הארכת לכידת פריימר: אחזור רצף ממוקד ממקורות DNA מושפל בכבדות

סרטון זה מסביר את טכניקת לכידה על ידי הארכת פריימר (primer extension capture או PECA), המאפשרת שליפה ממוקדת של רצפי DNA ממקורות DNA המאופיינים במספר עותקים נמוך ביותר ובפרגמנטציה גבוהה. השתמשנו בטכניקה זו כדי לרצף גנומים מיטוכונדריאליים מלאים מעצמות של נאנדרטלים בני למעלה מ-40,000 שנה, וניתן להשתמש בשיטה זו ללכידה של כל אזור מטרה קטן או פולימורפיזם של נוקלאיד בודד (single nucleotide polymorphisms) ממספר רב של פרטים. השלבים העיקריים בהליך זה הם הגברה באמצעות PCR של ספריית DNA ראשונית, כימות של הספרייה המוגברת באמצעות quantitative PCR, הארכה ראשונית של המטרה על הספרייה המוגברת, לכידה של תוצרי ההארכה הראשונית באמצעות חרו지를 להסרת פרגמנטים שאינם המטרה, ואלוציה וריצוף של המטרות שנלכדו ונשטפו.

שלום, אני אדריאן בריגס ממעבדתו של שאנטי פייבל במחלקה לגנטיקה במכון מקס פלאנק לאנתרופולוגיה אבולוציונית בלייפציג. היום נראה לכם הליך לבידוד רצפי DNA ספציפיים מתוך מקור DNA מורכב ומנוון מאוד, כגון עצמות עתיקות. השתמשנו בהליך זה כדי לחקור את הגיוון הגנטי המיטוכונדריאלי של Homo neanderthalensis, או האדם הנאנדרטלי.

נתחיל בתהליך. ה-DNA המשמש בניסוי שלנו מגיע מעצמות ניאנדרטליות שגילן נע בין 40,000 ל-70,000 שנה, אשר נמצאו באתרים שונים בטווח הגיאוגרפי של הניאנדרטלים. תחילה, חושפים את העצם למשך לילה אחד לאור UV כדי לנטרל DNA זר מפני השטח.

נעזרים במקדח עדין כדי להפיק בין 100 ל-500 מיליגרם של אבקת עצם. ה-DNA מופק מאבקת העצם באמצעות פרוצדורה המתוארת במאמר משנת 2007 בשם comparison and optimization of ancient DNA extraction מאת Nadine Rockland ו-Michael Hof. לאחר מכן, תמצית ה-DNA מומרת לספריית ריצוף על ידי הוספת אתרי פרימרים של אדפטורים אוניברסליים לקצוות של כל מקטעי ה-DNA, מכיוון שספריית 4 5 4 המופקת מעצם של ניאנדרטל מכילה כמויות מזעריות בלבד של DNA, לעיתים רק כמה פיקוגרמים. ספריית DNA ראשונית זו מוגברת תחילה באמצעות PCR, תוך שימוש בפרימרים ל-emulsion PCR התואמים לפרימרים של הספרייה האוניברסלית.

להכנת תערובת ה-PCR להגברת הספריה, ערבבו את הרכיבים הבאים באنبוב PCR: השתמשו ב-10 µL של 10 X GAMP PCR buffer, ב-2 µL של magnesium chloride, ב-2 µL של BSA, ב-1 µL של DNTP mix, ב-3 µL מכל אחד מהפריימרים 4 54 MPCR forward ו-reverse, ב-1 µL של amply gold DNA polymerase וב-25 µL של library template. לבסוף, הוסיפו 45 µL של PCR grade water כדי להגיע לנפח סופי של 100 µL. amply Tech gold DNA polymerase יציב בטמפרטורת החדר, ולכן אין צורך לעבוד על קרח.

