משופרת לספק רפלקטיביות של 97% יותר מאשר 400-2000 ננומטר. זה מספק התבוננות פנימית של שני אור לייזר עירור לבין הקרינה הנפלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microprisms מטופלות תמיד באמצעות מלקחיים כאשר הדבר אפשרי. כפפות שחוקים בכל עת כדי לשמור על הפריזמה נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים שהותקן שני פוטונים המיקרוסקופ מסוגל הדמיה של חיות קטנות. בעלי חיים, המחובר למכשיר stereotactic, ממוקם על הבמה 3-ציר ממונע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המיקרוסקופ מחובר למחשב Windows רץ תוכנה ScanImage. ScanImage היא רכישת תמונה תוכנה נכתב על ידי Matlab Pologruto ואח&#39; 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה microprism, אנו אוספים תמונות ברזולוציה של 1024 x 1024 או 512 x 512 פיקסלים. בנוסף, אנו בדרך כלל סריקה בבית 2 ms / או קו 4 ms / קו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני סוגים של מטרות משמשים בניסויים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמצם נמוך מספרית (NA) אוויר אובייקטיבי הדמיה בתחום רחב של נוף (ראו טבלה של חומרים כימיים וציוד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NA גבוה אובייקטיבי אוויר עם צווארון זכוכית תיקון מסוגל מזעור סטיות המושרה על ידי כדורי 0-2 מ&quot;מ זכוכית (ר &#39;טבלה של חומרים כימיים וציוד). </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר החיה מוכן הדמיה תחת מטרה בהגדלה נמוכה, ליישר את דפוס raster מרובע סריקה של הלייזר עם החלק העליון של microprism. זה יעזור לכוון את התמונה ולעשות שימוש יעיל של כוח לייזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש גבוה יותר אובייקטיבי NA עם צווארון תיקון זכוכית, להגדיר את צווארון תיקון לתקן כ 1 מ&quot;מ זכוכית. לאחר תמונה פלורסנט מופיע במהלך הניסוי, אפשר להגיע בזהירות בתוך מיקרוסקופ כדי לייעל את צווארון תיקון על מנת למקסם את רזולוציית הדמיה. </li></ol> חלק 2: Non-הישרדות כירורגיה בעלי חיים הכנסת Microprism <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משך ההליך כולו, מן החתך הראשוני עד לסיום הדמיה, תלוי את מטרות הניסוי. עם זאת, המיקום הלא הישרדות microprism הליך כירורגי וניתן לצפות לקחת כ 30-40 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים (P30-P60) הם שקלו כראוי בהרדמה באמצעות זריקה IP של קטמין (100 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו xylazine (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג) למישור מתאים ניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הניסוי כולו, החיה יש לבדוק כל 15-20 דקות כדי להעריך את רמתו של הרדמה. אם החיה מגיבה חברת הבוהן קמצוץ, מנה של קטמין משלים / xylazine נדרשת. בדרך כלל מנה משלים הוא שליש המינון הראשוני יכול להיות מוכן מראש של מזרק להזרקה IP מיידי במקרה הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העכבר הוא הרדים כראוי, הרוב של השיער על הראש של החיה הוא גילח באמצעות גוזם עם להב # 40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נאיר ® מוחל על השערות שנותרו על ראשו כדי לסייע ליצור משטח ללא שערות שעלולות להפריע של microprism במהלך ההדמיה. אחרי 5 דקות, ® נאיר הוא ניקה באמצעות מטלית כותנה שקצהו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החיה הרדים ממוקם כראוי לתוך מכשיר stereotactic העכבר. במהלך ניתוחים הפעלות הדמיה חיה נשמר על כרית חימום מים מלאים נקבע על 36 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם ראש של חיה קבוע כראוי במקום אחד חתך נקי נעשית באמצעות אזמל לאורך הקו המדיאלי של הגולגולת כדי להפריד את העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמות קטנה של מי חמצן 3% מושם על כותנה שקצהו ספוגית ותוחל הגולגולת כדי לנקות את הקרומים שבין הגולגולת לבין העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מי חמצן גם עוזר לחשוף גבחת, ציון דרך חשוב לדעת היכן לבצע את craniotomy והכנס את microprism. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני craniotomy הוא התחיל, ברים האוזן בר לנשוך מותאמים כהלכה כדי להטות את הגולגולת חשוף כזה שזה בעצם רמה עם השולחן. זה מספק פלטפורמה טובה יותר עבור craniotomy. בנוסף, זה הופך את המשטח העליון של הניצב פריזמה עם האור עירור נכנסות. זה יעזור למזער סטיות אופטיות תוך הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בר שיניים קטן (~ 0.8 ראש בגודל מ&quot;מ) מחוברת לכלי Dremel ® באמצעות זרוע הארכה גמיש. עבור craniotomies, אנו קובעים את המהירות לכ 7,000 ל -10,000 rpms. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בר שיניים הוא רזה לאורך הגולגולת עד חריץ הכיכר הוקמה בשנת העצם. הצדדים של הכיכר כ 2-3 מ&quot;מ אורך ו 1.5 במרכז הזנב מ&quot;מ 1 מ&quot;מ לרוחב גבחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך דילול העצם עד פתח קטן הוא עשה דרך הגולגולת. זוג מלקחיים can להרים את דש עצם מן הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דורה יש להסיר לפני microprism יכול להיות מוכנס לתוך קליפת המוח. דימום נשלטת על ידי מיטב לתת לדם להקריש על פני השטח במשך מספר דקות. לאחר מכן, בדם קרוש מוסר באמצעות ספוג כירורגית לפני הכנסת microprism. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעזור לסייע ביישור של פריזמה עם קליפה, פנים האנכי של microprism היא בשורה במקביל מטפל על מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם פריזמה החזיקו כראוי, microprism כולו מוכנס עד החלק העליון של פריזמה הוא מיושר עם משטח neocortical. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מוכנס בצורה נכונה, microprism צריך להישאר במצב הנכון. כל דימום כי התוצאות הוא מינימלי יכול להיספג עם ספוג כירורגי קטן. לאחר פריזמה נמצאת במקום החיה מוכן הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר microprism נעשה שימוש בבעלי חיים, זה יכול להיות שימוש חוזר מספר פעמים. לעומת זאת, יש לנקות היטב כדי להסיר כל חומר ביולוגי הנותרים. ניתן להשיג זאת על ידי טבילה פריזמה לתוך נפח קטן של חומצה HCl, ואחריו טבילה לתוך מתנול. Microprism לנקות אז יכול להיות עטוף בנייר העדשה עד לשימוש עתידי. </li></ol> חלק 3: תוצאות נציג <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: תמונות של microprism ימנית זווית. פריזמות השתמשו בניסוי הזה הם אחד מילימטר, מנסרות BK7 זכוכית עם ציפוי כסף משופרת על היתר כדי לאפשר התבוננות פנימית של עירור אור פליטה. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2: תמונה של שכבה V נוירונים YFP פירמידה. הדמיה בתחום רחב של נוף עם microprism מגלה אוכלוסיה גדולה של גופי התא פירמידה ~ 800-900 מיקרומטר עמוק מפני השטח של קליפת המוח. בנוסף, דנדריטים apical הארכת לכיוון שכבת אני גם יכול להיפתר. בר סולם = 200 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3: המטרה הצמצם המספרי גבוה בשילוב עם microprism מספק רזולוציה מרחבית מספיק כדי לפתור הקוצים הדנדריטים על דנדריטים apical הנוירונים בשכבה V פירמידה. בר סולם = 10 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4: תמונה שהושגו באמצעות microprism וגם זנב זריקה לווריד של צבע פלואורסצנטי. התמונה מראה אנכית, כלי קליבר גדול המשתרעת באזורי מוח עמוקים נימים קטנים הסתעפות דרך בנפח קליפת המוח. בר סולם = 200 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5: שימוש מטרה גבוהה יותר הצמצם מספרית, רשת של נימים בתוך הניאוקורטקס ניתן הדמיה עם בפירוט רב יותר. בר סולם = 50 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig6.jpg" alt="איור 6" /> איור 6: Microprisms גם מאפשר הדמיה תאים דם אדומים (RBCs) זורם דרך כלי. RBCs לא לספוג את צבע פלואורסצנטי ולכן נתפסים פסים כהים על פני כלי השיט. על ידי סריקה קו לרוחב הכלי, ניתן להשיג מדידות של שטף RBC ומהירות. בר סולם = 10 מיקרומטר (הפס האופקי בתמונה למעלה ולמטה) ו 250 ms (סרגל אנכי בתמונה למטה).

