הארכת לכידת פריימר: אחזור רצף ממוקד ממקורות DNA מושפל בכבדות

סרטון זה מסביר את טכניקת לכידה באמצעות הארכת פריימר (primer extension capture או PECA), המאפשרת שליפה ממוקדת של רצפי DNA ממקורות DNA מקוטעים מאוד בעלי מספר עותקים נמוך במיוחד. השתמשנו בטכניקה זו כדי לרצף גנומים מיטוכונדריאליים מלאים מעצמות של ניאנדרתאלים מלפני למעלה מ-40,000 שנה, וניתן להשתמש בשיטה זו ללכידה של כל אזור מטרה קטן או פולימורפיזם של נוקלאיד בודד (SNP) ממספר רב של פרטים. השלבים העיקריים בהליך זה הם הגברה באמצעות PCR של ספריית DNA ראשונית, כימות של הספרייה המוגברת באמצעות qPCR, הארכה ראשונית של המטרה על הספרייה המוגברת, לכידה של תוצרי ההארכה הראשונית באמצעות חרוצים כדי להסיר פרגמנטים שאינם המטרה, ולבסוף אלוציה וריצוף של המטרות שנלכדו ונשטפו.

שלום, אני אדריאן בריגס ממעבדתו של שנטי פייבלס במחלקה לגנטיקה במכון מקס פלאנק לאנתרופולוגיה אבולוציונית בלייפציג. היום נראה לכם פרוצדורה לבידוד רצפי DNA ספציפיים מתוך מקור DNA מורכב ומעובש מאוד, כגון עצמות עתיקות. השתמשנו בפרוצדורה זו כדי לחקור את הגיוון הגנטי המיטוכונדריאלי של Homo neanderthalensis, או האדם הניאנדרטלי.

נתחיל בתהליך. ה-DNA המשמש בניסוי שלנו מגיע מעצמות של ניאנדרטלים בני 40,000 עד 70,000 שנה, שנמצאו באתרים שונים לאורך התפוצה הגיאוגרפית של הניאנדרטלים. ראשית, חושפים את העצם למשך לילה לאור UV כדי לחטא את פני השטח מכל DNA זר.

מקדח עדין משמש להפקת בין 100 ל-500 מיליגרם של אבקת עצם. DNA מופק מאבקת העצם באמצעות הליך המתואר במאמר משנת 2007 "comparison and optimization of ancient DNA extraction" מאת Nadine Rockland ו-Michael Hof. תמצית ה-DNA מומרת לאחר מכן לספריית רצף על ידי הוספת אתרי פרימר של מתאמים אוניברסליים לקצות כל מקטעי ה-DNA, מכיוון שספריית 4 5 4 המופקת מעצם של ניאנדרטל מכילה כמויות זעירות בלבד של DNA, לעיתים רק מספר פיקוגרמים. ספריית DNA ראשונית זו מוגברת תחילה באמצעות PCR, תוך שימוש בפרימרים של emulsion PCR המתאימים לפרימרים של הספרייה האוניברסלית.

להכנת תערובת ה-PCR להגברה של הספריה, ערבבו את הרכיבים הבאים בתוך מבחורת PCR: השתמשו ב-10 µL של תמיסת GAMP PCR buffer בריכוז 10 X, ב-2 µL של magnesium chloride, ב-2 µL של BSA, ב-1 µL של תערובת dNTP, ב-3 µL מכל אחד מהפריימרים הקדמי והאחורי (forward and reverse) של 4 54 MPCR, ב-1 µL של amply gold DNA polymerase וב-25 µL של תבנית הספריה (library template). לבסוף, הוסיפו 45 µL של מים בדרגת PCR כדי להגיע לנפח סופי של 100 µL. האנזים amply Tech gold DNA polymerase יציב בטמפרטורת החדר, ולכן אין צורך לעבוד על קרח.

לאחר הכנת תגובת ה-PCR, מקם את מבחורת ה-PCR בתרמוסייקלר, החל בשלב דנטורציה של 95 °C למשך 12 דקות, ולאחריו 14 מחזורים של 95 °C למשך 30 שניות, 60 °C למשך דקה אחת ו-72 °C למשך דקה אחת. בסיום 14 מחזורים אלו, הגדר שלב סופי של 72 °C למשך חמש דקות, ולאחר מכן ניתן להשריות את מבחורת ה-PCR באופן בלתי מוגבל בטמפרטורה של 10 °C עד למועד השימוש לאחר השלמת הגברת ה-PCR. לאחר מכן, בצע טיהור של תוצר ה-PCR באמצעות עמודת ספין Kyogen MinLu לפי הוראות היצרן, ואשב את ה-DNA מהעמודה באמצעות 50 µL של EB buffer המסופק בערכת ה-MinLu, לפני ההארכה הראשונית ולכידת התוצר.

