Name: הכנה והתרבות של עדשה Explants עכברוש אפיתל ללימוד בידול Terminal (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 2 s
Description: למדו שיטה להכנת אקספלנטים אפיתליים מעדשת עכברושים וגידולם בתרבית עם FGF-2 לחקר הבידול הסופי. השיטה מאפשרת ניתוח ביטוי גנים ואיתור אירועי סיגנל תאי בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הכנה של explants העדשה אפיתל הותאם משיטות שמקורם במעבדה של ד&quot;ר ג&#39;ון McAvoy 9. עבודה זו ממומנת על ידי המוסד Eye Institute, תוכנית המחקר עירונית Z01-EY000238-22

חלק 1: הסרת עדשות חומרים ריאגנטים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micro-לנתח מספריים, מעוקל, טיפים בוטה, (כגון as.RS-5983, Roboz Instrument ושות כירורגי, Inc, Gaithersburg, MD); מיקרו לנתח פינצטה, קצה מעוגל (כגון Roboz # RS5137). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני השעיה: בינוני 199 המכיל 0.1% אלבומין בסרום שור, 100 יחידות / מ&quot;ל ​​לפניצילין, סטרפטומיצין 100μg/ml, 2.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​amphotericin ריאגנטים ב זמינים Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה. </li></ol> נוהל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חולדות להרדים תינוק (גילאי 2-4 ימים) בהתאם להנחיות שסופקו על ידי מכוני הבריאות הלאומיים, Bethesda, MD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העפעפיים עם מספריים כירורגיות. לחצו בעדינות עם פינצטה מעוקל בצדדים מנוגדים של ארובת העין להכריח את העין בליטה החוצה. לעשות חתך קטן בצד האחורי של העין עם המספריים. על ידי לחיצה עם פינצטה על הצד של העין מול החתך, העדשה כמות קטנה של הגוף הזגוגי המצורפת אז יכול להיות כפוי דרך קרע, המאפשר את העדשה להיות הרים עם פינצטה מעוקל. יש להקפיד לא לשבור את הקפסולה העדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פינצטה מעוקל להעביר את העדשות אל צלחת רקמות 60mm פלסטיק תרבות המכילה 5 מ&quot;ל מדיום חם, השעיה סטרילית. </li></ol> חלק 2: Microdissection של explants חומרים ריאגנטים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקטת הביתור Micro, טיפים 0.1 מ&quot;מ, (כגון Roboz RS-4976). אנו משתמשים סגסוגת Dumostar בגלל הגמישות של קצה, אך פלדה וסגסוגות אחרות יתקבלו אף הן. פינצטה עם עצות יותר רזה 0.1mm אינם מומלצים, כפי שהם נוטים להישבר או להתכופף במהלך הליך זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיה בינוני (ראו חלק 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Unsupplemented F12 של חם בינוני או בינוני 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA) </li></ol> נוהל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלבים הבאים צריכים להתבצע סביבה נקייה, גיוס חינם באמצעות כלים לנתח סטרילית בינוני סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ סטריאו לנתח, לנקות את העדשות של רקמה כלשהי דבקות עם פינצטה קצה 0.1 מ&quot;מ ולהעבירם תרבות צלחת שנייה 60mm השעיה המכיל 5 מ&quot;ל בינוני סטרילי (שלב זה עוזר להפחית זיהום). בעזרת הפינצטה, להעביר את המספר הרצוי של עדשות לצלחת תרבות 35mm המכיל 5 מ&quot;ל בינוני סטרילי, unsupplemented. (אנו מרבים להשתמש F12 חם של (Invitrogen) של שלב זה, כי ריכוז לצבוע נמוך עושה דיסקציה קל, אולם בינוני 199 מקובלת גם לא אנטיביוטיקה או תוספות אחרות יש צורך במהלך שלב זה..) רבים כמו 12 explants יכול להתבצע במרכז צלחת בגודל כזה. עם זאת, מנה 35 מ&quot;מ אמור לשמש גם אם הם פחות explants להתבצע, כי את הכלים לנתח לא ניתן להשפיע בקלות בצלחת קטנה יותר. מעבירים את תבשיל המכיל את עדשות הנותרים תרבות רקמות החממה ב 37 מעלות צלזיוס עד שהם נחוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הצד האחורי של העדשה. ישנן דרכים רבות להכיר זה: 1) האחורי הוא יותר עגול הקדמי, שהוא שטוח מעט; 2) עדשות עכברוש יילוד טופס קטרקט קר כפי שהם להתקרר לטמפרטורת החדר במהלך הניתוח. אם קטרקט קר לא מילא לגמרי את העדשה, הצד האחורי הוא הצד המרוחק מאזור אטום. אם אטימות מילא את העדשה, מחמם את המנה עד 37 מעלות צלזיוס במשך כמה דקות זה יהיה הפוך. הצד האחורי ניתן לזהות את הרפורמות קטרקט בקירור. 3) שרידים של Tunica vasculosa lentis יכול להיות גלוי בצד האחורי. 