<ol><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).</li>
</ol>

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי IACUC באוניברסיטת ייל.

שימוש microprism בניסוי הדמיה היא פשוטה יחסית, מציע יתרונות רבים עבור במחקרים vivo על הניאוקורטקס. דוגמאות מייצגות באמצעות טכניקה זו כוללת תמונות שצולמו מן העכברים הטרנסגניים לבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב נוירונים בקליפת המוח שכבה V. שימוש microprisms ניתן לראות אוסף גדול של גופי התא פירמידה בשכבה V, כמעט 1 מ&quot;מ מתחת לפני השטח של קליפת המוח. ראו גם הם דנדריטים apical שמרחיבים דרך כל השכבות השטחיות לפני לסטות לתוך עטרות (איור 2). העכברים המשמשים בניסויים אלה הם בעלי חיים מהונדס נ...

<table><tbody><tr><td>עם ציפוי כסף רפלקטורי משופר-(R77)</td><td>OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)</td><td>055-0010</td><td>עם ציפוי כסף רפלקטורי משופר-(R77)</td></tr><tr><td>Fluorescein-dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD70</td><td>70 kDa </td></tr><tr><td>עדשת אוויר 4x, עם 0.28 NA</td><td>Olympus Corporation</td><td>XLFLUOR 4x/340</td><td></td></tr><tr><td>עדשת אוויר 40x, עם 0.60 NA</td><td>Olympus Corporation</td><td>LUCPLFLN</td><td>עם תיקון לזכוכית כיסוי של 0-2 mm</td></tr></tbody></table>

בתחום ההדמיה vivo של שכבות קליפתיים עמוק באמצעות microprism

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

אנו מציגים פרוטוקול בתחום ההדמיה vivo של רקמת קליפת המוח באמצעות בדיקה עמוק במוח הדמיה בצורת microprism. Microprisms הם 1 מ&quot;מ בגודל יש ציפוי רפלקטיבי על היתר כדי לאפשר התבוננות פנימית של עירור אור פליטה. החללית microprism בו זמנית מספר רב של תמונות שכבות בקליפת המוח עם פרספקטיבה לראות בדרך כלל רק בהכנות פרוסה. תמונות נאספים עם גדול בתחום של נוף (~ 900 מיקרומטר). בנוסף, אנו מספקים פרטים על הליך בלתי הישרדות כירורגית ההתקנה מיקרוסקופ. תוצאות נציג לכלול תמונות של הנוירונים בשכבה V פירמידה מ Thy-1-H YFP בעכברים מראה דנדריטים apical שלהם הרחבת דרך שכבת קליפת המוח שטחית הרחבת לתוך הציציות. החלטה היה די כדי הדנדריטים התמונה קוצים ליד סומה של הנוירונים בשכבה V. הזרקה לווריד הזנב של צבע פלואורסצנטי חושף רשת סבוכה של כלי הדם בקליפת המוח. קו סריקה של כדוריות דם אדומות (RBCs) זורם דרך הנימים מגלה מהירות RBC ושיעורי השטף ניתן להשיג. זו בדיקה חדשנית microprism היא שיטה אלגנטית, חדשה וחזקה עדיין חזותי של מבנים הסלולר עמוק פונקציה קליפת המוח in vivo.

ימנית זווית microprisms מוכנס לתוך הניאוקורטקס העכבר מאפשר הדמיה עמוק של שכבות מרובות קליפת המוח עם מבט נמצא בדרך כלל פרוסה. אחת מילימטר microprisms מציעים בתחום של נוף רחב (~ 900 מיקרומטר) והחלטות מרחבי מספיק כדי לפתור את הקוצים הדנדריטים. אנו מדגימים שכבה V הדמיה עצבית הדמיה של כלי הדם neocortical באמצעות microprisms.

בתחום ההדמיה vivo של שכבות קליפתיים עמוק באמצעות Microprism

אנו מציגים פרוטוקול לדימוי in vivo של רקמה קורטיקלית באמצעות גשש לדימוי עמוק של המוח בצורת מיקרו-פריזמה. מיקרו-פריזמות הן בגודל של 1 מ"מ...

