בתחום ההדמיה vivo של שכבות קליפתיים עמוק באמצעות Microprism

ימנית זווית microprisms מוכנס לתוך הניאוקורטקס העכבר מאפשר הדמיה עמוק של שכבות מרובות קליפת המוח עם מבט נמצא בדרך כלל פרוסה. אחת מילימטר microprisms מציעים בתחום של נוף רחב (~ 900 מיקרומטר) והחלטות מרחבי מספיק כדי לפתור את הקוצים הדנדריטים. אנו מדגימים שכבה V הדמיה עצבית הדמיה של כלי הדם neocortical באמצעות microprisms.

לטכניקות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות יש יכולת מוגבלת לדמות מבנים עמוק בתוך רקמה, במיוחד בחומרים המפזרים אור גבוה כגון רקמת מוח. גם במקרה של מיקרוסקופ שני פוטונים, זה יכול להיות קשה מאוד לייצר תמונות in vivo באיכות גבוהה של מבנים עצביים עמוקים יותר מ-500 מיקרון מהמשטח הניאו-קורטיקלי. כאן, הקו הירוק מציין עומק של 500 מיקרון.

באופן כללי, שכבות ניאו-קורטיקליות ארבע, חמש ושש גדולות מ-500 מיקרון מפני השטח. נראה כיצד מיקרו-פריזמה מזכוכית של מילימטר אחד המוחדרת לניאו-קורטקס יכולה להעביר אור לתוך ומחוץ לשכבות קליפת המוח השטחיות והעמוקות. באמצעות טכניקה זו בעכבר, ניתן לקבל שדה ראייה של מילימטר אחד ולדמיין את כל שש שכבות קליפת המוח בו זמנית בפרספקטיבה של הדמיה, הנמצאת בדרך כלל רק ברקמת מוח חתוכה.

מיקרו פריזמות מציעות שדה ראייה רחב המסוגל לדמיין גופי תאי פרמטאל בשכבה חמש עם הדנדריטים האפיקליים הארוכים שלהם ורשת כלי הדם המורכבת בניאו-קורטקס, כל זאת תוך שמירה על רזולוציות מרחביות המסוגלות לפתור קוצים דנדריטיים וזרימת כדוריות דם אדומות דרך מיקרו-נימים. שמי תומס צ'יה ואני סטודנט לתואר שני במעבדה של פרופסור מייקל לוין במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת ייל. הפרוטוקול בו נדון בסרטון זה יהיה כיצד להשתמש במיקרו מנסרות זכוכית בזווית ישרה של מילימטר אחד כדי ליצור תמונות פלואורסצנטיות של מבנים בעומק של מילימטר אחד בניאו-קורטקס של עכבר.

מנסרות המיקרו בהן אנו משתמשים הן מנסרות זווית ישרה של מילימטר אחד העשויות מזכוכית BK שבע שנרכשו מתאגיד Opto Sigma. מיקרו פריזמות מטופלות באמצעות מלקחיים במידת האפשר. ההיפוטנוזה של המיקרו פריזמה מצופה בכסף משופר כדי לספק רפלקטיביות של יותר מ-97% מ-400 עד 2000 ננומטר.

זה מספק השתקפות פנימית הן של אור עירור הלייזר והן של הקרינה המאוחדת. אנו משתמשים במיקרוסקופ שני פוטונים שנבנה בהתאמה אישית המסוגל לדמות חיות קטנות. החיה המחוברת למכשיר סטריאוטקטי מונחת על במה ממונעת בעלת שלושה צירים.

המיקרוסקופ מחובר למחשב Windows שבו פועלת תמונת סריקה. תמונת סריקת תוכנה היא תוכנה לרכישת תמונות שנכתבה ב-MATLAB על ידי Polo Gudo, et al. לצורך הדמיית מיקרו פריזמה, אנו אוספים תמונות ברזולוציה של 10 24 על 10 24 או חמש 12 על 5 12 פיקסלים.

