לימוד תוקפנות תסיסנית (זבובי פירות)
25 בפברואר 2007
שמי שרה ארטל ואני פוסט-דוקטורנטית במעבדה של אד קרויביץ כאן במחלקה לנוירוביולוגיה בבית הספר לרפואה של הרווארד. שמי סיבו. אני סטודנט לרפואה מגרמניה ואני מבצע רוטציית מחקר כאן במעבדה של קרויביץ.
אנו רוצים להראות לכם כיצד אנו מקימים קרבות ובוחנים את התוקפנות של זבובים פירות. השלב הראשון הוא הכנת מבחנות בידוד, הכוללת חימום של מזון לזבובים במיקרוגל והוספה של 1.5 mils למבחנת תרבית לאחר שהמזון התמצק. לאחר מכן, אנו חוסמים את פתח המבחנה בעזרת צמר גפן.
השלב הראשון הוא השגת זבובים נאיביים מבחינה חברתית. לא ראיתי שום זבוב אחר. וכדי לעשות זאת, אנו לוקחים בובות בשלב מאוחר של סוגי הזבובים שמעניינים אותנו, ומסירים את הבובות מהבקבוקון בזהירות באמצעות פינצטה.
קחו את מבחולת הבידוד שהוכנה, הסירו את הפתם והניחו בעדינות את הפופיליס (puy) בפנים, סגרו את המבחולה וסמנו אותה. פופיליס אלו מוחזרים לאינקובטור בעל בקרת אקלים עם מחזור יומם-לילה. למחרת נבדוק אם הם התיריגו (enclosed), ולאחר מכן נרשום את התאריך שבו הזבובים התיריגו.
לאחר מכן אנו ממתינים להגעה לגיל של שלושה עד חמישה ימים, ובמהלך זמן זה אנו שמים צבע על גב הבטנו של הזבובים כדי שנוכל לזהות אותם. כעת אנו מכינים תאים עבור הקרבות עצמן. כדי לעשות זאת, אנו משתמשים בשני דגמי תכשיטי מיקרוסקופ רגילים, נמדוד את המרכז ונסמן אותו בעזרת סיכת חיתוך יהלום, נשרט את הפני השטח, ואז אם נמצא את הקצה, זכוכית המיקרוסקופ אמורה להישבר בקלות לשניים. בסדר.
לאחר מכן, אנו מדביקים את קצות השקופיות באמצעות דבק. לאחר מכן, שני החצאים מודבקים זה לזה ליצירת קופסה. ניתן לנקות אותה עם 70%ethanol ולאחר מכן עם מעט מים כדי להסיר שאריות טביעות אצבע.
מלאו את תחתית התא ב-1% agros והכניסו את התא פנימה. פעולה זו מספקת לחות עבור הזבובים. לאחר מכן, נרצה לתת לזבובים משהו להילחם עליו.
לכן, למרות שניתן להחשיב את הגודל של התא כטריטוריה, אנו מספקים להם מזון. אנו מניחים את המזון בתוך בקבוקון סינפילציה (scintillation vial). דבר זה יוצר רמה נוספת של טריטוריאליות פוטנציאלית שזבוב עשוי לרצות להגן עליה.
כעת אקח את המזון שחומם acabado במיקרוגל ואמלא אותו לתוך כוסות המזון, שהן למעשה מכסי סינפילציה (scintillation caps), שישמשו כזירה שבה הזבובים יילחמו מאוחר יותר. חשוב ליצור תבנית מעט קמורה כדי שניתן יהיה לראות את כל פני השטח. כמו כן, יש להימנע מהיווצרות בועות אוויר, שכן הן יהוו מכשול עבור הזבובים בעת הליכתם על כוס המזון, וזאת כדי למשוך את הזבובים אל כוס המזון.
נוסיף גם טיפה של משחת שמרים במרכז כוס המזון. ראשית, עלינו להכין את משחת השמרים. נקח משחת שמרים חיה, נניח אותה בכוס מזון, ולאחר מכן נוסיף טיפה של מים ונערבב עד לקבלת מרקם של משחה.
לאחר שכוסי המזון התקררו, מניחים את משחת השמרים או טיפה קטנה ממנה במרכז כוס המזון. כעת אנו נמצאים בחדר ההתנהגות, אחד משני חדרי ההתנהגות שלנו. חדר זה הוא חשוך לחלוטין כאשר כל האורות דולקים, והוא בעל בקרת לחות ובקרת טמפרטורה.
