Name: נוגדן פרופיל על ידי מערכות immunoprecipitation בלוציפראז (שפתיים) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-07T17:25:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: למד את שיטת LIPS לכימות נוגדנים בתאי COS-1 באמצעות חלבוני Renilla luciferase. שיטה זו מאפשרת אבחון מחלות ומעקב אחר חיסונים ביעילות גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר עירונית של NIDCR.

1. סכמטי סקירה: סרט הווידאו הזה ממחיש את שלבים בביצוע assay השפתיים. אנטיגנים באים לידי ביטוי Cos1 התאים בלוציפראז Renilla רקומביננטי (משטרת אלסטר)-אנטיגן fusions, ותמציות גולמי מתקבלים בשימוש ללא טיהור. Assay השפתיים הוא שיזם דוגרים crud דואר משטרת אלסטר-אנטיגן עם תמציות סרה החולה microtiter בארות. התערובת נוגדן אנטיגן הוא הועבר לאחר מכן צלחת 96-לסנן היטב המכיל חלבון / חרוזים G ללכוד מולקולות IgG. לאחר שטיפת צלחת מסנן המכיל את חלבון נוגדן A / G חרוזים, מחויב משטרת אלסטר-אנטיגן נמדדת על ידי תוספת של מצע coelenterazine יחידות אור נמדדים עם luminometer. חלק 1: transfection של פלסמידים לייצור Renilla-Antigen חלבונים Fusion הקמה: Cos1 תאים בתרבית FCS DMEM-10% באמצעות תקן תרבות פרוטוקולים רקמות. פלסמידים עבור fusions בלוציפראז Renilla תוארו בעבר 1. ה-DNA של פלסמידים אלה מוכן באמצעות ערכת Midiprep מ Qiagen. התשואה צריכה להיות בערך 1 מ&quot;ג -3. למדוד את ריכוז הדנ&quot;א לאחסן 1000 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​מניות פתרון ב -20 ° C. נוהל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני, לפצל transfection קוס-1 אל התאים חדש 100 x 20 מ&quot;מ מנות בכ 2 X 10 6 לכל צלחת לדגור על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, קוס-1 תאים צריך להיות 80-95% ומחוברות. 1.5 תווית פוליפרופילן מ&quot;ל microfuge צינורות עבור כל פלסמיד דנ&quot;א להיות transfected. אפשר מגיב FuGENE-6 transfection, אשר מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס, כדי לחמם את טמפ &#39;החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 94 μl של Opti-ממ התקשורת צינור כל microfuge. לאחר מכן להוסיף 6 μl של FuGENE 6 עד בתקשורת Opti-ממ בלי לגעת בקיר צדדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 1-2 מיקרוגרם (ממלאי 1mg/ml DNA) של פלסמיד היתוך Renilla אנטיגן בלוציפראז לבנות. מערבבים ואז דגירה את התערובת למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את פתרון ה-DNA FuGENE 6-Opti-ממ אל התאים באמצעות טפטוף לתוך זה שווה התקשורתי של Cos1 תאים. </li></ol> חלק 2: מסיק Renilla-אנטיגן fusions <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לאחר transfection, קוס-1 התאים נקצרים. זו שיזמה הוצאת התקשורת ולאחר מכן לשטוף את התאים עם 6 מ&quot;ל של PBS. לאחר decanting PBS, פיפטה משם כל PBS שיורית מצלחת בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.4 מ&quot;ל של חיץ תמוגה קר מורכב 50 מ&quot;מ טריס, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 1% Triton X-100, גליצרול 50% מעכבי פרוטאז (2 טבליות של קוקטייל מעכב להשלים miniprotease לכל 50 מ&quot;ל של חיץ תמוגה). תאים קציר עם scrapper תא במהירות העברת מחצית lysate לכל אחד משני צינורות microfuge 1.5 מ&quot;ל על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonifier ברנסון 150 משמש כדי לשבור את התאים פתוחים. מניחים את הצינור microcentrifuge המכיל את תא lysate על קרח הדופק במשך 5 שניות, 5 שניות ו -5 שניות עם הגדרות sonication של 2, 2 ו -4, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate התא 12,500 RPM עבור שני ספינים 4 דקות ב 4 ° C. לאחר הסיבוב הראשון, בעדינות להפוך את הצינורות כדי להסיר את פסולת מחוברת ברישול מ דפנות הצינור. אחרי הסיבוב השני, בזהירות העברת supernatant, מבלי לשבש את גלולה, משני צינורות לצינור microfuge חדש על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב יחידות אור (LU) לכל μl של lysate. כדי למדוד את LU, לדלל 1 μl של lysate עם 8 μl של PBS בצינור microfuge חדש. להוסיף ישירות 100 μl של המצע 1X coelenterazine לתערובת מדולל ומיד למדוד הארה בצינור באמצעות צינור luminometer (20/20 n טרנר מדעי) עם לקרוא 5 השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות lysate משטרת אלסטר-אנטיגן ב -20 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים או לאחסן לתקופה ארוכה יותר של פעמים aliquots ב -80 ° C. </li></ol> חלק 3: הכנת פלייט מאסטר סרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחת אב סרה על ידי הראשון להוסיף 450 μl של החיץ (50 מ&quot;מ טריס, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 