הערכה כמותית של Lipidome שמרים באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה
21 באוגוסט 2009
אנו מתארים שיטה חדשה lipidomics כמותי לזיהוי שומנים מינים רבים שמרים באמצעות סקר סריקה יינון electrospray ספקטרומטריית מסה (ESI / MS). שיטה זו עולה כיום השיטות הזמינות לזיהוי שומנים וכימות ביכולת לפתור צורות מולקולריות שונים של שומנים, רגישות, ומהירות.
פרוטוקול זה מאפשר לנתח במהירות את המרכיבים העיקריים של שומני השמרים. זה מתחיל בקטיף ושטיפת תאי שמרים. תאים שטופים מונחים בכלורופורם אחד עד שניים, תערובת מתנול וליזה עם חרוזי זכוכית.
תוספת של כלורופורם ומים מפרידה בין שני השלבים. השלב האורגני נאסף, מיובש, ולאחר מכן סרט השומנים מומס בכלורופורם לאחסון לפני ספקטרוסקופיה מסה. השומנים המופקים מדוללים בכלורופורם ומתנול עם אמוניום הידרוקסיד ומוסיפים תערובת של תקנים פנימיים.
כעת ניתן להזריק את תמיסת השומנים ישירות לספקטרומטר המסה. היי, אני סיימון בורק מהמעבדה של ולדימיר טקו במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת קונקורדיה. היום אני הולך להראות לכם שיטה לכימות שומני שמרים באמצעות ספקטרוסקופיה מסה.
אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור שינויים של שומני שמרים בתנאי גידול שונים. אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, יש להשעות את כדורי השמרים הקפואים שהוכנו בעבר ב -1.6 מיליליטר קרח, מים מזוקקים קרים ולהעביר 1.6 מיליליטר ממתלה התאים לצינורות צנטריפוגה מזכוכית במהירות גבוהה.
שימו לב שלאורך הליך זה, כל המניפולציות עם שומנים שחולצו נעשות באמצעות פיפטות זכוכית או מזרקים. מכיוון שפלסטיק ייצור אות רקע גדול, אם הם באים במגע עם כלורופורם, התחל את מיצוי השומנים על ידי הוספת שישה מיליליטר של תערובת מתנול כלורופורם ביחס של אחד לשניים ו-0.8 מיליליטר של חרוזי זכוכית הנמדדים בצינור איינור לתרחיף התא. הנפחים המדויקים אינם קריטיים כל עוד נשמר היחס בין אחד לשניים ל-0.8 עבור כלורופורם, מתנול ושמרים תלויים במים. מערבולת.
תרחיף התאים וחרוזי הזכוכית מתערבבים פעמיים במשך דקה אחת בכל פעם, ממשיכים בהוספת שני מיליליטר כלורופורם ומערבבים בעדינות ואז מדגרים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב מדי פעם. לאחר חמש דקות הדגירה מוסיפים שני מיליליטר מים מזוקקים ומערבבים בעדינות. ואז שוב, דגרו במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב מדי פעם.
גם כאן, חשוב יותר לשמור על יחס של 2 לשניים ל-1.8 עבור כלורופורם, מתנול ומים ולא נפח ספציפי. כאשר הדגירה השנייה הושלמה. צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-3000 גרם בטמפרטורת החדר, אוספים את כל הסופרנטנט מהמיצוי הראשון הזה לתוך צינור צנטריפוגה חדש מזכוכית במהירות גבוהה ומוסיפים 3.2 מיליליטר כלורופורם לכדורי התא הנותרים למיצוי שומנים שני.
מערבל את כדורי התא בתוספת הכלורופורם פעמיים למשך דקה אחת בכל פעם. לאחר מכן צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-3000 גרם בטמפרטורת החדר, הוסף את הסופרנטנט מהמיצוי השני הזה לסופרנטנט שנאסף לאחר המיצוי הראשון. לאחר מכן צנטריפוגה את הסופרנטנטים שנאספו למשך חמש דקות.
ב-3000 גרם בטמפרטורת החדר, השומנים המופקים מומסים כעת בשלב האורגני התחתון. השלך את השלב המימי העליון והעביר את השלב התחתון לצינור צנטריפוגה זכוכית חדש במהירות גבוהה. כדי לייצר ספקטרום נקי יותר על צנטריפוגת ספקטרומטר המסה, השלב האורגני למשך חמש דקות ב-3000 Gs בטמפרטורת החדר ולהעביר את כל הסופרנטנט לבקבוקון זכוכית.
יבש את השומנים המומסים תחת חנקן, ממיס את סרט השומן המיובש ב -500 מיקרוליטר כלורופורם ושומר במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לנתח את הדגימות על ידי ספקטרומטריית מסה. התחל בהכנת תערובת סטנדרטית של השומנים בכלורופורם כמפורט בטבלה הראשונה שנמצאת בפרוטוקול הכתוב המצורף. כל ליפיד מייצג מחלקה אחרת.
ניתן לאחסן תמיסה זו במינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר לפני הזרקת השומנים המופקים לספקטרומטר המסה. משולב 10 מיקרוליטר מהדגימה עם 10 מיקרוליטר מתערובת השומנים הסטנדרטית. שים לב שניתן לשנות את היחס הסטנדרטי לדגימה לפי הצורך.