לאחר הכנת תגובת ה-PCR, מקם את מבחורת ה-PCR בטרמוסייקלר (thermocycler) החל משלב דנטורציה של 95 °C למשך 12 דקות, ולאחריו 14 מחזורים של 95 °C למשך 30 שניות, 60 °C למשך דקה אחת ו-72 °C למשך דקה אחת. בסיום 14 מחזורים אלו, הגדר שלב סופי של 72 °C למשך חמש דקות, ולאחר מכן ניתן להחזיק את מבחורת ה-PCR ללא הגבלת זמן בטמפרטורה של 10 °C עד למועד השימוש לאחר השלמת הגברת ה-PCR. לאחר מכן, בצע טהרה של תוצר ה-PCR באמצעות עמודת ספין מסוג Kyogen MinLu לפי הוראות היצרן, ואלוט (elute) את ה-DNA מהעמודה עם 50 µL של EB buffer המסופק עם ערכת ה-MinLu לפני ההארכה הראשונית ולכידת התוצר.

יש לבצע qPCR על מנות (aliquots) של הספריות לפני השכפול ואחריו, כדי לכמת ולבדוק את איכותו של תוצר הספרייה המשוכפל. הספרייה המשוכפלת לאחר 14 מחזורים צריכה להכיל כמות DNA הגדולה פי כמה אלפים מזו של הספרייה הראשונית. אם הדבר לא קורה, יש לבדוק את תנאי השכפול ולבצעם מחדש.

יש לתכנן את פריימרי הלכידה להארכה ראשונית (Primary extension capture primers), אשר ישמשו ללכידת הרצפים הרצויים מהספריה המוגברת, בדומה לפריימרים רגילים ל-PCR כך שיתאימו לאזור מטרה רצוי עם טמפרטורת התכה אידיאלית של 60 °C לקצה ה-5' של כל אחד מהרצפים הללו, כולל רצף זנב של 12 בסיסים, ולהוסיף שארית ביוטין בקצה ה-5'. ניתן להשתמש בעד 150 פריימרי PEC יחד בתערובת multiplex אחת המוכנה מתמיסות מלאי של 200 µM. עבור תגובת ההארכה הראשונית, הכינו תערובת PCR בתוך מבחנת PCR מתאימה על ידי הוספה של 5 µL של GAMP PCR buffer בריכוז 10X, 5 µL של magnesium chloride, 1 µL של BSA ו-0.5 µL של DNTP. ערבבו 5 µL מתערובת פריימרי הלכידה להארכה ראשונית, 0.5 µL של tack gold DNA polymerase, 2 µL של DNA מהספריה שהוגברה ב-14 מחזורים, ולבסוף 31 µL של מים בדרגת PCR כדי להגיע לנפח סופי של 50 µL.

אם תבנית הספריה המוגברת מכילה יותר מ-10¹² עותקים למיקרוליטר, יש לדלל תחילה את התבנית עם EB buffer כך שלא יתווספו לתערובת התגובה יותר מ-2*10¹² עותקים. לאחר הכנת מבחנת ה-PCR, מקמו אותה בטרמוסייקלר והגדירו הרצה של תגובה אחת. התחילו בדנטורציה של 12 דקות ב-95 °C, לאחר מכן 60 °C למשך דקה אחת, וחמש דקות ב-72 °C לצורך הארכה ראשונית.

וכאשר המחזור הבודד מסתיים, יש להחזיק את תוצר ה-PCR בטמפרטורה של 72 מעלות צלזיוס עד לשלב הבא. כדי למנוע היסתמכות (annealing) לא ספציפית של הפריימרים, פפיט 150 µL של PBI או של בופר PB מתוך ערכת הניקוי של Kyogen אל תוך מבחנות תגובת ה-PCR, בעוד תערובת התגובה נשארת במכשיר הטרמוציקלר בטמפרטורה של 72 מעלות צלזיוס. פעולה זו מנטרלת את הפולימראז, בעוד שהטמפרטורה גבוהה מדי עבור הארכה לא ספציפית של הפריימרים של המטרה; סגור את המבחנות, בצע וורטקס קצר ולאחר מכן סובב את הנוזל למטה באמצעות צנטריפוגת שולחנית.

