Name: הארכת לכידת פריימר: אחזור רצף ממוקד ממקורות DNA מושפל בכבדות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-03T11:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: למדו את שיטת לכידת פריימר להארכה (PECA) לאחזור רצפי DNA עתיקים ממקורות מושפלים בכבדות. השיטה שימשה לשחזור גנומי מיטוכונדריה שלמה מחמש ניאנדרטלים ולחקר גיוון גנטי אבולוציוני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים M. Meyer לקבלת ייעוץ; האקדמיה הקרואטית למדעים ולאומנויות והאקדמיה ברלין ברנדנבורג למדעים עבור תמיכה לוגיסטית ומדעית; וקרן חדשנות הנשיאותי של מקס פלאנק החברה עבור תמיכה כספית. JMG נתמך על ידי מענק NSF הבינלאומי דוקטורט (Oise-0754461). רצפים מופקדים על מסד הנתונים EBI נוקלאוטיד עם מספרים הצטרפות: Neandertal 1 (Feldhofer 1) FM865407, Neandertal 2 (Feldhofer 2) FM865408, Sidron 1253 FM865409, Vindija 33.25 FM865410, Mezmaiskaya 1 FM865411

בשיטה זו נעשה שימוש במחקר דיווחו <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/325/5938/318">בריגס et al. Science 325 (5938). 318-321 (2009)</a> . ריאגנטים הנדרש: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> AmpliTaq זהב פולימראז ה-DNA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10x GeneAmp PCR הצפת II </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MgCl 2 25mm </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> dNTP לערבב, 25 מ&quot;מ כל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארגון ה-BSA, 10 מ&quot;ג-1 מ&quot;ל מים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מים מולקולרית ביולוגיה כיתה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EB חיץ (המסופק עם ערכת טיהור MinElute PCR); 10 mM טריס HCl, pH 8.5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MinElute PCR ערכת טיהור </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> M-270 streptavidin Dynabeads </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2x מחייב לכבס (BW) חוצץ (2 M NaCl, 10 mM טריס-Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0, 0.2% Tween 20) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1x מחייב לכבס (BW) חוצץ (חיץ 2x BindWash 2X מדולל במים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חם לשטוף (HW) חוצץ (2.5mm MgCl, 1X תקי זהב חיץ, 0.1% Tween 20) </li></ul> לפרטים היצרן לגבי שאינם סטנדרטיים ריאגנטים וציוד בהמשך הטבלה. 1) ספריית הגברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תבנית ה-DNA כאן היא ספריית 454 שהוכן מקור ה-DNA נמוכה מספר עותק כמתואר (Rohland ו Hofreiter, 2007a, 2007b) ו (Maricic ו Pääbo, 2009). כדי להגביר את הספרייה כולה, להכין את תערובת ה-PCR הבאים: <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> μl לכל תגובה </td></tr><tr><td> מים </td><td> 45 </td></tr><tr><td> 10X ג&#39;ין Amp PCR חיץ II </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25mm) </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ארגון ה-BSA (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> dNTPs (25 מ&quot;מ כל אחד) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 454 emPCR FWD primer/10uM </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 454 emPCR primer/10uM RVs </td><td> 3 </td></tr><tr><td> AmpliTaq זהב פולימראז ה-DNA (5 U / μl) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 454 הספרייה תבנית ה-DNA </td><td> 25 </td></tr><tr><td> סך הכל </td><td> 100 </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנית הבאה PCR ב Cycler Thermo עבור הגברה מחזורים 14 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 95 ° C 12min </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 95 ° C ה -30 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 60 ° C (או זמני חישול הרצוי) 1 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 72 ° C 1 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור 2 (x 13) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 72 ° C 5min </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ° C ∞ </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את התגובה על עמודה Qiagen ספין MinElute על פי הוראות היצרן. Elute ב EB 50 μl חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את המוצר מוגבר מטוהרים וכן aliquot הספרייה unamplified עם qPCR (Meyer et al. 2007). אם המוצר מוגבר יש יותר מ 1 X 10 12 עותקים ul, להפחית את כמות תבנית הצעד הבא תחל הרחבה על מנת להבטיח כי לא יותר מ 2 X 10 12 עותקים מתווספים התגובה הרחבה פריימר. </li></ol> 2) Primer Extension <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת אב נדרש מספר של תגובות. <table border="0" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> μl לכל תגובה </td></tr><tr><td> מים </td><td> 45 </td></tr><tr><td> 10X ג&#39;ין Amp PCR חיץ II </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25mm) </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ארגון ה-BSA (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> dNTPs (25 מ&quot;מ כל אחד) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 454 emPCR FWD primer/10uM </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 454 emPCR primer/10uM RVs </td><td> 3 </td></tr><tr><td> AmpliTaq זהב פולימראז ה-DNA (5 U / μl) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 454 הספרייה תבנית ה-DNA </td><td> 25 </td></tr><tr><td> סך הכל </td><td> 100 </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התוכנית הבאה Thermocycler עבור התגובה פריימר יחיד סיומת: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 95 ° C 12min </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 60 ° C (או פריימר PEC שלך חישול זמני אם שונה) 1 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 72 ° C 5 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 72 ° C לנצח! שלב קריטי לשמור על התגובה לאחר הארכה על 72 ° C. ואז ישירות פיפטה 150ul PBI או PB חיץ לטיהור MinElute QIAGEN לתוך הצינורות לפני הסרת מהגוש החום. זה חשוב כדי למנוע הלא ספציפית פריימר חישול ללכוד כתערובת מתקררת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את התגובה על עמודה ספין Qiagen MinElute, על פי הוראות היצרן. Elute ב EB 50 μl. </li></ol> 3) מוצר הרחבה לכידת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend פתרון המניות של M-270 חרוזים ידי vortexing. קח את 25 ההשעיה חרוז μl לדגימה. שטפו את החרוזים פעמיים עם 500ul 2x BW חיץ resuspend במאגר 2xBW 25 μl לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μl eluate משלב 2.3 להשעיית 25 חרוז μl משלב 3.1. מערבבים ולאחר מכן סובב עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר. מומלץ: לשמור הנותרים 5 ul של eluate מן הצעד 2.3 עבור כימות qPCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את התערובת כולה צינור 1.5ml טרי (זה עוזר להפחית שריד של יעד שאינם שברי ספריה). גלולה supernatant באמצעות אספן חלקיקים מגנטיים (MPC) וכן לבטל את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 5 פעמים עם חיץ 1xBW 500 μl (שוטף רבים לעזור להסיר את הרקע כמה שיותר). לאחר שלב הכביסה האחרונה, התפנית כלפי מטה בקצרה ולהסיר את שאריות supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500μl 1x חם לשטוף (HW) חיץ. Shake דקות 2 ב 65 ° C (או 5C מעל פריימר PEC TM) על בלוק תרמי. הסר את supernatant מהר אחרי זה, כדי למזער להתקרר. (שלב זה היא להסיר קטעים הקשורים ברקע עדיין עם primers PEC אך לא הוארכה למעשה על שלב במהלך ההארכה). הסר את שאריות supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה חרוז במאגר 30 EB μl. מעבירים את התערובת כולה צינור 1.5ml טרי (זה עוזר להפחית שריד של יעד שאינם שברי ספריה). לדגור על 95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות Cycler תרמית עבור elution. המקום של MPC ולהסיר את supernatant, מקפיד להשאיר את החרוזים מאחור. </li></ol> 4) לכידת הגברה מוצר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת מאסטר PCR עבור מספר דגימות הנדרש. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> μl לכל תגובה </td></tr><tr><td> מים </td><td> 45 </td></tr><tr><td> 10X ג&#39;ין Amp PCR חיץ II </td><td> 10 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25mm) </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ארגון ה-BSA (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> dNTPs (25 מ&quot;מ כל אחד) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 454 emPCR FWD primer/10uM </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 454 emPCR primer/10uM RVs </td><td> 3 </td></tr><tr><td> AmpliTaq זהב פולימראז ה-DNA (5 U / μl) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ללכוד eluted המוצר </td><td> 25 </td></tr><tr><td> סך הכל </td><td> 100 </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנית הבאה PCR ב Cycler Thermo עבור הגברה 14 מחזורים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 95 ° C 12min </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 95 ° C ה -30 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 60 ° C (או זמני חישול הרצוי) 1 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 72 ° C 1 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור 2 (x 13) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 72 ° C 5min </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ° C ∞ </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את התגובה על טור MinElute Qiagen ספין סיליקה על פי הוראות היצרן. Elute במאגר 50 EB μl. המוצר יכול לשמש גם עכשיו לסיבוב השני של ללכוד, החל שלב 2.1, או נכנס ישירות לתוך 454 תחליב PCR פרוטוקול, עבור סידור. </li></ol> נציג תוצאות: מומלץ מאוד כאשר מתחיל עם פרוטוקול PEC לבצע התגובה הראשונה ללכוד בו כמות קטנה של &quot;רצף מטרה חיובית שליטה&quot; (לדוגמה ~ 100bp מוצר PCR - 1 picogram די בקלות) מעורבב עם הרגיל מומלץ כמות מוגברת 454 תבנית הספרייה (ראה שלב 2.1), ו ללכוד מתבצע עם פריימר PEC אחת שנועדה ללכוד את המוצר בקרה חיובית. אם זו התגובה השליטה מתבצעת, qPCR עם שני חיובית שליטה ספציפיים ספציפי מתאם 454 זוגות פריימר ניתן לכמת את כמות &quot;המטרה לשלוט&quot; לעומת רקע התגובה מטוהרים פריימר הארכה (1.3), הרחבה המוצר פריימר (2.3 ) וללכוד eluted מוצר חרוז (3.6). בדרך זו, הן האפקטיביות של הסרת רקע (&quot;סגוליות&quot;) וכן את היעילות של התאוששות היעד (&quot;רגישות&quot;) בתנאי הניסוי שלך ניתן למדוד ישירות. מוצלח PEC פרוטוקול בדרך כלל יש את המאפיינים הבאים - רגישות (נמדד על ידי כמות היעד השליטה נשמרת באמצעות פרוטוקול): סך מטרה לשלוט במוצר eluted ללכוד חרוז (3.6) = ~ 10-20% מהסכום הכולל מטוהרים הארכת תחל תגובה (2.3). רקע (נמדד על ידי זוג 454 תחל emPCR): סך רקע במוצר eluted ללכוד חרוז (3.6) &lt;0.01% מהסכום הכולל בתגובה מטוהרים פריימר הארכה (2.3). אם יש פחות מ -1% של יעד שנותרו המוצר הסופי, הצעד הרחבה פריימר יכול להיות מוצלח וצריכים להיחקר. אם יש הרבה יותר מאשר 0.01% על רקע שנותרו המוצרים הסופיים, צעדים הכביסה יכול להיות מבוצע בצורה לא נכונה ויש לחקור.