1% Triton X-100) היטב בכל צלחת 96-עמוק היטב microtiter פוליפרופילן . בשלב זה, צבע אדום, פנול, יכול גם להיכלל במאגר (הריכוז הסופי הוא 0.2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ב חיץ) לשמש נותב לניטור בעתיד בנוסף סרה מדגם וצעדים אחרים של assay השפתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן להוסיף 50 μl של סרה מכל מדגם של בארות שונות המכילות 450 μl של חיץ א הערה זו היא דילול 1:10 של סרה ב חיץ א בדרך כלל לא סרה הוא הוסיף שתי בארות האחרון של צלחת האב כי זו שמורה החסר חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש צלחת המאסטר, הוא מזועזע בהרחבה (1-2 שעות) על פלטפורמה rotator. סרום בצלחת המאסטר stable במשך חודש לפחות 1 (או יותר) בשעה 4 ° C, אם מאוחסן בצורה נכונה על מנת למנוע אידוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כפי שנראה בהמשך, זה אדון צלחת מספק 10 μl של סרה בדילול להסירו שוב ושוב פרופיל של סרה נגד אנטיגנים שונים. צלחות אמן גדול וקטן גם יכול להיות מועסק. חותם את הצלחת היטב עם Parafilm כאשר הוא אינו בשימוש. </li></ol> חלק 4: assay שפתיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוליפרופילן 96-רדוד צלחות microtiter גם משמשים מבחן סרה. בשלב הראשון, להוסיף 40 μl של חיץ היטב בכל צלחת 96-היטב באמצעות micropipette ערוץ 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא לקחת 10 μl של סרה מדולל (1 μl המקבילה סרה) מהצלחת האב ולהוסיף אותה ישירות גם כל הצלחת לעבוד באמצעות micropipette ערוץ 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב מאסטר המכיל את תמצית משטרת אלסטר-אנטיגן מנוסחת הבא כזה 1 X 10 7 יחידות אור (LU) הוא הוסיף 50 μl של חיץ היטב כל אחד. תשומות התחתון (קצת כמו 1 X 10 6) יכול לשמש גם, אבל התוצאה בטווח דינמי נמוך יותר. הפוך תערובת אב פיפטה 50 μl של תערובת משטרת אלסטר-אנטיגן היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת על שייקר רוטרי במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדגירה, מוסיפים 5 μl של השעיה של 30% של חלבון Ultralink A / G חרוזים (פירס ביוטכנולוגיה, Rockford, IL) ב-PBS לתחתית היטב כל אחד חדש 96 גם לסנן HTS צלחת (Millipore, בדפורד, מסצ&#39;וסטס) . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 1 שעה, להעביר את התגובה 100 μl משטרת אלסטר-אנטיגן בתערובת נוגדנים ל 96 גם צלחות לסנן HTS המכיל את החלבון A / G חרוזים באמצעות micropipette ערוץ 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחת 96-לסנן היטב על שייקר רוטרי 1 שעה נוספת בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן לשטוף את הצלחת לסנן על סעפת ואקום. גם כל שטף 8 פעמים עם 100 μl של הצפת, ואחריו שתי פעמים עם 100 μl של PBS. זה יכול להתבצע באופן ידני או עם תחנת עבודה pipetting רובוטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות לשטוף האחרון, הריק כבוי. הסר את צלחת לסנן כתם זה יבש באמצעות ערימה של מגבות נייר או נייר פילטר לוודא להסיר לחות על החלק העליון והתחתון של הצלחת. </li></ol> פרק 5: מדידת הארה ניתוח נתונים הקמה: 960 LB ברטולד Centro luminometer microplate משמש לקביעת הארה בכל היטב באמצעות מזרק אחד. ברגע שהמכונה פועלת, לשטוף את מזרק עם מזוקקים H 2 O באמצעות מחזור לשטוף מזרק. המצע Coelenterazine מוכן באמצעות המצע Renilla Promega ערכת כפי שתואר על ידי היצרן. בדרך כלל 6 מ&quot;ל של תערובת coelenterazine 1X המצע (כלומר 60 מניות coelenterazine μl פלוס 6 מ&quot;ל של חיץ 1X) מוכן תחול את המכונה פועלת אחת צלחת 96-היטב. לפני ניתוח צלחת, 960 LB ברטולד Centro luminometer microplate ערוכה עם המצע 1X coelenterazine. פתיחת קובץ המכיל את תוכנית ההגדרה להזרקת המצע וקריאה את הצלחת. עבור מדידות אלה, 50 μl של המצע coelenterazine מוזרק, הצלחת הוא מזועזע למשך 2 שניות, ואחריו 5 שניות לקרוא של הארה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרות luminometer צלחת יש את היכולת לקרוא את הצלחת כולה, לקרוא חלקית של הצלחת יכול להיות גם שנבחר (תחת תפריט לקרוא). הפעל את התוכנית, אשר יוזם קריאה של הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הריצה, להסיר את צלחת לסנן microtiter מיד כדי למנוע דליפה של luminometer. ייצוא נתונים שנוצר עם התוכנית MikroWin לתוך תבנית של Excel לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו ממליצים הערכת סרה משני רץ עצמאית. נתונים ממוצעים אז כדי ליצור את הערכים titer LU עבור כל דגימה. ערכים אלה יכולים להמשיך להיות מותאם כדי להפחית את החסר חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתונים נוספים כגון קביעת הפסקת יכול להיות מחושב על ידי לקיחת הממוצע פלוס 3 או 5 סטיות תקן של ערכי שליטה. </li></ol>