4) תפר אחורי יכול להיות גלוי בצד האחורי. זיהוי הצד האחורי נכונה היא חיונית, שכן זה המקום שבו הקפסולה ייפתח. פתיחת העדשה בצד הקדמי יהיה לקרוע את רקמת האפיתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע הצד האחורי זוהה, להפוך אותו כלפי מעלה ולתפוס את העדשה ב פינצטה שמאל (לעובד ימניים). אז קמצוץ הקפסולה האחורי עם פינצטה הזכות לייצר קפל קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מחזיק את הקפסולה האחורי עם פינצטה הנכון, לתפוס את קפל של קפסולה עם פינצטה שמאל ולמשוך את שני זוגות פינצטה בכיוונים מנוגדים כדי להפוך דמעה קטנה הקפסולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד לתפוס את הקצה של הקפסולה retracting עם פינצטה, למשוך אותו כלפי מטה, תחילה בצד אחד, אז בצד השני, הטביע אותו בתוך הפלסטיק של המנה בפינצטה. חזור על פעולה זו מספר פעמים, נע סביב קו המשווה של העדשה, עד הקפסולה מחובר היטב בצלחת בנקודות רבות. החזקת קפסולה במקום עם פינצטה שמאל, בעדינות רוק המוני סיבים עם פינצטה הזכות לשבור את הקשר בין התאים סיבים ותאי אפיתל בקו המשווה את העדשה. ואז לדחוף את המוני סיבים משם, מגלגל אותו הקפסולה / אפיתל, אשר נשאר מחובר לתחתיתצלחת. המשך בתהליך זה עם כל עדשות בצלחת. הסר וזורקים את ההמונים סיבים (או לשמור אותם קפואים מקור חלבונים העדשה למחקרים אחרים). </li></ol> חלק 3: Microdissection והתרבות של explants המרכזי חומרים ריאגנטים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באיזמל חד פעמי סטרילי, # 15 להב, (סינסינטי כירורגי ושות סינסינטי, אוהיו) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט סטרילי שנאגרו מלוחים עם סידן ומגנזיום (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני תרבות: בינוני השעיה המכיל 100ng/ml FGF-2 (סיגמא אולדריץ, Inc סנט לואיס, מיזורי). </li></ol> נוהל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל סטרילי, לחתוך אפיתל היקפי (PE), אשר מכיל תאים בשלבים המוקדמים של בידול (איור 1A), משאיר הכיכר המרכזית 2.0mm כ בצד, המורכב מתאי אפיתל מרכזי בלבד (CE) (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את תבשיל המכיל את explants מרכזי ארון biosafety. לשטוף 3 פעמים עם PBS סטרילי המכיל סידן ומגנזיום ופעם עם 1ml של טרי בינוני, (37 ° C CO, 5% 2) equilibrated ההשעיה. אלו רוחץ לצמצם במידה ניכרת את הסיכוי לזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2ml של המדיום תרבות להשרות התמיינות 1, והמקום explants ב humidified, בתרבית רקמה החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. תקופות תרבות עשוי להיות קצר ככל כמה שעות או להאריך עוד שבועיים עד שלושה שבועות, בהתאם לפרמטר הנלמד. בינוני יש לשנות כל יומיים שלושה. </li></ol> חלק 4: קצירת של explants לניתוח אירועים בידול 1. Explants מסיק לניתוח של חלבון או רנ&quot;א חומרים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microdissecting פינצטה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SDS תמוגה חוצץ או RNA-בהמשך </li></ol> נוהל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתום תקופת הדגירה, להסיר את המדיום לתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ סטריאו לנתח, לשחרר בעדינות את הקצוות של כל explant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם כל explant בפינצטה ולהעביר אותו צינור המכיל כ חיץ SDS תמוגה 100μl (לניתוח חלבונים) או RNA, לאחר מכן (לניתוח RNA). להתסיס את קצה של פינצטה בפתרון על מנת להבטיח כי explant אינו מקל על פינצטה. </li></ol> 2. Explants מסיק עבור immunofluorescence חומרים ריאגנטים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט שנאגרו מלוחים עם סידן ומגנזיום (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט שנאגרו מלוחים (ללא סידן ומגנזיום) (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Paraformaldehyde 4% (Bioproducts בוסטון, Worcester, MA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microdissecting פינצטה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עט סימון הידרופובי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ זכוכית שקופיות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.25% Triton X-100 ב פוספט שנאגרו מלוחים. </li></ol> נוהל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף explants בקצרה PBS המכיל סידן ומגנזיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון רקמות על ידי הוספת paraformaldehyde 4% במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מקבע ולהחליף פוספט שנאגרו מלוחים. Explants קבוע להיות נוקשה למדי, ומאפשר להם להיות הרים והועברו שקופיות זכוכית immunostaining. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום טיפה קטנה של PBS (ללא סידן ומגנזיום) בשקופית כדי לסייע למקם את הרקמה ולמנוע מסתלסל. בעזרת פינצטה microdissecting, להרים את explant ו להכניס אותו לתוך הירידה בשקופית. מבלי לגעת explant, להסיר בזהירות את הנוזל עם הפתיל נייר כדי לשטח את explant על הזכוכית ולתת הרקמה יבש באוויר בטמפרטורת החדר למשך 3 עד 5 דקות. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1 א אפיתל היקפי מבטא ספציפי בידול חלבונים. Explant הראו היה immunostained עבור N-cadherin מיד לאחר microdissection. הביטוי הוא ראה בלהקה של תאים אפיתל הפריפריה, המציין כי תאים באזור זה החלו להבחין. B. אפיתל היקפי יכול להיות trimmed ממנו להסיר תאים המבטאים N-cadherin אחרים ספציפיים בידול חלבונים. Annulus אדום מייצג את המיקום של תאים המבטאים N-cadherin, בעוד ריבוע קטן המתוארים אפור מייצג את רביע של האפיתל המוצג בלוח 1 א. האפיתל היקפי ניתן להסיר על ידי ארבעה חתכים אזמל, משאיר הכיכר המרכזית המכילה תאים בלבד טרם החלו להבחין.