<ol><li>Briggs, A. W., Good, J. M., Green, R. E., Krause, J., Maricic, T., Stenzel, U., Lalueza-Fox, C., Rudan, P., Brajkovic, D., Kucan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+retrieval+and+analysis+of+five+Neandertal+mtDNA+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted retrieval and analysis of five Neandertal mtDNA genomes.</a> Science. 325 (5938), 318-321 (2009).</li>
<li>Rohland, N., Hofreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+optimization+of+ancient+DNA+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Comparison and optimization of ancient DNA extraction.</a> Biotechniques. 42 (3), 343-352 (2007).</li>
<li>Rohland, N., Hofreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+DNA+extraction+from+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ancient DNA extraction from bones and teeth.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1756-1762 (2007).</li>
<li>Maricic, T., Pääbo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+454+sequencing+library+preparation+from+small+amounts+of+DNA+permits+sequence+determination+of+both+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Optimization of 454 sequencing library preparation from small amounts of DNA permits sequence determination of both DNA strands.</a> Biotechniques. 46 (1), 51-57 (2009).</li>
<li>Meyer, M., AW, B. riggs, Maricic, T., Hober, B., Hoffner, B., Krause, J., Weihmann, A., Paabo, S., Hofreiter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+micrograms+to+picograms%3A+quantitative+PCR+reduces+the+material+demands+of+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">From micrograms to picograms: quantitative PCR reduces the material demands of high-throughput sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 36 (1), e5-e5 (2007).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים לגילוי.

השיטה PEC היא פשוטה, מהירה, רגיש וספציפי. לכן אנו חוזים כותבי יישומים מרובים מחוץ DNA עתיק, כמו לכידת קטן שברי RNA מספריית RNA, חקירה של וריאציה מבניים מדגם ונקווה או לכידתו של 16S (לוקוסים או אחרים) גיוון ממדגם metagenomic. נקודה אחת להזכיר כי הרגישות של ללכוד הופך להיות נמוך יותר ככל שמספר PEC primers ב ללכוד מגדילה זמנית התגובה. PEC ולכן הוא לא אידיאלי עבור לכידת האזורים ללכוד גדול מאוד (למשל megabase או יותר), אך הוא מתאים מאוד גם עבור לכידת האזורים היעד קטן או אפילו עמדות SNP מאנשים רבים באופן מהיר.

