Name: הערכה כמותית של Lipidome שמרים באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-21T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: למד שיטה כמותית לניתוח ליפידום שמרים באמצעות ספקטרומטריית מסה ESI. השיטה מאפשרת זיהוי וכימות מהירים של מיני ליפידים שונים בתאי שמר, עם רגישות ומהירות משופרות לעומת שיטות קיימות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים אלן טסייה עבור לייעץ, דיונים חשובים, ותמיכה טכנית. אנו מכירים את מרכז עבור יישומים ביולוגיים של ספקטרומטריית מסה ב אוניברסיטת קונקורדיה עבור שירותי מצטיינים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי CIHR לבין NSERC של קנדה. ויט הוא חוקר חדש CIHR ו קונקורדיה יו&quot;ר אוניברסיטת מחקר Genomics, ביולוגיה של התא והזדקנות.

חומרים ושיטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמרים זנים ותנאי גידול זן wild-type BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) היה גדל בינוני YEPD עשיר (1% תמצית שמרים, peptone 2%, גלוקוז 2%). היו תאים בתרבית בשעה 30 ° C עם הסיבוב רועד בסל&quot;ד 200 ב צלוחיות Erlenmeyer על יחס &quot;נפח / בינוני נפח בקבוק&quot; של 05:01. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסון של תאים שמרים להפקת השומנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות 50 מ&quot;ל של תאים נאסף על ידי צנטריפוגה XG ב 3000 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרחוץ פעמיים עם מים קרים. <ol style=" list-style-type:lower-alpha;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה במים קרים 25 מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים בצנטריפוגה XG ב 3000 למשך 5 דקות </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את הכדור ולהעביר Eppendorf צינור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה ידי צנטריפוגה, 16,000 XG במשך 2 דקות, להסיר supernatant ולהקפיא ב -80 ° C עד השימוש. (אנו משתמשים כוס של אלכוהול איזופרופילי ונשמרים במקפיא -80, חנקן נוזלי יכול לשמש גם) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים כלורופורם כיתה מתנול ביוטק והיו מן סיגמא אולדריץ. חומצות שומן חופשיות triacylglycerols נרכשו מ Larodan (מאלמו, שוודיה). מינים שונים של פוספוליפידים - כולל phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol, phosphatidylserine, חומצה phosphatidic ו cardiolipins - התקבלו ליפידים אוואנטי פולאר (אלבסטר, אל על, ארה&quot;ב). במהירות גבוהה צנטריפוגות מבחנות זכוכית מצופה טפלון עם כובעים היו פישר. </li></ol> ליפידים מיצוי זהו שינוי של הפרוטוקול שתואר על ידי דייר בליי ו 8. מניפולציות עם כל השומנים חילוץ צריך להיעשות באמצעות טפטפות זכוכית או מזרקים, פלסטיק תיצור אות רקע גדול אם הם באים במגע עם כלורופורם. הכרכים המדויק לא קריטי כל עוד יחס של 1:2:0.8 עבור כלורופורם - MeOH - H 2 O בשלב 3 ו 2:2:1.8 עבור כלורופורם - MeOH - H 2 O בכל שלב 7 שמורים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים קפואים 1.6 מ&quot;ל של קר כקרח מזוקקים H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1.6 מ&quot;ל של ההשעיה התא במהירות גבוהה צינורות זכוכית צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 מ&quot;ל של תערובת (01:02) כלורופורם MeOH ו 0.8 מ&quot;ל של חרוזי זכוכית על השעיית התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס ההשעיה תא עם חרוזי זכוכית פעמיים דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של כלורופורם ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של H 2 O מזוקקים ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 3000 XG בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב איסוף נוזל כולו לתוך צינור צנטריפוגות חדשות במהירות גבוהה זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3.2 מ&quot;ל של כלורופורם את כדורי תא משלב 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וורטקס פעמיים דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 3000 XG בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את supernatant לשלב את הנוזל משלב 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 3000 XG בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את השלב העליון (מימית) ולהעביר את התחתון (אורגני) שלב לתוך צינור צנטריפוגות חדשות במהירות גבוהה זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 3000 XG בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant כולו לתוך בקבוקון זכוכית יבש תחת חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את הסרט השומנים ב 500 μl של כלורופורם ולאחסן ב -20 ° C. </li></ol> ניתוח של שומנים על ידי ספקטרומטריית מסה תמהיל המניות של סטנדרטים השומנים בכלורופורם צריכים להיות מוכנים מראש לפי לוח 1, כמו גם פתרון המניות של MeOH - כלורופורם (1:1) עם 0.1% (V / V) אמוניום הידרוקסיד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הזריקה, לשלב 10 μl של המדגם עם 10 μl של לערבב את רמת שומנים הניתנים בטבלה 1. ב 200μL של 01:01 כלורופורם: מתנול עם% 0.1 NH 4 OH. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן יחס מדגם ניתן לשנות לפי הצורך. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתור שומנים באמצעות Q-TOF Micromass 2 ספקטרומטר מסה מצויד ההפעלה ננו electrospray מקור בקצב הזרימה של μl 1 / min. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרמטרים מכשיר מדויק ישתנה ממכשיר למכשיר. ראה טבלה 2 עבור הגדרות עבור Micromass Q-TOF 2 (ווטרס, מילפורד, מסצ&#39;וסטס, ארה&quot;ב) מצויד מקור ננו electrospray. למרות שאנו ניצלו ברזולוציה גבוהה מסוג Q-TOF של ספקטרומטר מסה, זה לא דרישה הכרחית. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרכישה הספקטרום המונית הם מוחלק, רקע ניכוי ו מרוכז, ולאחר מכן את רשימת שיא מיוצא ל-Excel. שיאים של כל שיעור השומנים הם מנורמל אז לרמת הפנימי שלהם. בהתאם ליישום, ייתכן שיהיה צורך לעשות מבצעים נוספים שלאחר עיבוד כגון deisotoping ו deconvolution. </li></ol> טבלה 1. סטנדרטים השומנים פנימית, ריכוז שלהםתמהיל סטנדרטי, ואת במצב MS לניתוח שלהם. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ליפידים בכיתה </td><td> שרשרת רגילה הרכב </td><td> המוניים של תקן </td><td> ריכוז (מיקרוגרם / מ&quot;ל) </td><td> MS מצב </td></tr><tr><td> Phosphatidic חומצה </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 591.40 </td><td> 100 </td><td> שלילי </td></tr><tr><td> Phosphatidylethanolamine </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 634.45 </td><td> 200 </td><td> שלילי </td></tr><tr><td> Phosphatidylinositol </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> שלילי </td></tr><tr><td> Phosphatidylserine </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 622.37 </td><td> 40 </td><td> שלילי </td></tr><tr><td> Cardiolipin </td><td> 4x14: 0 </td><td> 619.92 </td><td> 100 </td><td> שלילי </td></tr><tr><td> חומצות שומן חינם </td><td> 19:00 </td><td> 297.28 </td><td> 100 </td><td> שלילי </td></tr><tr><td> Phosphatidylcholine </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 650.48 </td><td> 100 </td><td> חיובי </td></tr><tr><td> Triacylglycerols </td><td> 13:0 / 13:0 / 13:0 </td><td> 698.63 </td><td> 200 </td><td> חיובי </td></tr></tbody></table> טבלה 2. הגדרות מכשיר Micromass Q-TOF 2 (ווטרס, מילפורד, מסצ&#39;וסטס, ארה&quot;ב) מצויד מקור ננו electrospray. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> תזרים קצב </td><td> קון מתח </td><td> נימי מתח </td><td> התנגשות גז </td></tr><tr><td> מצב חיובי </td><td> 1μl/min </td><td> V -28 </td><td> 3.0 kv </td><td> 10 </td></tr><tr><td> מצב שלילי </td><td> 1μl/min </td><td> 30 v </td><td> -3.2 Kv </td><td> 10 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+lipokine%2C+a+lipid+hormone+linking+adipose+tissue+to+systemic+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism.</a> Cell. 134, 933-944 (2008).</li>
<li>Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+defines+the+interactome+of+the+major+ADP%2FATP+carrier+protein+of+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane.</a> J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).</li>
<li>Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+signal+from+inside+the+peroxisome+initiates+its+division+by+promoting+the+remodeling+of+the+peroxisomal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).</li>
<li>Russell, S. J., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+regulation+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocrine regulation of ageing.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).</li>
<li>Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+storage+and+degradation+of+neutral+lipids+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).</li>
<li>Br&uuml, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &amp, F. T., Lehmann, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+biological+membrane+lipids+at+the+low+picomole+level+by+nano-electrospray+ionization+tandem+mass+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).</li>
<li>Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry+%28ESI-MS%2FMS%29+analysis+of+the+lipid+molecular+species+composition+of+yeast+subcellular+membranes+reveals+acyl+chain-based+sorting%2Fremodeling+of+distinct+molecular+species+en+route+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
</ol>

שיטה זו מאפשרת הערכה כמותית מהירה של lipidome את השמרים באמצעות זמינים, חומרים זולים. השיטה מאפשרת זיהוי של מרבית המינים השומנים המצוי בתאי שמרים למעט diacylglycerols, ergosterols ו אסטרים ergosteryl, למרות שומנים אלה ניתן לזהות על ידי החלפת הידרוקסיד עם אמוניום הידרוקסיד ליתיום. השיטה המתוארת מאפשרת זיהוי שומנים וכימות על ריכוזים נמוך כמו מיקרוגרם / מ&quot;ל, עם ליניאריות הריכוז המתפשט על 2-3 סדרי גודל (בהתאם למין שומנים בדם). אף על פי הסטנדרטים המתאימים phosphatidylinositol אינם...