פתור את תערובת הדגימה והליפידים הסטנדרטיים באמצעות ספקטרומטר מסה מיקרו Q עד F שתי מסה, המצויד במקור ננו אלקטרוספריי הפועל בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לדקה. ההגדרות מפורטות בטבלה השנייה של הפרוטוקול הכתוב הנלווה. למרות שהשימוש ברזולוציה הגבוהה של ספקטרומטר מסה Q עד F הוא יתרון, הוא אינו דרישת חובה.
פרמטרי המכשיר המדויקים ישתנו בין ספקטרומטרי מסה. לאחר רכישת הנתונים, ספקטרום המסה מוחלק, הרקע מופחת והפסגות מרוכזות. לבסוף, ייצא את רשימת השיא לאקסל.
ואז לנרמל את הפסגות של כל שומנים לתקן הפנימי שלהן. בהתאם ליישום, ייתכן שיהיה צורך לבצע עיבוד נוסף לאחר מכן כגון דה איזוטופ ודה-קונבולוציה. שיטה זו מאפשרת קביעה מהירה ומעמיקה של המרכיבים העיקריים של שומני השמרים.
כאן הדגשנו שומן אחד, שעבר דה איזוטופ דה מפותל ונורמל לתקן הפנימי שלו. זה עתה הראינו לך כיצד לבודד שומני שמרים וכיצד לקבוע את שומני השמרים באמצעות ספקטרוסקופיה מסה של יינון אלקטרו. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להימנע משימוש בפלסטיק ולשמור את הדגימה שלך בטווח הריכוזים הליניארי.
שיטה זו גמישה למדי וברבים מהנפחים ניתן לשנות אותה לפי הצורך. פרוטוקול מיצוי זה מתאים גם לשיטות אחרות של ניתוח שומנים, כגון כרומטוגרפיה של שכבה דקה וספקטרוסקופיה מסה רב מימדית. אז זהו.
תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה כמותית חדשה של ליפידומיקה לזיהוי מיני שומנים שונים בשמרים באמצעות ספקטרומטריית מסה של יינון אלקטרוספריי בסריקה (ESI/MS). שיטה זו משפרת משמעותית את הטכניקות הקיימות במונחים של זיהוי שומנים, כימות, רגישות ומהירות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ליפידומיקה
- ספקטרומטריית מסה
- ביולוגיה של שמרים
רקע
- ליפידומיקה חיונית להבנת תפקודים תאיים.
- לשיטות מסורתיות לניתוח שומנים יש מגבלות ברגישות וברזולוציה.
- סריקת ESI/MS מציעה חלופה מבטיחה.
- מחקר זה נועד לשפר את זיהוי השומנים והכימות בשמרים.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה מהירה ויעילה לניתוח שומנים.
- לשפר את הרזולוציה של זיהוי מיני שומנים.
- להגדיל את הרגישות של כימות השומנים.
שיטות ששימשו
- קטיף ושטיפת תאי שמרים.
- פירוק של תאים באמצעות חרוזי זכוכית בתערובת כלורופורם-מתנול.
- הפרדת פאזות השומנים באמצעות כלורופורם ומים.
- הכנת דגימות שומנים לניתוח ספקטרומטרי מסה.
תוצאות עיקריות
- השיטה החדשה מאפשרת זיהוי של מיני שומנים רבים.
- היא מפגינה רגישות עדיפה בהשוואה לטכניקות קיימות.
- מהירות הניתוח משופרת משמעותית.
מסקנות
- שיטה זו מייצגת התקדמות משמעותית בליפידומיקה.
- ניתן ליישם אותה באזורי מחקר שונים הכוללים ניתוח שומנים.
- מחקרים עתידיים עשויים להרחיב את יישומיה לאורגניזמים אחרים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative lipidomics using electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS) enables rapid, high-sensitivity profiling of yeast lipidomes, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. This workflow accelerates lipid identification and quantification, providing robust data for pathway interrogation and functional studies. The approach is directly relevant for biopharma teams seeking scalable, reproducible lipidomic analyses to inform discovery-stage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive profiling of lipid species to clarify metabolic pathways.
- Supports functional validation of lipid-related targets in genetically tractable yeast models.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying lipid changes under different conditions.
- Provides quantitative data to inform go/no-go decisions in target selection.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, reproducible lipid quantification suitable for assay standardization.
- Reduces sample preparation time by eliminating chromatographic separation steps.
- Supports high-throughput screening readiness with rapid sample analysis.
- Enables reliable comparison of compound effects on lipid profiles.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant lipidomic studies by enabling organelle-specific lipid analysis.
- Provides continuity from yeast model findings to higher eukaryotic systems.
- Supports risk-adjusted advancement by quantifying lipid biomarkers.
- Enhances predictive confidence in translational lipid biology research.
Pipeline & Workflow Integration
This ESI/MS lipidomics method fits from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis-driven and screening workflows.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification via quantitative lipid profiling.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible lipid measurements for compound evaluation.
- Analytics: Generates normalized, quantitative outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and preclinical continuity when extending findings beyond yeast.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, scalable platform adaptable to various lipidomic research needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lipid biology.
- Operational Value: Streamlines workflows with rapid, standardized sample processing and analysis.
- Strategic Value: Improves decision-making efficiency and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of lipid-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass spectrometry and lipid extraction protocols.
- Needs access to high-resolution mass spectrometry instrumentation and analytical software.
- Demands strict standardization of sample handling to ensure reproducibility.
- Adaptable to other model systems with protocol optimization.
- Plasticware must be avoided to prevent background signal interference.