<table><tbody><tr><td>פולימראז AmpliTaq Gold עם GeneAmp PCR buffer II ו-MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8080241</td><td></td></tr><tr><td>ערכה לניקוי PCR מסוג QIAGEN MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>خرזי סטראפטיבידין M-270</td><td>Invitrogen</td><td>653.05</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>מפריד חלקיקים מגנטי DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>120.02D</td><td></td></tr></tbody></table>

הארכת לכידת פריימר: אחזור רצף ממוקד ממקורות dna מושפל בכבדות

Primer Extension Capture: Targeted Sequence Retrieval from Heavily Degraded DNA Sources

אנו מציגים שיטה אחזור ממוקד רצף ה-DNA ממקורות DNA אשר מפורקים בכבדות מזוהמים עם ה-DNA של חיידקים, כמו אופייני עצמות עתיקות. השיטה מקטינה באופן משמעותי הרס מדגם ודרישות רצף ביחס ישיר PCR או רצף גישות רובה ציד. השתמשנו בשיטה זו כדי לשחזר את ה-DNA המיטוכונדרי מלא (mtDNA) הגנום של חמישה הניאנדרטלים מכל רחבי טווח הגיאוגרפי שלהם. המגוון הגנטי של mtDNA הניאנדרטלים המנוח היה כ שלוש פעמים נמוכה מזו של האדם המודרני העכשווי. יחד עם ניתוח של התפתחות חלבון mtDNA, נתונים אלה מראים כי גודל האוכלוסייה לטווח ארוך יעיל של הניאנדרטלים היה קטן יותר מזה של האדם המודרני ואת קופי הקיימים.

אנו מציגים שיטה ממוקדת אחזור רצף ה-DNA העתיק, שבו השתמשנו לשחזר את הגנום המיטוכונדריאלי המלא של חמישה אנשים Neandertal. השוואה בין הרצפים עם בני האדם של ימינו מציע כי הניאנדרטלים היה ארוך טווח אפקטיבי נמוך גודל האוכלוסייה.

הארכת לכידת פריימר: אחזור רצף ממוקד ממקורות DNA מושפל בכבדות

אנו מציגים שיטה לשליפה ממוקדת של רצפי DNA ממקורות DNA שסבלו מפירוק משמעותי ומהזיהום ב-DNA מיקרוביאלי, כפי שמאפיין...