<ol><li>Burbelo, P. D., Goldman, R., Mattson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+immunoprecipitation+method+for+quantitatively+measuring+antibody+responses+in+clinical+sera+samples+by+using+mammalian-produced+Renilla+luciferase-antigen+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A simplified immunoprecipitation method for quantitatively measuring antibody responses in clinical sera samples by using mammalian-produced Renilla luciferase-antigen fusion proteins.</a> BMC Biotechnol. 5, 22-22 (2005).</li>
<li>Burbelo, P. D., Leahy, H. P., Iadarola, M. J., Nutman, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Four-Antigen+Mixture+for+Rapid+Assessment+of+Onchocerca+volvulus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">A Four-Antigen Mixture for Rapid Assessment of Onchocerca volvulus Infection.</a> PLoS Negl Trop Dis. 3, e438-e438 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+luminescent+profiling+of+anti-La+and+other+autoantibodies+in+Sj+gren%E2%80%99s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust luminescent profiling of anti-La and other autoantibodies in Sj gren’s syndrome.</a> Autoimmunity. 139, 241-245 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+antibody+quantification+and+generation+of+whole+proteome+antibody+response+profiles+using+LIPS+%28luciferase+immunoprecipitation+systems%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Rapid antibody quantification and generation of whole proteome antibody response profiles using LIPS (luciferase immunoprecipitation systems).</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 889-895 (2007).</li>
<li>Burbelo, P. D., Groot, S., Dalakas, M. C., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+definition+profiling+of+autoantibodies+to+glutamic+acid+decarboxylases+GAD65%2FGAD67+in+stiff-person+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">High definition profiling of autoantibodies to glutamic acid decarboxylases GAD65/GAD67 in stiff-person syndrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 366, 1-7 (2008).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+luminescence+assay+for+autoantibodies+to+mammalian+cell-prepared+insulinoma-associated+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">A new luminescence assay for autoantibodies to mammalian cell-prepared insulinoma-associated protein 2.</a> Diabetes Care. 31, 1824-1826 (2008).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+diagnosis+of+human+herpes+simplex+virus+type+1+and+2+infections+by+luciferase+immunoprecipitation+system+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serological diagnosis of human herpes simplex virus type 1 and 2 infections by luciferase immunoprecipitation system assay.</a> Clin Vaccine Immunol. 16, 366-371 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+quantitative+serological+detection+of+anti-cytomegalovirus+%28CMV%29+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Highly quantitative serological detection of anti-cytomegalovirus (CMV) antibodies.</a> Virol J. 6, 45-45 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-antigen+mixture+containing+v-cyclin+for+serological+screening+of+human+herpesvirus+8+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Four-antigen mixture containing v-cyclin for serological screening of human herpesvirus 8 infection.</a> Clin Vaccine Immunol. 16, 621-627 (2009).</li>
<li>Ramanathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+luciferase+immunoprecipitation+systems+assay+enhances+the+sensitivity+and+specificity+of+diagnosis+of+Strongyloides+stercoralis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A luciferase immunoprecipitation systems assay enhances the sensitivity and specificity of diagnosis of Strongyloides stercoralis infection.</a> J Infect Dis. 198, 444-451 (2008).</li>
</ol>