בנוסף, אנו סורקים בדרך כלל בשתי אלפיות שנייה לשורה או ארבע אלפיות שנייה לשורה. היבט חשוב של פרוטוקול זה הוא סוג מטרות המיקרוסקופ המשמשות בשילוב עם מנסרות המיקרו. שני סוגים של מטרות משמשים בניסויים.

המטרה משמאל היא מטרה אווירית עם צמצם מספרי נמוך עבור שדות ראייה רחבים הדמיה, במקרה זה, יעד אולימפוס של ארבעה x 0.28 NA. המטרה מימין היא מטרת אוויר NA בגובה 40 x 0.60 עם צווארון תיקון זכוכית המסוגל למזער סטיות כדוריות הנגרמות על ידי אפס עד שני מילימטרים של זכוכית. על מנת להכין את העכבר לניתוח ולהחדרת המיקרו פריזמה, הצעד הראשון הוא הרדמה נכונה של בעל החיים לרמה המתאימה להליכים כירורגיים.

ראשית, משקל החיה נרשם על סמך המינון שנקבע. נפח מתאים של קוקטייל קטמין וקסילזין נשלף למזרק. תרופות ההרדמה מועברות באמצעות הזרקת IP באמצעות מחט בגודל 28.

ברגע שהעכבר נמצא במישור הרדמה המתאים להליכים כירורגיים, רוב השיער על ראש החיה מגולח באמצעות רעד עם להב מספר 40. לאחר מכן מורחים נארה על השערות הנותרות על הראש כדי לסייע ביצירת משטח נקי משערות שעלולות להפריע למיקרו פריזמה. במהלך ההדמיה, לאחר חמש דקות, מנקים את ה-NA באמצעות ספוגית עם קצה כותנה, החיה המורדמת מונחת כראוי במכשיר סטריאוטקטי של עכבר.

במהלך ההליכים הכירורגיים ומפגשי ההדמיה, החיה מוחזקת על כרית חימום מלאה במים המכוונת ל-36 מעלות צלזיוס. כאשר ראש החיה מקובע כראוי במקומו, נעשה חתך נקי אחד לאורך הקו המדיאלי של הגולגולת. כדי להפריד את העור, כמות קטנה של 3% מי חמצן מונחת על ספוגית קצה כותנה ומורחת על הגולגולת כדי לנקות את הקרומים בין הגולגולת לעור.

מי החמצן גם עוזרים לחשוף BMA, ציון דרך מרכזי בידיעה היכן לבצע את הגולגולת ולהכניס את המיקרו פריזמה. לפני תחילת הגולגולת, מוטות האוזניים ומוט הנשיכה מותאמים כראוי כדי להטות את הגולגולת החשופה כך שהיא בעצם בגובה השולחן. זה מספק פלטפורמה טובה יותר לקרניוטומיה.

בור שיניים קטן מחובר לכלי דרמל לקרניוטומיה. הגדרנו את המהירות לכ-7,000 עד 10,000 סל"ד. קוץ השיניים מרפרף לאורך הגולגולת עד שנוצר חריץ מרובע בעצם.

דפנות הריבוע באורך של כשניים עד שלושה מילימטרים וממורכזות. 1.5 מילימטר קודד, ורמה רוחבית של מילימטר אחד ממשיכים לדלל את העצם עד שנוצר פתח קטן דרך הגולגולת. זוג מלקחיים יכולים להרים את דש העצם.

יש להסיר את הדורה לפני שניתן יהיה להחדיר את המיקרו-פריזמה לקליפת המוח. הדימום נשלט בצורה הטובה ביותר על ידי מתן לדם להיקרש על פני השטח למשך מספר דקות. לאחר מכן, הדם הקרוש מוסר באמצעות ספוג כירורגי כדי לסייע ליישור הפריזמה עם קליפת המוח.