סרטון זה מסביר את טכניקת לכידה על ידי הארכת פריימר (primer extension capture או PECA), המאפשרת שליפה ממוקדת של רצפי DNA ממקורות DNA המאופיינים במספר עותקים נמוך ביותר ובפרגמנטציה גבוהה. השתמשנו בטכניקה זו כדי לרצף גנומים מיטוכונדריאליים מלאים מעצמות של נאנדרטלים בני למעלה מ-40,000 שנה, וניתן להשתמש בשיטה זו ללכידה של כל אזור מטרה קטן או פולימורפיזם של נוקלאיד בודד (single nucleotide polymorphisms) ממספר רב של פרטים. השלבים העיקריים בהליך זה הם הגברה באמצעות PCR של ספריית DNA ראשונית, כימות של הספרייה המוגברת באמצעות quantitative PCR, הארכה ראשונית של המטרה על הספרייה המוגברת, לכידה של תוצרי ההארכה הראשונית באמצעות חרו지를 להסרת פרגמנטים שאינם המטרה, ואלוציה וריצוף של המטרות שנלכדו ונשטפו.שלום, אני אדריאן בריגס ממעבדתו של שאנטי פייבל במחלקה לגנטיקה במכון מקס פלאנק לאנתרופולוגיה אבולוציונית בלייפציג. היום נראה לכם הליך לבידוד רצפי DNA ספציפיים מתוך מקור DNA מורכב ומנוון מאוד, כגון עצמות עתיקות. השתמשנו בהליך זה כדי לחקור את הגיוון הגנטי המיטוכונדריאלי של Homo neanderthalensis, או האדם הנאנדרטלי.נתחיל בתהליך. ה-DNA המשמש בניסוי שלנו מגיע מעצמות ניאנדרטליות שגילן נע בין 40,000 ל-70,000 שנה, אשר נמצאו באתרים שונים בטווח הגיאוגרפי של הניאנדרטלים. תחילה, חושפים את העצם למשך לילה אחד לאור UV כדי לנטרל DNA זר מפני השטח.נעזרים במקדח עדין כדי להפיק בין 100 ל-500 מיליגרם של אבקת עצם. ה-DNA מופק מאבקת העצם באמצעות פרוצדורה המתוארת במאמר משנת 2007 בשם comparison and optimization of ancient DNA extraction מאת Nadine Rockland ו-Michael Hof. לאחר מכן, תמצית ה-DNA מומרת לספריית ריצוף על ידי הוספת אתרי פרימרים של אדפטורים אוניברסליים לקצוות של כל מקטעי ה-DNA, מכיוון שספריית 4 5 4 המופקת מעצם של ניאנדרטל מכילה כמויות מזעריות בלבד של DNA, לעיתים רק כמה פיקוגרמים. ספריית DNA ראשונית זו מוגברת תחילה באמצעות PCR, תוך שימוש בפרימרים ל-emulsion PCR התואמים לפרימרים של הספרייה האוניברסלית.להכנת תערובת ה-PCR להגברת הספריה, ערבבו את הרכיבים הבאים באنبוב PCR: השתמשו ב-10 µL של 10 X GAMP PCR buffer, ב-2 µL של magnesium chloride, ב-2 µL של BSA, ב-1 µL של DNTP mix, ב-3 µL מכל אחד מהפריימרים 4 54 MPCR forward ו-reverse, ב-1 µL של amply gold DNA polymerase וב-25 µL של library template. לבסוף, הוסיפו 45 µL של PCR grade water כדי להגיע לנפח סופי של 100 µL. amply Tech gold DNA polymerase יציב בטמפרטורת החדר, ולכן אין צורך לעבוד על קרח.לאחר הכנת תגובת ה-PCR, מקם את מבחורת ה-PCR בטרמוסייקלר (thermocycler) החל משלב דנטורציה של 95 °C למשך 12 דקות, ולאחריו 14 מחזורים של 95 °C למשך 30 שניות, 60 °C למשך דקה אחת ו-72 °C למשך דקה אחת. בסיום 14 מחזורים אלו, הגדר שלב סופי של 72 °C למשך חמש דקות, ולאחר מכן ניתן להחזיק את מבחורת ה-PCR ללא הגבלת זמן בטמפרטורה של 10 °C עד למועד השימוש לאחר השלמת הגברת ה-PCR. לאחר מכן, בצע טהרה של תוצר ה-PCR באמצעות עמודת ספין מסוג Kyogen MinLu לפי הוראות היצרן, ואלוט (elute) את ה-DNA מהעמודה עם 50 µL של EB buffer המסופק עם ערכת ה-MinLu לפני ההארכה הראשונית ולכידת התוצר.יש לבצע qPCR על מנות (aliquots) של הספריות לפני השכפול ואחריו, כדי לכמת ולבדוק את איכותו של תוצר הספרייה המשוכפל. הספרייה המשוכפלת לאחר 14 מחזורים צריכה להכיל כמות DNA הגדולה פי כמה אלפים מזו של הספרייה הראשונית. אם הדבר לא קורה, יש לבדוק את תנאי השכפול ולבצעם מחדש.