שפתיים דורש אופטימיזציה assay מינימלי, בשל הפשטות שלו, נתונים באיכות גבוהה בדרך כלל יכול להיות שנוצר באמצעות השפתיים תחת שבועיים אנטיגן נתון. השלבים זמן רב ביותר הם שיבוט ויצירת וקטור ביטוי הולם פלסמיד המכיל את היתוך משטרת אלסטר-אנטיגן. לאחר פלסמידים אלה נוצרות, אנטיגנים בודדות או מרובות, ניתן לבדוק במהירות עם השפתיים כפי שתואר לעיל. יש לציין כי הוא שפתיים צדדי למדי כך סרה יכול גם להיבחן במתכונת צינור או לחילופין על צלחת microtiter לסנן בעזרת תחנת עבודה BIOMEK רובוטית 2 או מכונת כביסה צלחת עם סינון ואקום. מערכת זו ניתנת להרחבה מאפשרת השפתיים במקביל פרופיל של פאנל של autoantigens האדם 3 או 4 proteome שלם של וירוס. סביר להניח כי רבים פרופילים שונים נוגדן שנוצר על ידי שפתיים יהיה שימושי עבור 3-9 האבחון, הגילוי אנטיגן 9, בעקבות מהלך הטיפול 10, ניטור החיסון יש השלכות רחבות על מדינות מחלה ספציפית לבריאות הציבור בכלל.

<table><tbody><tr><td>ערכת HiSpeed Plasmid Midi</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות לתרבית רקמה 100 x 20 מ"מ</td><td>Fisher Scientific</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6</td><td>קבוצת Roche</td><td>1814443</td><td></td></tr><tr><td>תערובת מלאה של מעכבי פרוטאז, Mini protease inhibitor cocktail</td><td>קבוצת Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>פלטת 96 בארות עמוקות (DeepWell) מポリפרופילן, 1 מ"ל</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-566-120</td><td>פלטת בארות עמוקה עם מכסה ואיטום באמצעות Parafilm</td></tr><tr><td>פלטת מיקרוטיטר מפוליפרופילן</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-566-120</td><td></td></tr><tr><td>פלטת סינון ל-HTS</td><td>EMD Millipore</td><td>MSBVN1B50</td><td></td></tr><tr><td>Ultralink Protein A/G מקובע</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>53133 (10 מ"ל)</td><td></td></tr><tr><td>מערכת בדיקת לוציפראז של Renilla</td><td>Promega Corp.</td><td>E2820</td><td>עבור 2000 בדיקות</td></tr><tr><td>לומינומטר לפלטות מיקרו Centro</td><td>Berthold Technologies</td><td>LB 960</td><td></td></tr></tbody></table>

נוגדן פרופיל על ידי מערכות immunoprecipitation בלוציפראז (שפתיים)

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

טכנולוגיות מקיף הבנה וכימות פרופילים נוגדנים autoantigens וסוכני זיהומיות עשוי להניב תובנות חדשות על מנגנוני המחלה עשויה להבהיר סמנים חדשים substratify המחלה עם מאפיינים קליניים שונים להבין טוב יותר את הפתוגנזה. פיתחנו שיטה כמותית מאוד שנקרא מערכות immunoprecipitation בלוציפראז (שפתיים) עבור פרופיל החולה התגובות סרה נוגדנים autoantigens ו אנטיגנים הפתוגן הקשורות לזיהום. בניגוד ELISAs, השפתיים רגיש במיוחד מיושם בקלות סקר הלחות פרופילים בתגובה סרולוגיות ל אנטיגנים שונים בפורמט אוניברסלי ומייצרת כייל הנוגדנים דינמי טווחי עד יומן 6<sub&gt; 10</sub&gt; עבור אנטיגנים מסוימים. במחקרים אלה, על ידי אפיון כמותי שפתי הלחות תגובות החולה נגד לוחות של אנטיגנים או אפילו proteome שלם של כמה פתוגנים (כלומר ה-HIV), הוא בדרך כלל יותר אינפורמטיבי מאשר בדיקת אנטיגן אחד על ידי ELISA. בנוסף, השפתיים גם מבטל הזמן והמאמץ הדרושים כדי לייצר אנטיגנים מטוהרים וכן עתירי עבודה אופטימיזציה assay הצעדים הדרושים ELISAs סטנדרטי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט המתאר את ההיבטים הטכניים של ביצוע מבחני שפתיים עבור בקלות פרופיל התגובות נוגדנים לאנטיגנים יחידים או מרובים.