לטכניקות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית יש יכולת מוגבלת להדמיית מבנים עמוק בתוך רקמה, במיוחד בחומרים בעלי פיזור אור גבוה כגון רקמת מוח. אפילו במקרה של מיקרוסקופיה בדו-פוטון, עשוי להיות קושי רב להפיק תמונות איכותיות in vivo של מבנים עצביים הנמצאים בעומק של יותר מ-500 מיקרונים מפני השטח של הנאו-קורטקס. כאן, הקו הירוק מציין עומק של 500 מיקרונים.באופן כללי, שכבות ארבע, חמש ושש של הנאוקורטקס נמצאות במרחק של יותר מ-500 מיקרון מהפנימה. נראה כיצד מיקרו-פריזמה מזכוכית באורך של 1 מילימטר המוחדרת לנאוקורטקס יכולה להעביר אור אל תוך השכבות הקורטיקליות השטחיות והעמוקות וממנה החוצה. שימוש בטכניקה זו בעכבר מאפשר שדה ראייה של 1 מילימטר והדמיה של כל שש השכבות הקורטיקליות בו-זמנית, מזווית צפייה המאפיינת בדרך כלל רק רקמת מוח פרוסת.מיקרו-פריזמות מציעות שדה ראייה רחב המסוגל להדמיה של גופי תאי תאי Parametal בשכבה חמש עם הדנדריטים האפיקליים הארוכים שלהם ושל רשת כלי הדם המורכבת בנאוקורטקס, וכל זאת תוך שמירה על רזולוציה מרחבית המסוגלת להבחין בעמודי דנדריטים ובזרימת תאי דם אדומים דרך מיקרו-נימים. שמי תומס צ'יא ואני סטודנט לתואר מתקדמים במעבדתו של פרופסור מייקל לוין במחלקה להנדסה ביו-במדית באוניברסיטת Yale. הפרוטוקול שנדון בו בסרטון זה יעסוק באופן השימוש במיקרו-פריזמות זכוכית בזווית ישרה בגודל 1 mm כדי להפיק תמונות פלואורסצנציה של מבנים בעומק של 1 mm בנאוקורטקס של עכבר.המיקרו-פריזמות שבהן אנו משתמשים הן פריזמות זווית ישרה של מילימטר אחד, העשויות מזכוכית BK7 שנרכשו מחברת Opto Sigma. במיקרו-פריזמות מטפלים באמצעות פינצטה במידת האפשר. היתר של המיקרו-פריזמה מצופה בכסף משופר כדי לספק רפלקטיביות של יותר מ-97% מ-400 עד 2000 ננומטרים.דבר זה מספק השתקפות פנימית הן של אור עירור הלייזר והן של הפלואורסצנציה הנקלטת. אנו משתמשים במיקרוסקופ דו-פוטוני שנבנה בהתאמה אישית ומסוגל לדימות של בעלי חיים קטנים. בעל החיים, המחובר למכשיר סטריאוטקטי, מונח על במה ממוטרת בעלת שלושה צירים.המיקרוסקופ מחובר למחשב Windows המריץ את תוכנת scan image. תוכנת scan image היא תוכנה לרכישת תמונות שנכתבה ב-MATLAB על ידי Polo Gudo ואחרים. לצילום מיקרו-פריזמה (micro prism), אנו אוספים תמונות ברזולוציה של 10 24 על 10 24 או חמישה 12 על חמישה 12 פיקסלים.בנוסף, אנו סורקים בדרך כלל במהירות של שתי מילישניות לשורה או ארבע מילישניות לשורה. היבט חשוב של פרוטוקול זה הוא סוג עדשות המיקרוסקופ המשמשות בשילוב עם המיקרו-פריזמות. בניסויים נעשה שימוש בשני סוגי עדשות.