יש לתכנן את פריימרי הלכידה להארכה ראשונית (Primary extension capture primers), אשר ישמשו ללכידת הרצפים הרצויים מהספריה המוגברת, בדומה לפריימרים רגילים ל-PCR כך שיתאימו לאזור מטרה רצוי עם טמפרטורת התכה אידיאלית של 60 °C לקצה ה-5' של כל אחד מהרצפים הללו, כולל רצף זנב של 12 בסיסים, ולהוסיף שארית ביוטין בקצה ה-5'. ניתן להשתמש בעד 150 פריימרי PEC יחד בתערובת multiplex אחת המוכנה מתמיסות מלאי של 200 µM. עבור תגובת ההארכה הראשונית, הכינו תערובת PCR בתוך מבחנת PCR מתאימה על ידי הוספה של 5 µL של GAMP PCR buffer בריכוז 10X, 5 µL של magnesium chloride, 1 µL של BSA ו-0.5 µL של DNTP. ערבבו 5 µL מתערובת פריימרי הלכידה להארכה ראשונית, 0.5 µL של tack gold DNA polymerase, 2 µL של DNA מהספריה שהוגברה ב-14 מחזורים, ולבסוף 31 µL של מים בדרגת PCR כדי להגיע לנפח סופי של 50 µL.אם תבנית הספריה המוגברת מכילה יותר מ-10¹² עותקים למיקרוליטר, יש לדלל תחילה את התבנית עם EB buffer כך שלא יתווספו לתערובת התגובה יותר מ-2*10¹² עותקים. לאחר הכנת מבחנת ה-PCR, מקמו אותה בטרמוסייקלר והגדירו הרצה של תגובה אחת. התחילו בדנטורציה של 12 דקות ב-95 °C, לאחר מכן 60 °C למשך דקה אחת, וחמש דקות ב-72 °C לצורך הארכה ראשונית.וכאשר המחזור הבודד מסתיים, יש להחזיק את תוצר ה-PCR בטמפרטורה של 72 מעלות צלזיוס עד לשלב הבא. כדי למנוע היסתמכות (annealing) לא ספציפית של הפריימרים, פפיט 150 µL של PBI או של בופר PB מתוך ערכת הניקוי של Kyogen אל תוך מבחנות תגובת ה-PCR, בעוד תערובת התגובה נשארת במכשיר הטרמוציקלר בטמפרטורה של 72 מעלות צלזיוס. פעולה זו מנטרלת את הפולימראז, בעוד שהטמפרטורה גבוהה מדי עבור הארכה לא ספציפית של הפריימרים של המטרה; סגור את המבחנות, בצע וורטקס קצר ולאחר מכן סובב את הנוזל למטה באמצעות צנטריפוגת שולחנית.השתמשו בבופר PBI או PB בלבד בשלב זה, שכן בופרי קישור אחרים, כגון בופר Qiagen PM, עלולים להפריע לתהליך הלכידה הבא. לאחר מכן, הוציאו את התערובת משפחורת ה-PCR והעבירו אותה לעמודת ספין Rogen MinLu לטיהור בהתאם להוראות היצרן, כפי שבוצע בעבר; השריו את ה-DNA מהעמודה באמצעות 30 microliters של בופר EB המסופק עם ערכת MinLu. על מנת להסיר את כל הפרגמנטים שלא נצמדו לפרימרי PEC, מבוצע שלב לכידה מבוסס חרוצים.ראשית, השהה מחדש תמיסת מלאי של חרוזי M 270 strip על ידי ערבול ב-vortex, והוצא כמות חרוזים השקולה ל-25 µL לדגימה. שטוף את החרוזים פעמיים עם 500 µL של באפר BW בריכוז 2x, והשהה אותם מחדש בנפח של באפר 2x BW השווה לנפח החרוזים שהוצאו בתחילה. הכן 25 µL מהתגסוס.עבור כל דגימה, הוסף 25 microliters של ה-DNA המזוהה והמטוהר ל-25 microliters של תרחיף החרוצים, ושמור את חמשת המיקרוליטרים הנותרים לצורך כימות מאוחר יותר. ערבב את ה-DNA ותרחיף החרוצים על ידי שאיבה והזרקה חוזרת (pipetting) וערבוב באמצעות קצה ה-perpet, ולאחר מכן סובב באיטיות ברוטטור שולחני למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הערבוב, העבר את התוכן לפ menutupת PCR נקייה בנפח 1.5 milliliter.במהלך שלב הדגירה והסיבוב הקודם, ייתכן שחלק מה-DNA שאינו מטרה נדבק לדופן המבחנה. לכן, העברת תרחיף החרו지를 למבחנה חדשה מונעת את האפשרות ש-DNA זה ישתחרר אל המוצרים הסופיים. במהלך שלב האלוציה בחום, השתמש באספן החלקיקים המגנטי כדי לרכז את החרוזים; לאחר 10 עד 20 שניות, כל החרוזים ינדנדו אל הדופן, ויותיר נוזל עלה (supernatant) צלול שיש להסิרו כדי לשטוף את החרוזים. הוסף 500 µL של באפר BW בריכוז 1x למבחנה ובצע ערבוב ב-vortex למשך כשלוש שניות במהירות נמוכה.פעם אחת כשהמבחנה זקופה ופעם נוספת כשהמבחנה הפוכה, לא אמורים להישאר חרוזיים הדבקים לדופן המבחנה. באמצעות צנטריפוגה שולחנית, סובבו את התמיה למשך אחת עד שלוש שניות, זמן הבדיקה המינימלי הדרוש כדי למשוך את כל הנוזל מדפנות המבחנה. החזירו את המבחנה ל-MPC והמתינו 10 עד 20 שניות עד שכל החרוזיים יאספו בצד המבחנה.