<ol><li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+%28FGF%29+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li>
<li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+%28FGF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li>
<li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+major+intrinsic+protein+%28MIP%29%2Faquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li>
<li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+%28ERK1%2F2%29+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li>
<li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li>
<li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6%2C+c-Maf%2C+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li>
<li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li>
</ol>

העדשה עכברוש מערכת explant שימש בהצלחה על ידי מספר מעבדות מחקר בידול הטרמינל של תאים אפיתל העדשה לסיבי העדשה 21,3,4,5. כאשר נחשף FGF-2 ב 100ng/ml explants יתחיל להראות שינויים איתות בתוך 6 דקות, עם שינויים במורפולוגיה ועל ביטוי גנים המופיעים ברצף במשך כמה ימים 3,4,5. תרבויות נשארים קיימא עבור 2-3 שבועות אם הטיפול נלקח על מנת למנוע זיהום. Explants המרכזי המתואר פרוטוקול זה שימושי במיוחד עבור לומדים את רצף האירועים הקשורים הבחנה, מכיוון שהם מכילים מעט אם בכלל תאים המבטאים סמנים בידול לפני FGF-2 הוא הוסיף 1,5. התאים אז להבדיל סינכרוני, כמו במדגם, כך שניתן לעקוב אחר מהלך הזמן של איתות תעתיק אירועים הקשורים בידול. Explants culturing עבור זמן שונים ובכך מספק מידע מדויק על זמני רצף האירועים. מעכבי ספציפיים ניתן להוסיף בינוני התרבות לזהות איתות המסלולים הרלוונטיים. Explants ניתן להשתמש כדי לנתח את ביטוי החלבון על ידי אלקטרופורזה בג&#39;ל SDS ו immunoblotting או לנתח את הביטוי של mRNAs ספציפי על ידי RT-PCR. התשואות חלבון בטווח 20-50 מיקרוגרם / explant ואת התשואה RNA הוא כ 200-600 ng / explant, בהתאם לאורך התקופה והתרבות. בדרך כלל אנחנו מוצאים 5-6 explants לכל צלחת תספק מספיק חלבון או רנ&quot;א עבור מבחני מספר. RNA מן explants יכול לשמש גם כדי להכין cDNA להערכת ביטוי גנים על ידי ניתוח microarray, אשר יכול לזהות גנים הרומן הזה יכול להיות קריטי עבור בידול. Explants יכול להיות גם transfected. למרות היעילות transfection הוא בדרך כלל נמוך, זה מספיק עבור assaying גנים כתב 4, 7, 8. מיקרוסקופיה immunofluorescence של explants מספק נלווה שימושי בשיטות ביוכימיות על ידי קביעת מיקום subcellular של חלבונים של עניין. לפיכך, הכנת והתרבות של explants העדשה עכברוש מספק מערכת רבת עוצמה ללימוד העדשה בידול מסוף ביונקים, אשר יכול להשלים בטכניקות vivo, כמו הדור של העכברים הטרנסגניים ו עקום החוצה.