השתמשו בבופר PBI או PB בלבד בשלב זה, שכן בופרי קישור אחרים, כגון בופר Qiagen PM, עלולים להפריע לתהליך הלכידה הבא. לאחר מכן, הוציאו את התערובת משפחורת ה-PCR והעבירו אותה לעמודת ספין Rogen MinLu לטיהור בהתאם להוראות היצרן, כפי שבוצע בעבר; השריו את ה-DNA מהעמודה באמצעות 30 microliters של בופר EB המסופק עם ערכת MinLu. על מנת להסיר את כל הפרגמנטים שלא נצמדו לפרימרי PEC, מבוצע שלב לכידה מבוסס חרוצים.

ראשית, השהה מחדש תמיסת מלאי של חרוזי M 270 strip על ידי ערבול ב-vortex, והוצא כמות חרוזים השקולה ל-25 µL לדגימה. שטוף את החרוזים פעמיים עם 500 µL של באפר BW בריכוז 2x, והשהה אותם מחדש בנפח של באפר 2x BW השווה לנפח החרוזים שהוצאו בתחילה. הכן 25 µL מהתגסוס.

עבור כל דגימה, הוסף 25 microliters של ה-DNA המזוהה והמטוהר ל-25 microliters של תרחיף החרוצים, ושמור את חמשת המיקרוליטרים הנותרים לצורך כימות מאוחר יותר. ערבב את ה-DNA ותרחיף החרוצים על ידי שאיבה והזרקה חוזרת (pipetting) וערבוב באמצעות קצה ה-perpet, ולאחר מכן סובב באיטיות ברוטטור שולחני למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הערבוב, העבר את התוכן לפ menutupת PCR נקייה בנפח 1.5 milliliter.

במהלך שלב הדגירה והסיבוב הקודם, ייתכן שחלק מה-DNA שאינו מטרה נדבק לדופן המבחנה. לכן, העברת תרחיף החרו지를 למבחנה חדשה מונעת את האפשרות ש-DNA זה ישתחרר אל המוצרים הסופיים. במהלך שלב האלוציה בחום, השתמש באספן החלקיקים המגנטי כדי לרכז את החרוזים; לאחר 10 עד 20 שניות, כל החרוזים ינדנדו אל הדופן, ויותיר נוזל עלה (supernatant) צלול שיש להסิרו כדי לשטוף את החרוזים. הוסף 500 µL של באפר BW בריכוז 1x למבחנה ובצע ערבוב ב-vortex למשך כשלוש שניות במהירות נמוכה.

פעם אחת כשהמבחנה זקופה ופעם נוספת כשהמבחנה הפוכה, לא אמורים להישאר חרוזיים הדבקים לדופן המבחנה. באמצעות צנטריפוגה שולחנית, סובבו את התמיה למשך אחת עד שלוש שניות, זמן הבדיקה המינימלי הדרוש כדי למשוך את כל הנוזל מדפנות המבחנה. החזירו את המבחנה ל-MPC והמתינו 10 עד 20 שניות עד שכל החרוזיים יאספו בצד המבחנה.

לאחר מכן, הסר את supernatant. השטיפה הראשונה כעת הושלמה. חזור על הליך זה ארבע פעמים נוספות, לאחר שטיפה אחת נוספת ב-BW והסרת supernatant.

הוסיפו 500 µL של תמיסת שטיפה חמה בריכוז 1X. ערבבו את התמיה באמצעות וורטקס קצר וסבוב במצנטריפוגה (spin down) כפי שנעשה קודם לכן, ולאחר מכן נערו את המבחנה במשך שתי דקות בטמפרטורה של 65 °C במערכת ערבוב עם בלוק תרמי במהירות של 1000 RPM. לאחר מכן, בצעו סבוב קצר במצנטריפוגה להסרת שאריות של העלייה (supernatant) בתוך דקה מהוצאה מהבלוק התרמי. שלב זה יסיר פרגמנטים שעשויים להיקשר לפרימרים של PEC, אך לא הוארכו בשלב הארכת הפרימרים. השביחו מחדש את המשקע (pellet) ב-30 µL של תמיסת EB והעבירו את התערובת למבחנה נקייה של 1.5 mL עבור PCR.