העדשה משמאל היא עדשת אוויר בעלת מפתח מספרי (NA) נמוך להדמיה של שדות ראייה רחבים, במקרה זה, עדשת Olympus של 4x 0.28 NA. העדשה מימין היא עדשת אוויר בעלת NA גבוה של 40x 0.60, עם טבעת תיקון מזכוכית המסוגלת למזער אבֵרציות ספריות הנגרמות על ידי אפס עד שני מילימטרים של זכוכית. כדי להכין את העכבר לניתוח ולהחדרה של המיקרו-פריזמה, השלב הראשון הוא הרדמה נכונה של בעל החיים לרמה המתאימה להליכים כירורגיים.ראשית, נרשם משקל בעל החיים בהתאם למינון שנקבע. נפח מתאים של תערובת קטמין וקסילזין נשאב לתוך מזרק. התרופות להרדמה מוזרקות בזרקור תוך-פערי (IP) באמצעות מחט בכישור (gauge) 28.ברגע שהעכבר נמצא במישור הרדמה המתאים להליכים כירורגיים, רוב הפרווה על ראשו של בעל החיים מגולחת באמצעות תספר עם להב מספר 40. לאחר מכן, נמרח NA על השיער שנותר על הראש כדי לסייע ביצירת משטח נקי משערות שעלולות להפריע למיקרו-פריזמה. במהלך הדמיה, לאחר חמש דקות, מנקים את ה-NA באמצעות מקלון צמר גפן, ומניחים את בעל החיים המורדם כראוי בתוך מכשיר סטריאוטקטי לעכברים.במהלך הפרוצדורות הכירורגיות ומפגשי ההדמיה, בעל החיים מונח על פד חימום ממולא במים המכוון ל-36 °C. כאשר ראשו של בעל החיים מקובע כראוי במקומו, מבצעים חתך נקי אחד לאורך הקו המדיאלי של הגולגולת. כדי להפריד את העור, מניחים כמות קטנה של 3% Hydrogen peroxide על מקלוני צמר גפן ומורחים על הגולגולת כדי להסיר את הממברנות שבין הגולגולת לעור.המימן פראוקסיד מסייע גם בחשיפת ה-BMA, נקודת ציון מרכזית להבנת המיקום שבו יש לבצע את הקרניוטומי ולהחדיר את המיקרו-פריזמה. לפני תחילת הקרניוטומי, מוטות האוזניים ומוט הנשיכה מכוונים כראוי כדי להטות את הגולגולת החשופה כך שתהיה במקביל לשולחן. דבר זה מספק תשתית טובה יותר לביצוע הקרניוטומי.מקדח שיניים קטן מחובר לכלי Dremel לצורך ביצוע קרניוטומיות. אנו מכוונים את המהירות לכ-7,000 עד 10,000 RPMs. מקדח השיניים מועבר על פני הגולגולת עד להיווצרות חריץ ריבועי בעצם.צלעות הריבוע הן באורך של כמעט שני עד שלושה מילימטרים ונמצאות במרכז. 1.5 מילימטרים כודל, ואלף מילימטרים רמה לטראלית ממשיכים בדילול העצם עד שנוצר פתח קטן דרך הגולגולת. ניתן להרים את לשונית העצם באמצעות פינצטה.יש להסיר את הקשורה (dura) לפני שניתן להחדיר את המיקרו-פריזמה אל קליפת המוח (cortex). את הדימום ניתן לשלוט בו בצורה הטובה ביותר על ידי השארת הדם להיקרש על פני השטח למשך מספר דקות. לאחר מכן, מסירים את הדם הקרוג באמצעות ספוג כירורגי כדי לסייע ביישור הפריזמה ביחס לקליפת המוח.הפנים האנכי של המיקרו-פריזמה מיושר במקביל לידיות של הפינצטה. כאשר הפריזמה מוחזקת כראוי, מחדירים את כל המיקרו-פריזמה עד שהחלק העליון שלה נמצא במישור עם פני השטח של הנאוקורטקס. כאן ניתן לראות את הפריזמה מונחת בנאוקורטקס.