הכנה והתרבות של עדשה explants עכברוש אפיתל ללימוד בידול terminal

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

המשטח הקדמי של עדשת העין מכוסה בשכבה של תאים אפיתל, אשר מתרבים באזור טבעתי שבבסיס גוף ריסי. בעקבות החלוקה, תאים אלו נודדים בדיעבד, שם FGF לשדר מן הרשתית גורמת להם להתמיין למגוון האחורי של סיבים מאורכים תאים העדשה, אשר מהווים את חלק הארי של העדשה. התמיינות של תאים אפיתל העדשה לתוך סיבי העדשה יכול להיגרם על ידי במבחנה explants culturing האזור המרכזי של האפיתל הקדמית בנוכחות של FGF-2. Explants מוכנים מן העדשות של חולדות הילוד על ידי הסרת העדשות מהעין ו לתפוס את הקפסולה העדשה בצד האחורי עם פינצטה לנתח. קפסולה אחורית אז הוא נקרע בעדינות לפתוח ולחצתי לתחתית צלחת פלסטיק של תרבית רקמה. אזורי הפריפריה של explant מוסרים עם אזמל והאזור המרכזי בתרבית ואז בנוכחות 100ng/ml FGF-2 עוד 2-3 שבועות, תלוי בפרמטרים כדי להיחקר. מכיוון שתאי האפיתל explants תרבותי להבחין בתיאום המשוער לאורך תקופה של ימים עד שבועות, במהלך תקופה של איתות ביטוי גנים ניתן לקבוע תוך שימוש בטכניקות מולקולריות, ביוכימיות, וגם תרופתי. מיקרוסקופיה immunofluorescence הוא נספח חזק בשיטות אלה כפי שהוא מדגים את subcellular לוקליזציה של חלבונים עניין יכול לחשוף את ההשלכות הפיזיולוגיות של מניפולציות ניסיוני של מסלולי איתות.

Explants האזור המרכזי של עכברוש העדשה epithelia להבדיל סינכרוני כאשר בתרבית בנוכחות של FGF-2. מיקרוסקופיה immunofluorescence של תרבויות כאלה יכולים מספק מידע רומן על ביטוי גנים ואירועים איתות הקשורים בידול סופנית.

הכנה והתרבות של עדשה Explants עכברוש אפיתל ללימוד בידול Terminal

המשטח הקדמי של עדשת העין מכוסה בשכבה אחת של תאי אפיתל, אשר מתחלקים באזור טבעתי הנמצא מתחת לגוף הריסוֹן.