דגרו את המבחנה במכשיר ה-thermal cycler בטמפרטורה של 95 °C למשך שלוש דקות. השקיעו את החרוזיים באמצעות אספן חלקיקים מגנטי. ייקח בין 10 ל-20 שניות עד שהנוזל העליון (supernatant) יתבהר לחלוטין; העבירו את ה-S supernatant למבחנה חדשה ומסומנת.

יש להקפיד לא להעביר חרו지를 כלשהו. שמרו על הנוזל העליון (supernatant), המכיל את תוצר מקטעי ה-DNA שנלכדו. ניתן להשליך את החרוזים בשלב זה.

כדי להגביר את המוצר שנלכד, הכינו תערובת PCR לנפח כולל של 100 microliters כפי שבוצע בחלק השני, ובצעו את אותם תנאי מחזור PCR. שוב, לאחר השלמת הגברת ה-PCR של המוצר שנלכד, בצעו טיהור באמצעות עמודת ספין Qiagen Ute כפי שבוצע קודם לכן בסעיף שני; השחילו את ה-DNA מהעמודה עם 50 microliters של Eeb Buffer, וכעת המוצר מוכן לריצוף בספיקת גבוהה. תכננו 574 פריימרים מסוג PEC כדי לכסות באופן רציף (tile) את כל הגנום המיטוכונדריאלי של הנאנדרטלים.

פיצלנו אותם לארבע תערובות מולטיפלקס ושני סבבים סדרתיים של לכידה באמצעות הארכה ראשונית (primary extension capture) על ספריות מחמש מאובני ניאנדרטל מארבעה אתרים ברחבי אירואסיה, המתוארכים לבין 40,000 ל-70,000 שנים, תוך יצירת בין 170,000 ל-500,000 רצפים לכל פרט והלימה של התוצאות לרצף ייחוס מיטוכונדריאלי. מצאנו כי הליך ה-PEC העשיר באופן מאסיבי את ה-DNA המיטוכונדריאלי, והשיג כיסוי מלא של ה-DNA המיטוכונדריאלי עבור כל פרט בכיסוי ממוצע של בין 18 ל-56.3 פעמים. באמצעות תוצאות אלו, יכולנו להפיק רצף גנומי מיטוכונדריאלי מלא ואיכותי עבור כל פרט.

לאחר מכן ביצענו השוואה פילוגנטית של רצפים אלה עם מדגם עולמי של בני אדם בימינו ועם קרובינו החיים הקרובים ביותר, השימפנזה והבונובו. הדבר אישש ממצאים קודמים לפיהם ה-DNA המיטוכונדריאלי של הנאנדרטלים קשור קשר הדוק, אך נבדל בבירור מזה של בני אדם מודרניים. יתרה מכך, השוואה בין הרצפים של הנאנדרטלים עצמם חשפה גיוון גנטי נמוך ביותר בקרב הנאנדרטלים, נמוך יותר מאשר בקרב בני אדם ברחבי העולם כיום, ודומה לאוכלוסיות אירופאיות בימינו.

ראיות אלו, בשילוב עם ניתוח של אבולוציית חלבונים ברצפי הנאנדרטלים, מרמזות כי לנאנדרטלים היה גודל אוכלוסייה נמוך לאורך זמן, דבר העולה בקנה אחד עם ראיות ארכאולוגיות המצביעות על כך שצפיפות האוכלוסייה של הנאנדרטלים מעולם לא הגיעה לרמות שהשיגו בני האדם המודרניים. כעת הצגנו בפניכם כיצד לבצע לכידת הרחבה של פרימטים (primate extension capture) כדי להגביר וללכוד רצפים מטרתיים כהכנה לרצף בעוצמה גבוהה (high throughput sequencing). בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להקפיד על כל מפרטי הטמפרטורה בטרמוסייקלר, אך שימו לב כי לפריימרים יכולות להיות טמפרטורות היברידיזציה (annealing temperatures) שונות, ולכן ייתכן שיהיה עליכם להתאים את טמפרטורת ההיברידיזציה לפריימרים הספציפיים שלכם, ולהקפיד במהלך כל שלבי השטיפה להסיר כמה שיותר נוזלים.

תודה שצפיתם, ובהצלחה בניסויים שלכם.