לאחר מכן, הסר את supernatant. השטיפה הראשונה כעת הושלמה. חזור על הליך זה ארבע פעמים נוספות, לאחר שטיפה אחת נוספת ב-BW והסרת supernatant.הוסיפו 500 µL של תמיסת שטיפה חמה בריכוז 1X. ערבבו את התמיה באמצעות וורטקס קצר וסבוב במצנטריפוגה (spin down) כפי שנעשה קודם לכן, ולאחר מכן נערו את המבחנה במשך שתי דקות בטמפרטורה של 65 °C במערכת ערבוב עם בלוק תרמי במהירות של 1000 RPM. לאחר מכן, בצעו סבוב קצר במצנטריפוגה להסרת שאריות של העלייה (supernatant) בתוך דקה מהוצאה מהבלוק התרמי. שלב זה יסיר פרגמנטים שעשויים להיקשר לפרימרים של PEC, אך לא הוארכו בשלב הארכת הפרימרים. השביחו מחדש את המשקע (pellet) ב-30 µL של תמיסת EB והעבירו את התערובת למבחנה נקייה של 1.5 mL עבור PCR.דגרו את המבחנה במכשיר ה-thermal cycler בטמפרטורה של 95 °C למשך שלוש דקות. השקיעו את החרוזיים באמצעות אספן חלקיקים מגנטי. ייקח בין 10 ל-20 שניות עד שהנוזל העליון (supernatant) יתבהר לחלוטין; העבירו את ה-S supernatant למבחנה חדשה ומסומנת.יש להקפיד לא להעביר חרו지를 כלשהו. שמרו על הנוזל העליון (supernatant), המכיל את תוצר מקטעי ה-DNA שנלכדו. ניתן להשליך את החרוזים בשלב זה.כדי להגביר את המוצר שנלכד, הכינו תערובת PCR לנפח כולל של 100 microliters כפי שבוצע בחלק השני, ובצעו את אותם תנאי מחזור PCR. שוב, לאחר השלמת הגברת ה-PCR של המוצר שנלכד, בצעו טיהור באמצעות עמודת ספין Qiagen Ute כפי שבוצע קודם לכן בסעיף שני; השחילו את ה-DNA מהעמודה עם 50 microliters של Eeb Buffer, וכעת המוצר מוכן לריצוף בספיקת גבוהה. תכננו 574 פריימרים מסוג PEC כדי לכסות באופן רציף (tile) את כל הגנום המיטוכונדריאלי של הנאנדרטלים.פיצלנו אותם לארבע תערובות מולטיפלקס ושני סבבים סדרתיים של לכידה באמצעות הארכה ראשונית (primary extension capture) על ספריות מחמש מאובני ניאנדרטל מארבעה אתרים ברחבי אירואסיה, המתוארכים לבין 40,000 ל-70,000 שנים, תוך יצירת בין 170,000 ל-500,000 רצפים לכל פרט והלימה של התוצאות לרצף ייחוס מיטוכונדריאלי. מצאנו כי הליך ה-PEC העשיר באופן מאסיבי את ה-DNA המיטוכונדריאלי, והשיג כיסוי מלא של ה-DNA המיטוכונדריאלי עבור כל פרט בכיסוי ממוצע של בין 18 ל-56.3 פעמים. באמצעות תוצאות אלו, יכולנו להפיק רצף גנומי מיטוכונדריאלי מלא ואיכותי עבור כל פרט.לאחר מכן ביצענו השוואה פילוגנטית של רצפים אלה עם מדגם עולמי של בני אדם בימינו ועם קרובינו החיים הקרובים ביותר, השימפנזה והבונובו. הדבר אישש ממצאים קודמים לפיהם ה-DNA המיטוכונדריאלי של הנאנדרטלים קשור קשר הדוק, אך נבדל בבירור מזה של בני אדם מודרניים. יתרה מכך, השוואה בין הרצפים של הנאנדרטלים עצמם חשפה גיוון גנטי נמוך ביותר בקרב הנאנדרטלים, נמוך יותר מאשר בקרב בני אדם ברחבי העולם כיום, ודומה לאוכלוסיות אירופאיות בימינו.ראיות אלו, בשילוב עם ניתוח של אבולוציית חלבונים ברצפי הנאנדרטלים, מרמזות כי לנאנדרטלים היה גודל אוכלוסייה נמוך לאורך זמן, דבר העולה בקנה אחד עם ראיות ארכאולוגיות המצביעות על כך שצפיפות האוכלוסייה של הנאנדרטלים מעולם לא הגיעה לרמות שהשיגו בני האדם המודרניים. כעת הצגנו בפניכם כיצד לבצע לכידת הרחבה של פרימטים (primate extension capture) כדי להגביר וללכוד רצפים מטרתיים כהכנה לרצף בעוצמה גבוהה (high throughput sequencing). בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להקפיד על כל מפרטי הטמפרטורה בטרמוסייקלר, אך שימו לב כי לפריימרים יכולות להיות טמפרטורות היברידיזציה (annealing temperatures) שונות, ולכן ייתכן שיהיה עליכם להתאים את טמפרטורת ההיברידיזציה לפריימרים הספציפיים שלכם, ולהקפיד במהלך כל שלבי השטיפה להסיר כמה שיותר נוזלים.תודה שצפיתם, ובהצלחה בניסויים שלכם.