הפנים האנכיות של המיקרו פריזמה מסודרות במקביל לידיות המלקחיים. כשהמנסרה מוחזקת כהלכה, כל המיקרו פריזמה מוכנסת עד שהחלק העליון של המנסרה סומק עם המשטח הניאו-קורטיקלי. כאן אנו יכולים לראות את הפריזמה נחה בניאו-קורטקס.

כאשר היא מוכנסת כהלכה, המיקרו פריזמה צריכה להישאר במצב הנכון. כל דימום שנוצר הוא מינימלי וניתן לספוג אותו עם ספוג כירורגי קטן. ברגע שהפריזמה נמצאת במקומה, החיה מוכנה להדמיה עם החיה.

תחת מטרת הגדלה נמוכה, ניתן לראות את רסטר הלייזר סורק מעל המיקרו פריזמה על פני המוח. להלן כמה דוגמאות מייצגות לתמונות שצולמו מעכברים טרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי צהוב. בתאי עצב בקליפת המוח בשכבה חמש באמצעות מיקרו פריזמות, ניתן לראות אוסף של גופי תאי פרה-מתכת גדולים בשכבה חמש, כמעט מילימטר אחד מתחת לפני השטח של קליפת המוח.

כמו כן נראים הדנדריטים האפיקליים המשתרעים דרך כל השכבות השטחיות לפני שהם מתפצלים ל-Tufts באמצעות אובייקט צמצם מספרי גבוה עם צווארון תיקון הזכוכית, ניתן לפתור קוצים דנדריטיים במקרה זה. על הדנדריטים האפיקליים של נוירונים פרמטאליים בשכבה חמש, קוצים דנדריטיים הם מבנים תת-מיקרוניים וכמה מזוהים בתמונה באמצעות ראשי חץ צהובים. אפשר גם לתייג את כלי הדם בקליפת המוח בצבע פלואורסצנטי, כגון פלואורסצאין דקסטרן באמצעות טכניקות הזרקת וריד זנב מבוססות.

באמצעות טכניקה זו, ניתן לראות את כלי הדם הגדולים יותר משכבות עמוקות הנמשכים לכיוון ה-PIA ומסתעפים ליצירת רשת של מיקרו-נימים. רשת עדינה זו של מיקרו נימים בניאו-קורטקס מוערכת בצורה הטובה ביותר באמצעות יעד צמצם מספרי גבוה. בנוסף, ניתן למדוד את מהירות ושטף תאי הדם האדומים מנימים ניאו-קורטיקליים עמוקים על ידי סריקת קו.

הקו האדום מציין את דפוס סריקת הקו בתמונה הנימים דרך המיקרו פריזמה. מכיוון שתאי דם אדומים אינם קולטים את הצבע הפלואורסצנטי, הם יופיעו כפסים כהים. התמונה בתחתית היא תוצאה של סריקת קו עם ממד מרחבי ב-AE אחד וממד זמני בשני.

AEs מזה יכולים לחשב את השטף והמהירות של כדוריות הדם האדומות דרך הנימים. לאחר שימוש במיקרו פריזמה בבעל חיים, ניתן לעשות בה שימוש חוזר מספר פעמים. עם זאת, יש לנקות אותו כראוי כדי להסיר את כל החומר הביולוגי שנותר.

ניתן להשיג זאת על ידי טבילת המנסרה בנפח קטן של חומצה הידרוכלורית, ולאחר מכן טבילה במתנול. לאחר מכן ניתן לעטוף את המיקרו פריזמה הנקייה בנייר עדשות עד לשימוש בתכונה. זה מסכם את הפרוטוקול שלנו לשימוש במיקרו פריזמות להדמיה קליפת המוח in vivo בעכברים.

השימוש במיקרו פריזמות בניסוי הדמיה הוא פשוט יחסית ומציע יתרונות רבים בכל הנוגע למחקרי in vivo על הניאו-קורטקס. אנו מקווים שמצאתם שזו טכניקה מעניינת וכזו שתוכלו להשתמש בה במעבדה שלכם בעתיד. תודה על הצפייה ובהצלחה.