הליך זה מתחיל בהוצאת העדשות מחולדות בנות יומיים עד ארבעה ימים ובניקוי שאריות רקמה דבוקות מהן. הצד האחורי של העדשה מזוהה ומתבצע קרע קטן בקפסולה. לאחר מכן הקפסולה מקולפת כלפי מטה ונלחצת לתחתית הצלחת.תהליך זה חוזר על עצמו מסביב לעדשה כולה. מסת סיבי העדשה מוסרת על ידי נדנוד לצדדים. האפיתל ההיקפי נגזר, ולאחר מכן הם נתרבים.לבסוף, הם מועברים למבחנה לצורך אנליזה ביוכימית או לעל slides זכוכית לצורך מיקרוסקופיה. שלום, אני פגי לנקה מהמעבדה לביולוגיה מולקולרית והתפתחותית במכון הלאומי לעין (National Eye Institute) ב-NIH. שלום, אני אל טו, גם אני מהמעבדה לביולוגיה מולקולרית והתפתחותית במכון הלאומי לעין.אני צ'ונג גה, גם אני מאותה מעבדה ב-NEI. היום נראה לכם הליך של בידוד ותרבית של תאי אפיתל של עדשת העין מחולדות רך. נראה לכם כיצד להסיר את האזור ההיקפי של האפיתל, המכיל תאים בשלבים מוקדמים של דיפרנציאציה.לאחר מכן נראה לכם כיצד להשרות את תאי האפיתל שנותרו במרכז העדשה להבדיל ולהפוך לסיבי עדשה על ידי חשיפה ל-FGF. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את תזמון האירועים המעורבים בהבדילה הסופית. אנו קוטפים את ה-EXPLAN בזמנים שונים לאחר הוספת FGF למצע התרבית.לאחר מכן, אנו מנתחים את ביטוי החלבון באמצעות western blotting, את ביטוי ה-RNA באמצעות R-T-P-C-R או מערכים של micro arrays, ומבצעים צביעה אימונוהיסטוכימית (immunostain) לעדשה כדי לקבוע את המיקום התת-תאי של החלבונים הנחקרים. נתחיל בהוצאת עדשות מעכברים ניו born. ראשית, השתמש במספרי מיקרו-דיסקציה כדי להוציא את העדשות מעיניהם של עכברים בני יומיים עד ארבעה שעברו הרגעמה, על ידי ביצוע חתך אחורי קטן ולחיצה על הצד הנגדי.העבירו את העדשות לכלי תרבית פלסטיק בקוטר 60 מילימטר המכיל 5 מיליליטר של מצע תליה סטרילי וחמים, באמצעות פינצטה עם קצה של 0.1 מילימטר. נקו כל רקמה דבוקה מהעדשות והעבירו אותן לכלי תרבית שני בקוטר 60 מילימטר המכיל 5 מיליליטר של מצע תליה סטרילי. פעולה זו מסייעת בהפחתת זיהומים המועברים באמצעות הפינצטה.העבירו את מספר העדשות הרצוי לצלחת תרבית של 35 מילימטר המכילה שני מיליליטר של מצע מועשר סטרילי ללא UNSU. ניתן להכין עד 12 x explan במרכז צלחת בגודל זה. ניתן לאחסן עדשות נוספות בצלחת ה-60 מילימטר השנייה מהשלב הקודם ולהניחן באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עד שעה לפני השימוש בהן להכנת X explan.כעת זהו את הצד האחורי של העדשה. אני יכול לומר ששתי אלו מונחות כאשר הצד הקדמי שלהן פונה כלפי מעלה. אני אסוב אותה על צדה כדי שתוכלו להסתכל דרכה, ותראו את ה-cold cataract, שהוא אזור עכור במרכז.הצד הרחוק ביותר מהמרכז האטום הוא הצד האחורי. לכן, אני הופך אותו לצד האחורי. בצד האחורי ניתן לראות גם את הפסים הללו, שהם השאריות של ה-tenal vasculitis הזה.זוהי תבנית של כלי דם מסביב להיקף העדשה, המסמנת גם את הצד האחורי. נכון. הזיהוי הוא קריטי מכיוון שזהו המקום שבו תיפתח הקפסולה. פתיחת העדשה בצד הקדמי תגרום לקריעת האפיתל.ישנן דרכים רבות לזהות את הצד האחורי. ראשית, הוא עגול יותר מהצד הקדמי, ששטוח מעט. שנית, עדשות של חולדות רכים יוצרות קטרקטים קרים בעודן מתקררות לטמפרטורת החדר במהלך הניתוח.אם הקטרקט הקר עדיין לא מילא את העדשה לחלוטין, הצד האחורי הוא הצד הרחוק ביותר מהאזור העכור. אם העכירות מילאה את העדשה, חימום של הצלחת ל-37 °C למשך מספר דקות יבטל אותה. ניתן לזהות את הצד האחורי כאשר הקטרקט נוצר מחדש בעת הקירור.ייתכן שיהיו גלויות שאריות שלישיות של ה-tunica VASIs בצד האחורי. לבסוף, התפר האחורי עשוי להיות גלוי בצד האחורי. לאחר זיהוי הצד האחורי, הפכו אותו כלפי מעלה ותמכו בעדשה באמצעות הפינצטה השמאלית.לאחר מכן, צבטו את הקפסולה האחורית בעזרת הפינצטה הימנית כדי ליצור קיפול קטן; תוך כדי החזקת הקפסולה האחורית בפינצטה הימנית, תפסו את קיפול הקפסולה בפינצטה השמאלית ומשכו את שני זוגות הפינצטות בכיוונים מנוגדים כדי ליצור קרע קטן בקפסולה. תוך כדי תפיסת קצה הקפסולה הנרתעת בפינצטה, משכו אותה תחילה כלפי מטה בצד אחד, ולאחר מכן בצד השני, תוך לחיצה עליה אל הפלסטיק של הצלחת בעזרת הפינצטה. חזרו על פעולה זו מספר פעמים, תוך תנועה מסביב לכל קו המשווה של העדשה, עד שהקפסולה תהיה מודבקת היטב לפלטה. בנקודות רבות, תוך החזקת הקפסולה במקומה עם הפינצטה השמאלית, נענעו בעדינות את מסת הסיבים בעזרת הפינצטה הימנית כדי לנתק את החיבור בין תאי הסיבים לתאי האפיתל בקו המשווה של העדשה.