הערכה כמותית של lipidome שמרים באמצעות ionization electrospray ספקטרומטריית מסה

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

ליפידים הם אחד השיעורים הגדולים של ביומולקולות ולשחק בתפקידים חשובים הדינמיקה קרום, אחסון אנרגיה, איתות<sup&gt; 1-4</sup&gt;. שמרים ניצני<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Eukaryote גנטית ביוכימית unicellular manipulable עם הגנום המבואר ו lipidome פשוט מאוד, הוא מודל יקר ערך לחקר תפקודים ביולוגיים של מינים השומנים השונים תאיים אאוקריוטים<sup&gt; 2,3,5</sup&gt;.<em&gt; ס cerevisiae</em&gt; יש 10 סוגים עיקריים של שומנים עם אורכי שרשרת בעיקר של 16 או 18 אטומי פחמן או אפס או אחד מידת unsaturation<sup&gt; 6,7</sup&gt;. השיטות הקיימות לזיהוי שומנים וכימות - כגון כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים, רזה שכבת כרומטוגרפיה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי, וכן גז כרומטוגרפיה ואחריו MS - מבוססים היטב, אבל יש רגישות נמוכה, נפרד מספיק צורות מולקולריות שונים של שומנים, שומנים derivitization דורשים מראש לניתוח, או יכול להיות די זמן רב. כאן אנו מציגים תיאור מפורט של גישה ניסויית שלנו כדי לפתור את המגבלות הטמונות באמצעות סקר סריקה ESI / MS לזיהוי וכימות להשלים את כולו של שומנים בתאי שמרים. השיטה המתוארת אינה דורשת הפרדה chromatographic של תערובות השומנים מורכבים התאושש מתאי השמרים, ובכך מאיץ מאוד את תהליך רכישת הנתונים. שיטה זו מאפשרת זיהוי שומנים וכימות על ריכוזים נמוך כמו גרם / מ&quot;ל ​​ו - יושם בהצלחה להערכת lipidomes בתאי שמרים שלם האברונים מטוהרים שלהם. ליפידים מיצוי מתאי שמרים שלם באמצעות שיטה זו של ניתוח השומנים לוקח שעתיים עד שלוש שעות. זה לוקח רק חמש עד עשר דקות לרוץ כל מדגם של שומנים חילוץ מיובשים על ספקטרומטר Q-TOF המוני מצויד מקור ננו electrospray.

אנו מתארים שיטה חדשה lipidomics כמותי לזיהוי שומנים מינים רבים שמרים באמצעות סקר סריקה יינון electrospray ספקטרומטריית מסה (ESI / MS). שיטה זו עולה כיום השיטות הזמינות לזיהוי שומנים וכימות ביכולת לפתור צורות מולקולריות שונים של שומנים, רגישות, ומהירות.

הערכה כמותית של Lipidome שמרים באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה

ליפידים הם אחת ממחלקות הביומולקולות העיקריות וממלאים תפקידים חשובים בדינמיקה של ממברנות, באגירת אנרגיה ובתהליכי איתות1-4. השמר המתניב...

פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מהיר של הרכיבים העיקריים של תערובת הליפידים של שמרים. התהליך מתחיל באיסוף ושטיפה של תאי שמרים. התאים השטופים מוכנסים לתערובת של כלורופורם ומתנול ביחס של אחת לשתיים, ומולייזים באמצעות גלגלי זכוכית.הוספה של כלורופורם ומים מפרידה בין שני השלבים. השלב האורגני נאסף ומיובש, ולאחר מכן שכבת הליפידים מומסת בכלורופורם לצורך אחסון לפני ספקטרוסקופיית מסות. הליפידים שהופקו מדוללים בכלורופורם ומתנול עם אמוןיום הידרוקסיד, ותערובת של סטנדרטים פנימיים מתווספת למסה.עתה ניתן להזריק את תמיסת הליפידים ישירות למספקטרומטר המסה. שלום, אני סיימון בורק מהמעבדה של ולדימיר טקו במחלקה לביולוגיה של אוניברסיטת קונקורדיה. היום אראה לכם שיטה לכימות ליפידים של שמרים באמצעות ספקטרוסקופיה של מסה.אנו משתמשים בהליך זה במעבדתנו כדי לחקור שינויים בליפידים של שמרים תחת תנאי גידול שונים. בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, יש להשעות מחדש את כדורי השמרים הקפואים שהוכנו מראש ב-1.6 milliliters של מים מזוקקים קרים (בטמפרטורת קרח), ולהעביר 1.6 milliliters של תרחיף התאים למבחנות צנטריפוגה מזכוכית המיועדות למהירות גבוהה.שימו לב כי לאורך פרוצדורה זו, כל המניפולציות עם הליפידים שהופקו מבוצעות באמצעות פיפטות זכוכית או מזרקים. מכיוון שפלסטיקה תיצור אות רקע חזק, במידה ותבוא במגע עם כלורפורם, התחילו את הפקת הליפידי