ההיבטים הטכניים של ביצוע שפתיים (מערכות immunoprecipitation בלוציפראז) מתוארים. הגישה הכללית כרוכה לבטא גנים chimeric קידוד אנטיגנים התמזגו Renilla בלוציפראז (משטרת אלסטר) בתאי יונקים. גולמי משטרת אלסטר-אנטיגן תמציות מוכנים אז, ללא טיהור, המועסקים מבחני immunoprecipitation לכמת נוגדנים.

טכנולוגיות להבנה ולכימות מקיפים של פרופילי נוגדנים לאוטו-אנטיגנים ולגורמים זיהומיים עשויות להניב תובנות חדשות לגבי מחלות...

סרטון זה מדגים את השלבים המעורבים בביצוע ה-lips. אנטיגנים של המסה מובעים בתאי CO one כחלבונים רקומביננטיים המהווסים ללוסיפרז ran vanilla או לאנטיגן rook. תמציות גולמיות מופקות ונעשה בהן שימוש ללא טיהור.בדיקת ה-lips מתחילה על ידי דגירה של תמריות אנטיגן גולמיות של rook עם SRA של המטופל. בבארות מיקרוטיטר, תערובת הנוגדן והאנטיגן מועברת לאחר מכן ללוחית סינון של 96 בארות המכילה חרוזי protein A G ללכידת מולקולות IgG, לאחר שטיפת לוחית הסינון המכילה את חרוזי ה-protein AG. אנטיגן rook הקשור לנוגדנים נמדד על ידי הוספת סובסטרט linine, ויחידות האור נמדדות באמצעות לומינומטר.שלום, אני ד"ר קתרין צ'אנג מהמעבדה לביולוגיה חושית במכון הלאומי למחקר דנטלי וקרניו-פציאלי. היום נראה לכם את ההליך למערכות immunoprecipitation של לוסיפראז ב-LIPS. אנו משתמשים ב-LIPS במעבדה שלנו כדי למדוד titers של נוגדנים לצורך אבחון מחלות ו/או זיהומים.שכבות תתי-סדירה של מצבי מחלה, ניטור חיסונים ויישומים אחרים המערבים יצירת פרופילים של נוגדנים. אז בואו נתחיל. לפני תחילת הטרנספקציה, מכינים מראש פלסמידים עבור היתוכי לוציפרז (luciferase fusions) כפי שמתואר במאמר של BMC biotechnology.DNA פלסמידלפי BYO et al 2005 מוכן באמצעות ערכת MIDI prep עם תפוקה של מיליגרם אחד עד שלושה, ונשמר כתמיסת מלאי בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. תאי Cost 1 המשמשים להסבה (transfection) גודלו ב-DMEM עם 10% FCS לפי פרוטוקולים סטנדרטיים לתרבית רקמה. יום אחד לפני ההסבה, פצלו את תאי ה-Cost 1 לצלחונות חדשים בגודל 100 על 20 מילימטר, בריכוז של בערך 2 פעמים 10⁶ תאים לצלחת, והדגירו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד למחרת.על התאים להיות בדרגת התמסכות (confluency) של 80% עד 95%. אפשרו לריאגנט הטרנספקציה FUgene 6, המאוחסן בטמפרטורה של 4°C, להתחמם לטמפרטורת החדר. בזמן ההמתנה לחימום ה-FUgene, סמנו פרועות מיקרו-צנטריפוגה מפוליפרופילן בנפח 1.5 ml עבור כל DNA פלסמידי המיועד לטרנספקציה, תוך הקפדה לא לגעת בדפנות הפרועות. הוסיפו 6 µL של FUgene 6 לפרועות, אשר כבר צריכות להכיל 94 µL של מצע אופטימלי (optimum media). דגרו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, הוסיפו 1 עד 2 µg של פלסמיד המכיל מבנה איחוי (fusion construct) של ran Lucifer antigen. ערבבו על ידי היפוך הפרועה מספר פעמים, צנטריפגו קצרה ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.העבירו את כל תמיסת האופטימום של ה-DNA fusion six לתאים על ידי טפטוף אחיד לתוך המצע של תאי ה-cos one. דגרו את תאי ה-cos one שעברו טרנספקציה למשך יומיים ולאחר מכן בצעו קציר. כדי להתחיל בקציר של חלבון היתוך (fusion protein), הסירו את המצע ושטפו את התאים עם 6 mL של PBS.