כעת משכו בעדינות את מסת הסיבים הרחק מהקפסולה, תוך גלגולה ממנה, כאשר הקפסולה נותרת מחוברת לתחתית הצלחת. חזרו על תהליך זה עם כל העדשות שבצלחת. ניתן להשליך את מסות הסיבים או להקפיא ולשמור אותן כמקור לחלבוני עדשה למחקרים אחרים, לאחר השלמת המיקרו-דיסקציה של השבתי האפיתל השלמים.נסתכל על מיקרו-דיסקציה וגידול של ה-central explan. בעזרת סכין מנתחים סטרילית, הסיר את האפיתל ההיקפי, המכיל תאים בשלבים מוקדמים של דיפרנציאציה. השאר ריבוע מרכזי, ברוחב של כ-2 mm בכל צד, המורכב מתאי אפיתל מרכזיים.העבירו לקללת בטיחות ביולוגית רק את הצלחת המכילה את ה-x explan המרכזי. שטפו את ה-eggplants שלוש פעמים ב-PBS סטרילי ופעם אחת ב-1 ml של תמיסת השעיה רעננה ומאוזנת. לאחר מכן, הוסיפו 2 ml של מצע תרבית כדי להשרות דיפרנציאציה והניחו את ה-explan באינקובטור לתרביות רקמה עם לחות ב-37 °C ו-5% carbon dioxide.תקופת התרבית עשויה להימשך מספר שעות בלבד או עד שבועיים עד שלושה שבועות, תלוי בפרמטר הנחקר. יש להחליף את המצע מדי יומיים עד שלושה ימים עם מיקרו-דיסקציה ו-Turing complete. נתחיל כעת באיסוף האקספלנטים לצורך ניתוח.בסיום תקופת האינקובציה, הסר את מצע הגידול באמצעות פינצטה למיקרו-דיסקציה. שחרר בעדינות את קצוותיו של כל explan. אחז בכל explan באמצעות הפינצטה והעבר אותו למבחנה המכילה כ-100 µL של SDS lysis buffer לצורך אנליזה של חלבונים, או RNA later לצורך אנליזה של RNA; נער את קצה הפינצטה בתוך התמיסה כדי להבטיח שה-explan אינו נדבק אליה.הדגימות מוכנות כעת לניתוח של חלבון או RNA; ניתן לנתח את הדגימות גם באמצעות אימונופלואורסצנציה. כדי להתחיל, שטפו את הדגימות קצרות ב-PBS. קבעו את הרקמות על ידי הוספה של 4% paraformaldehyde למשך 30 דקות.בטמפרטורת החדר, הסיר את המקבע והחלף אותו ב-PBS. רקמות ה-explan המקובעות הופכות לקשיחות למדי, מה שמאפשר להרים אותן ולהעבירן לשקפיות זכוכית לצביעה אימונוהיסטוכימית. הנח טיפה קטנה של PBS ללא סידן ומגנזיום על השקיתית כדי לסייע במיקום הרקמה ולמנוע התקמטות. באמצעות פינצטה למיקרו-דיסקציה, הרם את ה-explan והכנס אותו לתוך הטיפה שעל השקיתית מבלי לגעת ב-explan; השתמש בזהירות בפתיל נייר כדי להסיר את הנוזל ולהשטיח את ה-explan על הזכוכית.הניחו לרקמה להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר למשך שלוש עד חמש דקות. השתלים מוכנים כעת לניתוח אימונופלואורסצנציה. מוצגת כאן דוגמה של תלישה אפיטליאלית שלמה שעברה מיקרו-דיסקציה ונצבעה אימונוהיסטוכימית עבור NCO adhere, סמן לתאים.בשלבים המוקדמים של הדיפרנציאציה, רק התאים באזור ההיקפי של האפיתל נצבעים באופן חיובי עבור חלבון זה. חיתוך של האפיתל ההיקפי, כפי שמתואר בפרוטוקול זה, מותיר אזור מרכזי (explan), המכיל מעט תאים, אם בכלל, המבטאים את החלבון. הדבר מודגם באמצעות western blotting של רקמות אפיתליאליות מרכזיות והיקפיות עבור GA. ביצוע western blotting עבור GAPDH שימש לאישור שדגימות החלבון הועמסו בכמויות שוות.ניתן לקבוע את עיתוי האירועים הקשורים לדפרנציאציה על ידי גידול של explan מרכזי למשכי זמן שונים. ה-explan המרכזיים גודלו למשך 2, 5, 24 ו-48 שעות במצע עם או ללא 100 nanograms per milliliter של FGF. ה-explan נאספו בזמנים המצוינים והועברו לתמיפת SDS sample buffer לצורך ניתוח באמצעות western blotting.התוצאות מראות כי ביטוי החלבון הקוהרנטי הסופי מושרה לאחר 24 עד 48 שעות בתרבית. Western blotting עבור GA DH מדגימה כי מדגמי החלבון הועמסו באופן שווה.צביעה אימונוהיסטוכימית של Explan מרכזי שגודל במשך ארבעה ימים בהיעדר או בנוכחות של 100 ng/mL FGF מראה כי הפלורסצנציה האימונוכימית של N-cadherin מוגברת משמעותית ב-explan שנחשפו ל-FGF. הפלורסצנציה האימונוכימית מראה גם את הלוקליזציה התת-תאית של N-cadherin בגבולות שבין התאים.הרגע הצגנו בפניכם כיצד להכין בתרבית תאי אפיתל של עדשה לצורך חקר דיפרנציאציה. היתרון העיקרי של מערכת זו הוא שהתאים עוברים דיפרנציאציה באופן סינכרוני. דבר זה מאפשר לקבוע את רצף האירועים.בנוסף, ניתן להוסיף למצע גורמי גדילה או מעכבים ספציפיים כדי להפעיל או לחסום מסלולי איתות מסוימים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להישמר מזיהומים על ידי ביצוע ההפרדה והכנת המצע הסטרילי בסביבה נקייה, ועל ידי בדיקה מדוקדקת של הרקמות המבודלות לפני התרבותן. וזהו זה.תודה שצפיתם. בהצלחה בניסוי שלכם. להתראות.