primer-extension-capture-targeted-sequence-retrieval-from-heavily

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

העשרת gDNA לריצוף NGS היא כלי קל ורב עוצמה לחקר מוטציות חוקתיות. במאמר זה, אנו מציגים את ההליך לניתוח פשוט של הרצף המלא של 11 גנים המעורבים בתיקון נזק ל-DNA.

gDNA העשרה על ידי טכנולוגיה מבוססת Transposase לניתוח NGS של הרצף השלם של BRCA1, BRCA2, ו -9 גנים המעורבים בתיקון נזק לדנ"א

אנו מתארים פרוטוקול להגברת אתרי אינטגרציה רטרו-ויראלית מה-DNA הגנומי של תאים נגועים, ריצוף הצמתים המוגברים של הווירוס-מארח ולאחר מכן מיפוי רצפים אלה לגנום ייחוס. אנו מתארים גם טכניקות לכימות התפלגות אתרי האינטגרציה ביחס להערות גנומיות שונות באמצעות BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקור מתילציה DNA בגנום רחב במחקרים לסקירת חולים קליניים בקנה מידה גדול באמצעות רצף לכידת DNA מתיל-Binding (MBDCap-seq או MBD-seq) טכנולוגיה בצנרת ניתוח ביואינפורמטיקה שלאחר מכן.

רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות

אנו מתארים שיטה לשילוב cytometry זרימה ורצף תפוקה גבוהה כדי לזהות אזורים שכפול מאוחר של הגנום.

G2-seq: תפוקה גבוהה המבוססת על רצף טכניקה לזיהוי מאוחר לבצע שיכפול אזורים בגנום

כתב יד זה מתאר שיטה לזיהוי מוטציות בתדר נמוך ב- ctDNA, אר-תת סעיף. בשיטה זו הוא הבדיל על ידי השימוש הייחודי של תיקון שגיאות דו כיווני, רקע מיוחד המסנן, וכן הקניית מולקולרית יעיל.

זיהוי של מוטציות נדירות CtDNA באמצעות רצף הדור הבא

הדור הבא רצפי (הגדרות) הוא כלי רב עוצמה עבור אפיון גנומית זה מוגבל על ידי שיעור שגיאה גבוהה של פלטפורמת (~0.5–2.0%). אנו מתארים את השיטות שלנו של רצף שגיאות המאפשרים לנו במחלקותיכם שיעור שגיאה המיתרים, לזהות מוטציות ב- variant אלל שברים כמו שנדיר למצוא 0.0001.

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

הזיהוי של האינטראקציות פיזי בין גנים לבין אלמנטים התקינה הוא מאתגר אבל כבר בהנחייתם של כרומוזום קונפורמציה ללכידת שיטות. שינוי זה בפרוטוקול 4C-seq מפחית את הסיכון של ה-PCR הטיה על-ידי צמצום יתר הגברה של תבניות ה-PCR ומגדיל את mappability את הקריאות על-ידי שילוב צעד תקציר של אנזים הגבלה תוספת.

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

שיטה זו מתארת את השלבים כדי לשפר את האיכות והכמות של נתוני הרצף שניתן להשיג באמצעות דגימות RNA מוטבעות (FFPE) קבועות של שעווה מוטבעת של formalin. אנו מתארים את המתודולוגיה להעריך יותר במדויק את האיכות של הדגימות FFPE-RNA, להכין ספריות ברצף, ולנתח את הנתונים מ FFPE-RNA דגימות.

אופטימיזציה לרצף וניתוח של הירידה FFPE-בדיקות RNA

Hi-C 3.0 הוא פרוטוקול Hi-C משופר המשלב פורמלדהיד ודיסוקינימידיל גלוטראט קרוסלינקרים עם קוקטייל של אנזימי הגבלה DpnII ו- DdeI כדי להגדיל את יחס האות לרעש ואת הרזולוציה של זיהוי אינטראקציית כרומטין.

לכידת קונפורמציה של כרומוזומים על פני סולמות אורך

הפרוטוקול מספק הוראות לשינוי RNA עם דימתיל סולפט לניסויים בפרופיל מוטציות. הוא כולל בדיקה במבחנה ו - in vivo עם שתי שיטות הכנה חלופיות לספרייה.

בדיקת מבנה RNA עם פרופיל מוטציה של דימתיל סולפט עם ריצוף במבחנה ובתאים

מחסום משמעותי לטכנולוגיות כמו CRISPR הוא אירועים מחוץ למטרה שיכולים לשבש גנים חיוניים. 'סירקולריזציה לדיווח במבחנה על השפעות מחשוף על ידי ריצוף' (CIRCLE-seq) היא טכניקה שנועדה לזהות אתרי מחשוף לא מכוונים. שיטה זו ממפה את הפעילות הכלל-גנומית של CRISPR-Cas9 ברגישות גבוהה וללא משוא פנים.

CIRCLE-Seq לחקירת עריכת גנים מחוץ למטרה

למדו את שיטת לכידת פריימר להארכה (PECA) לאחזור רצפי DNA עתיקים ממקורות מושפלים בכבדות. השיטה שימשה לשחזור גנומי מיטוכונדריה שלמה מחמש ניאנדרטלים ולחקר גיוון גנטי אבולוציוני.

הארכת לכידת פריימר: אחזור רצף ממוקד ממקורות DNA מושפל בכבדות

גלה סרטונים נוספים