a-quantitative-assessment-yeast-lipidome-using-electrospray

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים טכניקה חדשה proteomics כמותיים לזיהוי מתחמי חלבון cerevisiae Saccharomyces. במחקר הנוכחי, השתמשנו בשיטה SILAC יחד עם טיהור זיקה ואחריו טנדם ספקטרומטריית מסה להזדהות עם סגוליות גבוהה השותפים המחייב של חלבון ER, Scs2p.

זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס

תיאור של הליך זירחון כמותי באמצעות cryolysis, solubilziation אוריאה, חלוקה HILIC והעשרה iMac של פפטידים פוספורילציה.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

טיפות ליפידים הם אברונים חשובים עבור שכפול של מספר פתוגנים, כולל וירוס הפטיטיס C (HCV). אנו מתארים שיטה לבודד טיפות השומנים עבור ספקטרומטריית מסה כמותית של חלבונים הקשורים; ניתן להשתמש בו תחת מגוון של תנאים, כגון זיהום וירוס, לחץ סביבתי, או טיפול תרופתי.

בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

כאן, אנו מציגים יישום MATLAB של זיהוי אוטומטי ותיאור כמותי של טיפות שומנים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית של ביקוע ותאי שמרים.

ניתוח של השומנים שומנים תוכן ביקוע והנצה ליעדים באמצעות עיבוד תמונה אוטומטית

אנו מציגים פרוטוקול באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטר מסה דו-מושביים כדי לזהות ולכמת ליפידים סלולריים עיקריים ב סכביסים cerevisiae ס. השיטה המתוארת להערכה כמותית של שיעורי השומנים העיקריים בתוך תא שמרים הוא רב-תכליתי, חסון ורגיש.

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי וכמות של סוגים עיקריים של מטבוליטים מסיסים במים ב cerevisiae Saccharomyces שמרים. השיטה המתוארת היא רב-תכליתית, חזקה ורגישה. היא מאפשרת הפרדה בין איסומרים מבניים וצורות סטריאואיזומריות של מטבוליטים מסיסים במים זה מזה.

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

כאן, פרוטוקול מוצג עבור תיוג מטבולי של שמרים עם 14C-חומצה אצטית, אשר יחד עם כרומטוגרפיה שכבה דקה להפרדה של שומנים ניטרליים.

ניתוח של סינתזת שומנים נייטרלית ב cerevisiae Saccharomyces על ידי תיוג מטבולי כרומטוגרפיה שכבה דקה

וידאו זה מדגים את הכנת שכבת מטריצה ​​/ אנליטי דקים לניתוח פפטידים וחלבונים על ידי מטריקס בסיוע לייזר desorption Ionization המוניים ספקטרומטריית (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

תקנים איזוטופ יציב ו ללכוד על ידי Anti-פפטיד נוגדנים (SISCAPA) זוגות להעשרת הזיקה של פפטידים עם איזוטופ יציב דילול ספקטרומטריית מסה (MRM-MS) כדי לספק מדידה כמותית של פפטידים כתחליפי עבור חלבונים, בהתאמה. כאן אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות חלקיקים מגנטיים בפורמט אוטומטיות חלקית.

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה נוצל בהצלחה כדי לפקח על חילופי אמיד מימן / דאוטריום בהפעלת חלבון kinase Pak2.

אמיד מימן / דאוטריום Exchange &amp; MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית ניתוח של הפעלת Pak2

למד שיטה כמותית לניתוח ליפידום שמרים באמצעות ספקטרומטריית מסה ESI. השיטה מאפשרת זיהוי וכימות מהירים של מיני ליפידים שונים בתאי שמר, עם רגישות ומהירות משופרות לעומת שיטות קיימות.

הערכה כמותית של Lipidome שמרים באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה

גלה סרטונים נוספים