שאבו החוצה כל שארית של PBS ממעטחת תרבית הרקמה, הוסיפו 1.4 milliliters של lysis buffer קר וגשתו את התאים באמצעות גורר תאים (cell scraper), והעבירו במהירות מחצית מהליזט לכל אחד משני מבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter על קרח. לביצוע סוניקציה של התאים נעשה שימוש במכשיר Branson SOLIDIFIER one 50. הניחו את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה המכילה את ליזט התאים על קרח ובצעו פולסים למשך חמש שניות.חמישה שניות וחמישה שניות. עם הגדרות סוניקציה של שתיים, שתיים וארבע בהתאמה. סבבו במערך צנטריפוגה את ליסאט התאים ב-12,500 RPM למשך ארבע דקות.סבב במערבל (Centrifuge) בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס. הפוך בעדינות את המבחנות בין הסבבים כדי להסיר שאריות שנדבקו באופן רופף לדפנות המבחנה. לאחר מכן, העבר בזהירות את העליון (supernatant) משתי המבחנות למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה על קרח, מבלי להפריע למשקע (pellet).כדי למדוד את יחידות האור או ה-lu של הליזט, דללו מיקרוליטר אחד של ליזט עם שמונה מיקרוליטר של PBS בתוך מבחנה חדשה למיקרו-צנטריפוגה. הוסיפו ישירות 100 מיקרוליטר של תסבסב one celent ine לתערובת המדוללת ומדדו מיד את הלומנסנס במבחנה באמצעות לומנומטר למבחנות, עם זמן קריאה של חמישה שניות מהשלב הזה והלאה. זכרו להקפיד על אמצעי בטיחות בעבודה עם דגימות אנושיות ובעיר. כדי להכין פלטת מאסטר של סרום המהווה את מקור הנוגדנים של המטופל עבור פרופיל אנטיגנים, הוסיפו תחילה 450 מיקרוליטר של באפר A לכל באר בלוח מיקרוטיטר פוליפרופילן בעל 96 בארות עמוקות.בשלב זה, ניתן להוסיף למסנן A גם את הצבע phenol red שישמש כסמן למעקב אחר הוספת דגימות SRA עתידיות ושלבים אחרים של בדיקת ה-lips. לאחר מכן, הוסיפו 50 microliters של סרום מכל דגימה לכל באר המכילה 450 microliters של מסנן. שימו לב, זהו דילול של 1 ל-10 של ה-SRA במסנן.בדרך כלל לא מוסיפים SRA לשתי הבארות האחרונות של לוחית המאסטר, מכיוון שאלה שמורות לדגימות ביקורת של התמיסב (buffer blanks) לפני אחסון לוחית המאסטר לשימוש עתידי. הלוחית מנוערת באופן נרחב למשך שעה עד שעתיים על פלטפורמת סיבוב (rotator). במהירות של 650 RPM, הסרום נשאר יציב למשך חודש אחד לפחות או יותר בטמפרטורה של 4 °C, וניתן לאטום את הלוחית עם פאראפילם (parafilm) כדי למנוע התאיידות אם היא תאוחסן לפני ביצוע בדיקת ה-lips; יש לארגן גיליון נתונים המכיל את מספרי הזיהוי של הדגימות והבארות המתאימות להן בלוחית המאסטר. לוחות מיקרוטיטר מפוליפרופילן בעלי 96 בארות רדודות משמשים כלוחיות עבודה לבדיקת הסרומים.בשלב הראשון, העבירו 40 µL של בופר A לכל באר בלוחית בעלת 96 בארות באמצעות מיקרופיפית בעלת שמונה ערוצים. לאחר מכן, העבירו 10 µL של סרום מדולל מהלוחית הראשית (master plate) ישירות לכל באר בלוחית העבודה באמצעות מיקרופיפית בעלת שמונה ערוצים. לאחר השימוש, אטמו את הלוחית הראשית באמצעות פאראפילם, החזירו את המכסה ללוחית הראשית, לאחר מכן כסו בניילון נצמד ושמרו בטמפרטורה של 4 °C.בשלב הבא י formulation של תערובת מאסטר (master mix) המכילה את תמצית האנטיגן של העורב (rook antigen extract), באופן שבו לכל באר יתווספו 10⁷ lu ב-50 µL של בופר A. הכין את תערובת המאסטר הזו והעבר בפיפטה 50 µL מתערובת האנטיגן של העורב לכל באר. כסה את הפלטה במכסה פוליסטירן והדגר במערער סיבובי (rotary shaker) במהירות של 100 RPM למשך שעה אחת.