preparation-culture-rat-lens-epithelial-explants-for-studying

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תאי אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) שמקורם בתאי גזע עשויים לשמש ליישומים מרובים, כולל טיפולים מבוססי תאים לניוון רשתית, מידול מחלות ומחקרי תרופות. כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט להפקת RPE מתאי גזע.

גזירה יעילה של תאי הרשתית פיגמנט האפיתל מתאי גזע

אנגיוגנזה כוללת אינטראקציות רב-תאיות ורב-מערכתיות שיש לחקור בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. מטרת מחקר זה היא להדגים את יכולתו של מודל תרבית המזנטריה של חולדות לבצע השוואות זמן-lapse של רשתות מיקרו-וסקולריות שלמות במהלך אנגיוגנזה.

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; שיטת הדמיה זמן לשגות של רשתות כלי הדם Mesenteric עכברוש מתורבתות

אנו מתארים שיטה להנדס רקמת רשתית מורכב של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע pluripotent אנושית ותרבותית על גבי קרום מי השפיר האנושי והכנה שלו הרכבה במודלים של בעלי חיים.

הנדסת רקמות אפיתל הפיגמנט ברשתית השתלת-מתאים נגזר תאי גזע עובריים

אנו מציגים מודל במבחנה כדי להעריך חוש הריח ensheathing גליה (OEG) יכולת נוירו-רגנרטיבית, לאחר פגיעה עצבית. הוא מבוסס על קוקולטורה של נוירונים גנגליון רשתית למבוגרים אקסוטומיים (RGN) על מונוליירים OEG ומחקר עוקב של התחדשות אקסון, על ידי ניתוח סמנים אקסונליים וסמטודנדריטיים RGN.