כאשר המיקרו-פריזמה מוחדרת נכון, היא אמורה להישאר במיקום המתאים. כל דימום שנוצר הוא מינימלי וניתן לספיגתו באמצעות ספוג כירורגי קטן. ברגע שהפריזמה במקומה, בעל החיים מוכן להדמיה.תחת עדשה בעלת הגדלה נמוכה, ניתן לראות את סריקת הרסטר של הלייזר על גבי המיקרו-פריזמה על פני השטח של המוח. להלן מספר דוגמאות מייצגות של תמונות שצולמו מעכברים טרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי צהוב. בנוירונים קורטיקליים בשכבה חמישה באמצעות מיקרו-פריזמות, ניתן לראות אוסף של גופי תאים פירמידליים גדולים בשכבה חמישה, כמעט מילימטר אחד מתחת לפני השטח של הקורטקס.ניתן לראות גם את הדנדריטים האפיקליים המשתרעים דרך כל השכבות השטחיות לפני שהם מתפצלים לצמתים (Tufts); באמצעות עדשה בעלת מספר מפתח גבוה עם טבעת תיקון זכוכית, ניתן להבחין בקוצים דנדריטיים במקרה זה. בדנדריטים האפיקליים של נוירונים פרא-מטליים בשכבה חמש, הקוצים הדנדריטיים הם מבנים תת-מיקרוניים, וכמה מהם מזוהים בתמונה באמצעות חצי חצים צהובים. ניתן גם לסמן את כלי הדם הקורטיקליים בצבע פלואורסצנטי, כגון פלואורסצין דקסטראן, תוך שימוש בטכניקות מבוססות של הזרקה לווריד הזנב.באמצעות טכניקה זו, ניתן לראות כלי דם בעלי קליבר גדול יותר השוכנים בשכבות עמוקות, המשתרעים לעבר ה-PIA ומתפצלים ליצירת רשת של מיקרו-נימיים. רשת עדינה זו של מיקרו-נימיים בנאוקורטקס נראית בצורה הטובה ביותר באמצעות עדשה בעלת מפתח נומרי גבוה. בנוסף, ניתן למדוד את המהירות והזרימה של כדוריות דם אדומות ממיקרו-נימיים עמוקים בנאוקורטקס באמצעות סריקת קו (line scanning).הקו האדום מציין את תבנית סריקת השורות בתמונת הנימיליות דרך המיקרו-פריזמה. מכיוון שתאי דם אדומים אינם סופחים את הצבע הפלואורסצנטי, הם יופיעו כפסים כהים. התמונה למטה היא תוצאה של סריקת שורה עם ממד מרחבי ב-AEs אחד וממד זמני ב-AEs השני.באמצעות AEs מאלו ניתן לחשב את השטף ואת המהירות של כדוריות דם אדומות דרך הנימא. לאחר שימוש במיקרו-פריזמה בבעל חיים, ניתן להשתמש בה שוב מספר פעמים. עם זאת, יש לנקות אותה כראוי כדי להסיר כל שארית של חומר ביולוגי.ניתן לבצע זאת על ידי טבילת הפריזמה בנפח קטן של חומצה כלורית, ולאחר מכן טבילה במתנול. ניתן לעטוף את המיקרו-פריזמה הנקייה בנייר עדשות עד למועד השימוש. בכך מסתיים הפרוטוקול שלנו לשימוש במיקרו-פריזמות לצילום קורטקלי in vivo בעכברים.שימוש במיקרו-פריזמות בניסוי דימוי הוא פשוט יחסית ומציע יתרונות רבים כאשר מדובר במחקרי in vivo של הנאו-קורטקס. אנו מקווים שמצאתם טכניקה זו למעניינת ושתוכלו להשתמש בה במעבדתכם בעתיד. תודה לצפייה ובהצלחה.