לכן אנו שומרים על טמפרטורה של 25 מעלות ומנסים להבטיח שהלחות תהיה מעל 40%, כדי שהזבובים יהיו תחת שליטה של כמה שיותר תנאים. וכעת אכין את הזבובים. כוסות המזון שהכנו מוקדם יותר נמצאות כאן, ואני אכניס אותן לתאים הללו.
נסו למקם אותם במרכז התא. נחזיר את המכסה למקומו. אוקיי. ואני אשתמש בשואב זה כדי לשאוב את הזבובים, בדיוק זוג זבובים.
אני אשתמש בשתי זבובים, אשאב אותם לכאן ולאחר מכן אחשב אותם אל תוך התא. זה מה שאעשה. כעת, אחזיק את המבחנה בצורה זו מכיוון שזבובים ידועים ככאלה הנעים נגד כיוון כבידה ובاتججاه האור, ולכן הם נוטים לעלות למעלה.
כך יהיה לי קל יותר לתפוס אותן כאשר אסיר את הצמר. כפי שניתן לראות, שני הזבובים נמצאים כעת בתוך ה-ator. עליי לוודא גם שבגלל שמדובר בזבובים צבועים, אקח זבוב אחד צבוע וזבוב אחד שאינו צבוע.
או אם נשתמש בשני צבעים, אחד שצבוע בצבע אחד ואחד בצבע השני, אך הם בעלי אותו גנוטיפ. כעת אני מכניס אותם לתא עבור כך. אני מסיר את כדור השעווה.
ישנו חור קטן דרכו אכניס את הזבובים, ואני מנסה למקם את המכסה כך שהזבובים לא יוכלו לברוח כאשר אני מקיש. הם ייפלו מעט ואז אני פשוט נושף, בעדינות, כדי שלא אצטרך לנשוף עליהם בעוצמה כי הדבר יטריד אותם. לוקח להם בין שלוש ל-40 דקות עד שהם נרגעים ובחנו את הסביבה בתוך התא.
לאחר מכן הן יתחילו לתפוס את כוס המזון והקרב יתחיל. כעת אקח את התא כולו ואניח אותו לפני המצלמה, ואעלי לבצע כיוון של הגובה כך שאצלם את כוס המזון מזווית קלה, כדי שנוכל לראות את כל כוס המזון, ושהיא כולה תהיה במיקוד.
החדר שבו מועמדים בדיקות התוקפנות הללו הוא חשוב. זהו חדר מבודד, השומר על היעדר תנועה ורעש. הוא נשמר בטמפרטורה של 25 °C ואנו מנסים לשמור על הלחות בין 45% ל-55% כדי לשמור על הזבובים שביעות רצון ובריאים במצב זה.
בנוסף, אנו מעdimים את התאורה העליונה כדי שהאור על כוס המזון יהווה גם הוא מוקד משיכה עבור הזבובים. שימוש ב-DFA כמערכת מודל ובסוג זה של מערך מאפשר לנו לבחון לא רק את עוצמות התוקפנות, אלא גם את דפוסי התוקפנות הספציפיים שאנו רואים. אנו מעוניינים מאוד להבין כיצד המוח מחווט במהלך ההתפתחות, ולאחר מכן כיצד הדבר בא לידי ביטוי אצל בוגר שלא למד התנהגויות אלו.
לכן הם פשוט יוצאים באופן מיידי ברגע שהם רואים את ההתחלה של האינטראקציה עם הזבובים האחרים. הם יודעים כיצד להסתער, הם יודעים להיות אגרסיביים. על כן, אנו רוצים לדעת כיצד התנהגויות אלו מחובקות במערכת העצבים של הזבובים וכיצד הן נשלטות לאחר מכן.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לחקר תוקפנות בזבובי פירות באמצעות ביסוס קרבות מבוקרים. החוקרים מפרטים את הכנת מבחנות הבידוד עבור הזבובים, שלב חיוני להקמה של מערך הניסוי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- נוירוביולוגיה
- מחקרים התנהגותיים
- מודלים של חרקים
רקע
- הבנת תוקפנות בבעלי חיים יכולה לספק תובנות לגבי מנגנונים עצביים.
- זבוב פירות הוא אורגניזם מודל לחקר השפעות גנטיות וסביבתיות על התנהגות.
- מבחנות בידוד משמשות להכנה ולשכינה של הזבובים לפני הניסויים.
- סביבות מבוקרות הן חיוניות לתצפיות התנהגותיות מהימנות.
מטרת המחקר
- לחקור את מנגנוני התוקפנות בזבובים פירות.
- לבסס שיטה מהימנה להשראת קרבות בין זבובים.