בטמפרטורת החדר במהלך הדגירה, הוצא מהמקרר מנה (aliquot) של 1.5 milliliter של תרחיף חרוזי protein ag ultra link בריכוז 30% ב-PBS. הוסף חמישה microliters לתחתית כל באר בלוח סינון HTS חדש בעל 96 בארות. לאחר דגירה של שעה אחת של הלוח, העבר 100 microliters מתערובת התגובה של נוגדן לאנטיגן rook ללוחי סינון HTS בעלי 96 בארות המכילים את חרוזי ה-protein ag, באמצעות מיקרופיפט בעל ערוץ A. דגור את לוח הסינון בעל 96 הבארות על שייקר סיבובי למשך שעה נוספת ב-100 RPM בטמפרטורת החדר.בשלב הבא, שטפו את פלטת הסינון באמצעות תחנת עבודה אוטומטית Biome FX. בעזרת סעפת ואקום, כל באער נשטף שמונה פעמים עם 100 µL של בופר A, ולאחר מכן פעמיים עם 100 µL של PBS. לאחר השטיפה האחרונה, יש לכבות את הוואקום. הסירו את פלטת הסינון וייבשו אותה בעזרת ערימת נייר סופג או נייר סינון, תוך הקפדה להסיר את הלחות מהחלק העליון והתחתון של הפלטה. לצורך קביעת הלומינסנציה בכל באער של הפלטה, השתמשו במד לומינסנציה Burt hold LB nine 60 Centro Microplate.הפעילו את המכשיר ושטפו את המזרק במים מזוקקים. מחזור שטיפת המזרק משתמש בתסבך INE לצורך הכנה והפעלת המכשיר, אשר מוכן באמצעות ערכת התסבך ranil של Promega לפי הוראות היצרן; בדרך כלל נדרשים ששה מיליליטרים של תערובת תסבך אחת עבור פלטה אחת. טענו את תערובת התסבך לתוך הלומינומטר ופתחו קובץ תוכנית המכיל את ההגדרות להזרקת התסבך וקריאת הפלטה.עבור מדידות אלו, מוזרקים 50 µL של סובסטרט לומינול. את הפלטה מנערים למשך שתי שניות, ולאחר מכן מבצעים קריאה של הלומינצנציה למשך חמש שניות.הפעילו את התוכנית המתחילה את קריאת הפלטה לאחר הריצה, והסירו מיד את פלטת הסינון של המיקרוטיטר כדי למנוע נשפכת של חומר לתוך הלומינומטר. הנתונים מיוצאים באופן אוטומטי מתוכנית ה-microwind לפורמט Excel לצורך ניתוח נוסף. ביצוע ממוצע של תוצאות משתי ריצות שונות עם אותם סרומים.כדי להפיק ערכי titer של lu, מומלץ לבצע מדידה עבור כל דגימה. הדגימות הכפולות צריכות להראות הלימה גבוהה בערכי ה-titer בין שתי ההרצות. לצורך שרטוט הנתונים, ניתן להתאים את ערכי ה-titer של ה-lu על ידי חיסור הblanks של התמיסה, כפי שמוצג כאן.ניתן לחשב את הרגישות והסגוליות של הבדיקה גם באמצעות שימוש בערכי סף הנגזרים מהממוצע פלוס שלוש או חמש סטיות תקן של דגימות הביקורת. הרגע הראינו לכם כיצד למדוד טיטרים של נוגדנים באמצעות LIPS; שיטת LIPS דורשת אופטימיזציה מינימלית של הבדיקה, ובשל פשטותה ניתן להשתמש בה להפקת נתונים באיכות גבוהה תוך פחות משבועיים עבור כל אנטיגן נתון. בעבודה עם סראם אנושי, חשוב לזכור לנקוט באמצעי בטיחות מתאימים.וזכרו, שיטת Lifts היא בעלת יכולת התרחבות גבוהה, ובשל כך ניתן להשתמש בה למדידה של מספר קטן של דגימות באמצעות שטיפה ידנית או של לוחית מלאה באמצעות תחנת עבודה רובוטית. בזכות רב-גוניות זו, אנו סבורים כי Lifts תהיה שימושית ביותר בניתוח סרו-אנטיגני ותהיה בעלת השפעות רחבות על ניתוח מחלות ועל בריאות הציבור באופן כללי. ובכן, זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויי אפיון הנוגדנים שלכם.