Coculture של נוירונים רשתית עכברוש אקסוטומי עם חוש הריח Ensheathing גליה, כמודל במבחנה של התחדשות אקסון למבוגרים

הפרוטוקול מתאר explants organotypic שלרשתית נוירוהעכבר , מעובד יחד עם אפיתל פיגמנט הרשתית שלה (RPE), במדיום R16 מוגדר, ללא סרום ואנטיביוטיקה. שיטה זו פשוטה יחסית לביצוע, זולה יותר וגוזלת זמן בהשוואה לניסויי vivo, וניתן להתאים אותה ליישומים ניסיוניים רבים.

טווח ארוך, טיפוח ללא סרום של אורגנוטיפי עכבר רשתית explants עם אפיתל פיגמנט רשתית שלם

מחקר זה נועד לפתח מודל תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית חדשנית (HORC) המונעת פגיעה בשלמות הרשתית במהלך טיפול בהסבר. זה מושגת על ידי פולחן הרשתית עם הזגוזית יתר על המידה ואת אפיתל הפיגמנט ברשתית הבסיסית-choroid (RPE-choroid) ו sclera.

אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית

פרוטוקול זה, אשר דווח במקור על ידי פרננדז-Godino ואח '. בשנת 20161, מתאר שיטה לבודד ביעילות ותרבות העכבר RPE תאים, אשר יוצרים מונולייר RPE פונקציונלי מקוטב בתוך שבוע על לוחות Transwell. ההליך לוקח בערך 3 שעות.

ניתוח יעיל ותרבות של תאי אפיתל פיגמנט רשתית העכבר הראשי

פרוטוקול זה מציג ומתאר שלבים לבידוד, דיסקציה, התרבות והכתמה של צמחי רשתית המתקבלים מעכבר בוגר. שיטה זו מועילה כמודל ex vivo לחקר מחלות נוירו-וסקולריות שונות ברשתית כגון רטינופתיה סוכרתית.

השתלת הרשתית של הרשתית של עכבר בוגר כמודל ex vivo לחקר מחלות נוירו-וסקולריות ברשתית

כתב יד זה מתאר פרוטוקול וידאו מפורט לגידול תאי אפיתל ראשוניים של עדשה (LECs), במטרה לשפר את יכולת השחזור ולסייע במחקר בקטרקט ובפסיפיקציה של קפסולה אחורית (PCO). הוא מציע הוראות שלב אחר שלב על דיסקציה של עדשות, בידוד LECs ותיקוף, ומשמש כמדריך רב ערך, במיוחד עבור מצטרפים חדשים בתחום.

אופטימיזציה של תרבית תאי אפיתל בעדשה הראשית של עכבר: מדריך מקיף לטריפסיניזציה

פיתחנו מודל חולדה של דלקת קרנית חמורה באמצעות גרידת אפיתל בקרנית בשילוב עם תפרים בקרנית. המחקר העריך דפוסי דלקת בקרנית, התפשטות אפיתל ושינויים בתאי גזע לימבליים בתנאים דלקתיים.

ביסוס מודל דלקת קרנית חמורה בחולדות המבוסס על גרידת אפיתל בקרנית בשילוב תפרי קרנית

פרוטוקול זה מפרט את ההפרדה של אפיתל עדשת העין של העכבר ומסת התפזורת של תאי הסיבים, ואחריו בידוד RNA וניתוח qPCR. שיטה זו מאפשרת הפרדת תאי עדשה לניתוח מפורט יותר של הטרנסקריפטום והתהליכים הביולוגיים בתאי אפיתל לעומת תאי סיבים מובחנים.

בידוד RNA מאפיתל עדשת עין של עכבר ומסות בתפזורת של תאי סיבים

למדו שיטה להכנת אקספלנטים אפיתליים מעדשת עכברושים וגידולם בתרבית עם FGF-2 לחקר הבידול הסופי. השיטה מאפשרת ניתוח ביטוי גנים ואיתור אירועי סיגנל תאי בזמן אמת.

הכנה והתרבות של עדשה Explants עכברוש אפיתל ללימוד בידול Terminal

גלה סרטונים נוספים