- לתרום להבנת מדעי העצבים ההתנהגותיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של מבחולות בידוד על ידי חימום מזון לזבובים במיקרוגל.
- הוספת מזון שהתמצק למבחולות תרבית.
- סגירה של המזון באמצעות פהק-צמרon למניעת זיהום.
- הקמה של תרחישי לחימה מבוקרים לצורך תצפית.
תוצאים עיקריים
- השיטה מאפשרת תצפית על התנהגות תוקפנית בסביבה מבוקרת.
- מבחנות בידוד משמשות ביעילות לאכלוס זבובים בודדים לפני הניסוי.
- תצפיות ראשוניות מצביעות על שונות ברמות התוקפנות בין זבובים שונים.
- הנתונים שנאספו יכולים לספק מידע למחקרים עתידיים על תוקפנות והמנגנונים העומדים בבסיסה.
מסקנות
- ההתקנה מספקת מסגרת לחקר תוקפנות בזבובים פירותיים.
- מחקרים נוספים יכולים להסתמך על שיטות אלו כדי לבחון גורמים גנטיים המשפיעים על ההתנהגות.
- גישה זו עשויה להוביל לתובנות רחבות יותר לגבי תוקפנות במינים אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
ניתוח כמותי של תוקפנות ב-Drosophila מספק מערכת ניתנת למניפולציה גנטית לצורך ניתוח הבסיס העצבי והמולקולרי של התנהגויות חברתיות מורכבות. מודל זה מאפשר תיקוף של מטרות בשלב מוקדם והפחתת סיכונים מכניסטיים עבור מסלולים נוירו-התנהגותיים הרלוונטיים לגילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). בדיקות התנהגותיות סטנדרטיות בזבובים מאפשרות ביטחון חיזוי והמשכיות תרגומית על פני תיקי מחקר פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשרת בחינה של גנים מועמדים ומעגלים עצביים העומדים בבסיס פנוטיפים של תוקפנות.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרה על ידי קישור מניפולציה גנטית לתוצרי התנהגות מדידים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים של מסלולים נוירוביולוגיים המעורבים בהתנהגות חברתית.
- מספקת פלטפורמה לחקירה מונחית-השערות של מנגנוני תוקפנות שמורים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק נקודות קצה התנהגותיות הניתנות לשחזור ולכימות עבור תהליכי סינון המשכיים.
- מנstandardize משתנים סביבתיים וניסוייים כדי להבטיח את מהימנות הבדיקה.
- מכין מערכות מודל מתוקפות להערכת תרכובות המכוונות למסלולים מווסתים של תוקפנות.
- מאפשר פנוטיפיקה התנהגותית ניתנת להרחבה עבור סריקות גנטיות או פרמקולוגיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה פלטים התנהגותיים לתהליכים נוירוביולוגיים רלוונטיים למחלה לצורך פיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- תומכת ברציפות מהגילוי הגנטי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- מפחיתה סיכון תרגומי על ידי מידול של היבטים שמורים של מעגלי התנהגות חברתית.
- מספקת תובנות מכניסטיות המנחות החלטות קידום מותאמות לסיכון.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
בדיקת תוקפנות זו ממוקמת ברצף הגילוי המוקדם, ומגשרת בין זיהוי מטרות גנטיות לבין תיקוף התנהגותי פרה-קליני במחקר של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות והבהרת מסלולים עבור גנים ומעגלים הקשורים לתוקפנות.
- סריקה: מספקת בדיקות התנהגותיות סטנדרטיות וניתנות לשחזור לצורך השוואה כמותית של התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות.
- אנליטיקה: מייצרת נקודות קצה מדידות, כגון עוצמת תוקפנות ותבניתה, לצורך ניתוח סטטיסטי חסון.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פנוטיפים התנהגותיים של חסרי חוליות למודלים של יונקים לצורך התאמת סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לבדיקות התנהגותיות עבור מחקרים נוירוגנטיים ופרמקולוגיים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתהליך תיקוף של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה של הבדיקות, הדירות ויכולת הרחבה בין צוותי מחקר.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות של המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון בגילוי תרופות לנוירו-התנהגות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מטרות ומסלולים במערכת העצבים המרכזית (CNS).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של Drosophila, בניתוח התנהגותי ובנוירוביולוגיה.
- נחושה תשתית סביבתית מבוקרת ללחות, טמפרטורה ותאורה.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים עבור דירוג התנהגותי והגדרת הבדיקה.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- מגבלות מעשיות כוללות התנהגויות ספציפיות למין ורגישות סביבתית.