in-vivo-imaging-of-deep-cortical-layers-using-a-microprism

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כדי להבין את הדינמיקה של הרשת microcircuits ב הניאוקורטקס, חיוני להקליט בו זמנית את הפעילות של מספר גדול של נוירונים. In-vivo שני הפוטונים הדמיה סידן היא השיטה היחידה המאפשרת להקליט את הפעילות העצבית של אוכלוסייה צפופה עם רזולוציה של תא בודד.

In vivo 2-Photon סידן הדמיה ב Layer 2 / 3 של עכברים

בחומר וידאו משלים זה, אנו מראים פרוטוקול עבור...

הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

שינויים מולקולריים חוויה תלויה בתאי עצב חיוניים ליכולתו של המוח להסתגל בתגובה לאתגרים התנהגותיים.

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

הדמיית זמן-lapse בבעל חיים חי מספקת מידע רב ערך על ארגון מחדש מבני במוח השלם. כאן, אנו מציגים תכשיר גולגולת דק המאפשר הדמיה טרנס-גולגולתית של מבנים סינפטיים בעלי תווית פלואורסצנטית בקליפת העכבר החי על ידי מיקרוסקופ דו-פוטוני.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

כאן, אנו מציגים הליך לביצוע בקנה מידה גדול Ca 2 + הדמיה עם רזולוציה הסלולר על פני שכבות קליפת המוח מרובים בעכברים נעים באופן חופשי. מאות תאים פעילים ניתן לצפות בו זמנית באמצעות מיקרוסקופ מיניאטורי, ראש רכוב יחד עם בדיקה מנסר פריזמה.

רב שכבתיים Ca קליפת המוח<sup&gt; 2+</sup&gt; הדמיה בחופשיות העברת עכברים עם בדיקות פריזמה מיקרוסקופית פלואורסצנטי מיניאטורי

כאן נתאר תהליך ניקוי רקמות, תיוג פלורסנט של הדמיה בקנה מידה גדול של רקמת מוח העכבר המאפשרת, ובכך, ויזואליזציה של הארגון תלת מימדי של סוגי תאים בתוך קליפת.

הדמיה תלת מימדי בקנה מידה גדול של ארגון הסלולר קליפת העכבר

נציג של ויוו שני הפוטונים הדמיה פרוטוקול הדמיה ההכרויות neonatal עכברים. שיטה זו מתאימה לניתוח הדינמיקות התפתחותית של נוירונים בקליפת המוח, המנגנונים המולקולריים הדינמיקות עצביים ועל שינויים עצביים dynamics במודלים של המחלה.

אין ויוו שני הפוטונים הדמיה של נוירונים בקליפת המוח בעכברים Neonatal

מאמר זה מתאר שיטה לתצפית כרונית in vivo של תאי מיקרוגליה במנוחה בהיפוקמפוס עכבר CA1 באמצעות ניתוח מבוקר מדויק ומיקרוסקופ שני פוטונים.

ב Vivo הדמיה כרונית של שני פוטונים של תאי מיקרוגליה בהיפוקמפוס העכבר

בשילוב עם לוחית ראש ועיצוב אופטי התואם למיקרוסקופים של פוטון בודד ושני פוטונים, עדשת המיקרופריזמה מציגה יתרון משמעותי במדידת תגובות עצביות בטור אנכי בתנאים מגוונים, כולל ניסויים מבוקרים היטב במצבים קבועים בראש או משימות התנהגותיות טבעיות בבעלי חיים הנעים בחופשיות.

הדמיה ארוכת טווח של אוכלוסיות עצביות מזוהות באמצעות מיקרופריזמות בבעלי חיים הנעים בחופשיות ומקובעים לראש

פרוטוקול זה מכיל תיאור מקיף של גישה שלב אחר שלב למודל עכבר חלון גולגולתי כרוני ותסחיף מיקרווסקולרי מותאם להדמיה מיקרוסקופית דו-פוטונית בתוך ה-vivo באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן פלואורסצנטיות.

מודל עכבר של תסחיף מיקרווסקולרי למיקרוסקופיה דו-פוטונית בחיים באמצעות מיקרוספירות פוליסטירן פלואורסצנטיות

פרוטוקול זה מפרט הדמיית סידן ב-vivo של נוירונים היפותלמיים באמצעות מיקרוסקופ מוקטן (מיניסקופ) בעכברים המתנהגים בחופשיות במהלך מניפולציה של מצב חברתי (בידוד חברתי ואיחוד חברתי). שיטה זו מאפשרת דימות ברזולוציה של נוירון יחיד של פעילות ההיפותלמוסית שמייצגת צורך חברתי וסיפוק חברתי, ומאפשרת מחקרים מכניים של הומאוסטזיס חברתי.

In Vivo הדמיית סידן עם מיקרוסקופ מיניאטורי בהיפותלמוס להבנת התנהגויות חברתיות בעכברים

למדו הדמיה עמוקה של שכבות קליפת המוח בעכברים באמצעות מיקרופריזמות זכוכית. שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה של כל שש השכבות הקליפתיות בו-זמנית ברזולוציה גבוהה.

בתחום ההדמיה vivo של שכבות קליפתיים עמוק באמצעות Microprism

גלה סרטונים נוספים