antibody-profiling-by-luciferase-immunoprecipitation-systems-lips

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ELISA ניתן להמיר בקלות assay Luminex Xmap, ובאמצעות היתרונות של נוגדנים, ריבוב כמה יכול להיות מוקרן בו זמנית לזהות נוגדנים זוג אופטימלי, והתוצאה היא רגישות מוגברת טווח דינמי, תוך הפחתת עלות assay.

המרת ELISA ללכוד Assay Luminex Xmap באמצעות נוגדן Multiplex שיטת הקרנה

הסרטון מדגים את בדיקת לוציפראז המשמשת לכימות חלבונים המתויגים בלוציפראז. הבדיקה משתמשת באנזים לוציפראז מהונדס המורכב מקטע גדול שנקשר למקטע הקטן, אשר מצומד עם חלבון מעניין. תת-היחידות הכבולות יוצרות אנזים פעיל שבנוכחות המצע משחרר אות זוהר. אות זה מכומת לאחר מכן באמצעות לומינומטר.

בדיקת לוציפראז: בדיקת תפוקה גבוהה למדידת אותות זוהרים באמצעות ביו-כתבים מבוססי מערכת ננולוציפראז מהונדסים

סרטון זה מדגים את השימוש בבדיקת ELISpot כדי להעריך את תפקודם של תאי B מפרישי נוגדנים, ASC. הנוגדנים המופרשים על ידי ASCs אינטראקציה עם מקטעי נוגדנים רב-שבטיים הקשורים לקרום, אשר מזוהים על ידי נוגדני IgG או IgM מצומדים אנזים. הכתם הצבעוני שנוצר בכל באר מעיד על נוכחות איזוטיפ של הנוגדן הספציפי, אשר נמצא בקורלציה עם פעילות ההפרשה של תאי B.

הערכה תפקודית של תאי B מפרישי נוגדנים באמצעות בדיקת ELISpot

אינטראקציות חלבון-חלבון יכולות להתרחש הן בגרעין והן בציטופלזמה של התא. כדי לחקור אינטראקציות אלה, מיושמים קו-אימונו-משקעים מסורתיים ובדיקת קשירת קרבה מודרנית. במחקר זה, אנו משווים את שתי השיטות הללו כדי לדמיין את התפלגות האינטראקציות של NF90-RBM3 בגרעין ובציטופלזמה.

ויזואליזציה של אינטראקציה בין חלבונים ב גרעיני cytoplasmic שברים על ידי Co-immunoprecipitation ו<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות

ראגנטים מבוסס-נים באמצעות פלטפורמה מסחרית כדי למדוד את היעד חלבונים מן ההכנות חלבון הכולל הוא הפגין. בנוסף, הפרמטרים וזמינותו של זמן החשיפה, לריכוז החלבון נוגדן דילול הממוטבות מערכת מודל של התרבות תאים.

הליך ואסטרטגיות אופטימיזציה מפתח שיטה אוטומטית נימי מתכלה מבוסס על Electrophoretic

חוקרים רבים, שינויים post-translational אנדוגני על חלבון המטרה יכול להיות מאוד מאתגר. טכניקות המתוארים כאן לנצל את פירוק ממוטבת מאגר ומסנן מערכת שפותחה עם ספציפי PTM פילוח, מטריצות זיקה לזהות את השינויים זרחון acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 וטירוזין עבור מטרה חלבון באמצעות מערכת יחיד, יעיל.

ניצול מערכת העשרה Immunoprecipitation מקיף כדי לזהות פרופיל אנדוגני שינוי Post-translational של חלבונים היעד

כאן, אנו מראים כיצד להשתמש Assay מצדו קרבה (PLA) כדי להמחיש את MST1/MST2 heterodimerization בתאים קבוע עם רגישות גבוהה.

זיהוי של Heterodimerization של חלבון איזופורמים שימוש בחיי עיר הקרבה מצדו Assay

כאן אנו מציגים ביוסנסור מבוססי לוציפראז לכמת את פעילות קינאז מדכאי גדולים (באמת)-קינאז המרכזית בההיפופוטם איתות. ביוסנסור הזה יש יישומים שונים ומגוונים במחקר בסיסי והתרגום שמטרתה לחקור היפו מסלול הרגולטורים במבחנה וב -vivo.

ניטור היפו איתות לשביל פעילות באמצעות ביוסנסור משתיק קול (באמת) מבוסס-לוציפראז הגידול גדול

שיטת BSelex כדי לזהות ולשחזר נוגדנים ספציפיים אנטיגן ספציפי של הדם היקפיים היקפי תאים מונמונומנט משלבת הזרימה cy, לנסות עם תא בודד PCR ו שיבוט.

שיטת הקרנה של תא בודד לבחירת ושחזור של נוגדנים עם הצורך הרצוי מתוך זיכרון אנושי מועשר B אוכלוסיות תאים

הפרוטוקול המתואר מתאר את ההליך לייצור קומפלקס חלבון תחום מחייב קולטן HiBiT ויישום שלו לזיהוי מהיר ורגיש של נוגדני SARS-CoV-2.

זיהוי נוגדן דומיין מחייב קולטן SARS-CoV-2 באמצעות ביו-דו"ח מבוסס HiBiT

למד את שיטת LIPS לכימות נוגדנים בתאי COS-1 באמצעות חלבוני Renilla luciferase. שיטה זו מאפשרת אבחון מחלות ומעקב אחר חיסונים ביעילות גבוהה.

נוגדן פרופיל על ידי מערכות immunoprecipitation בלוציפראז (שפתיים)

גלה סרטונים נוספים