יש לבצע qPCR על מנות של הספריות לפני ההגברה ואחריה, כדי לכמת ולבדוק את איכות תוצר הספריה המוגברת. הספריה שעברה 14 מחזורי הגברה צריכה להכיל כמות DNA הגדולה פי כמה אלפים מזו של הספריה הראשונית. במידה ואין זה כך, יש לבדוק את תנאי ההגברה ולבצעם מחדש.

יש לתכנן פריימרים של לכידה להארכה ראשונית, אשר ישמשו ללכידת הרצפים המבוקשים מהספריה המוגברת, בדומה לפריימרים רגילים של PCR כך שיתאימו לאזור מטרה רצוי, עם טמפרטורת התכה אידיאלית של 60 °C לקצה ה-5' של כל אחד מהרצפים הללו, כולל רצף זנב של 12 בסיסים ושייר ביוטין בקצה ה-5'. ניתן להשתמש בעד 150 פריימרים של PEC יחד בתערובת multiplex אחת המוכנה ממלאים של 200 µM. לתגובת ההארכה הראשונית, הכין תערובת PCR בתוך מבחנה מתאימה ל-PCR על ידי הוספה של 5 µL של באפר GAMP PCR בריכוז 10X, 5 µL של מגנזיום כלוריד, 1 µL של BSA, ו-0.5 µL של DNTP. ערבב 5 µL מתערובת הפריימרים ללכידה להארכה ראשונית, 0.5 µL של Taq Gold DNA polymerase, 2 µL של DNA מהספריה שהוגברה ב-14 מחזורים, ולבסוף 31 µL של מים בדרגת PCR, כדי להגיע לנפח כולל של 50 µL.

אם תבנית הספריה המוגברת מכילה יותר מ-1 times 10 to the 12 עותקים למיקרוליטר, יש לדלל תחילה את התבנית עם EB buffer כך שלא יתווספו לתערובת התגובה יותר מ-2 times 10 to the 12 עותקים. לאחר הכנת מבחנת ה-PCR, יש להניח אותה במכשיר ה-thermocycler ולהגדירו להרצה של תגובה בודדת. התהליך יתחיל עם דנטורציה של 12 דקות ב-95 °C, לאחר מכן דקה אחת ב-60 °C, וחמש דקות ב-72 °C עבור השלב הראשוני של ההארכה (primary extension).

וכאשר המחזור הבודד מסתיים, יש לשמור על טמפרטורה של 72 מעלות צלזיוס כדי להחזיק את תוצר ה-PCR עד לשלב הבא. כדי למנוע היסתמכות (annealing) לא ספציפית של הפריימרים, העבירו ישירות 150 µL של PBI או באפר PB מערכה לניקוי DNA של Kyogen לתוך מבחנות תגובת ה-PCR, בזמן שתערובת התגובה נשארת במכשיר הטרמוסייקליר בטמפרטורה של 72 מעלות צלזיוס. פעולה זו מנטרלת את הפולימראז בעוד שהטמפרטורה גבוהה מדי עבור הארכה לא ספציפית של פריימרים המטרה; סגרו את המבחנות, ערבבו קצרות במערבל וורטקס, ולאחר מכן השקיעו את הנוזל באמצעות צנטריפוגה שולחנית.

השתמשו אך ורק בבופר PBI או PB בשלב זה, מכיוון שבופרי קישור אחרים, כגון בופר Qiagen PM, עלולים להפריע לתהליך הלכידה העוקב. לאחר מכן, הוציאו את התערובת משפרוret ה-PCR והעבירו אותה לעמודת ספין Rogen MinLu לצורך טיהור בהתאם להוראות היצרן, כפי שבוצע בעבר, ואלוטו DNA מהעמודה באמצעות 30 µL של בופר EB המסופק עם ערכת MinLu. כדי להסיר את כל הפרגמנטים שאינם נקשרים לפרימרי PEC, מבוצע שלב לכידה מבוסס חרו지를.

ראשית, יש להחזרות (resuspend) תמיסת מלאי של חרוזי M 270 strip באמצעות ערבול (vortexing), ולהוציא כמות חרוזים השקולה ל-25 µL לכל דגימה. יש לשטוף את החרוזים פעמיים עם 500 µL של תמיסות 2x BW buffer ולהחזיר אותם לנפח של 2x BW השקול לנפח החרוזים שנלקח במקור. הכין 25 µL מהסספנסיה.

עבור כל דגימה, הוסף 25 µL של ה-DNA המזוך והמטוהר ל-25 µL של תרחיף החרו지를, ושמור את חמשת המיקרוליטרים הנותרים לצורך כימות מאוחר יותר. ערבב את ה-DNA ואת תרחיף החרוזים באמצעות שאיבה והזרקה (pipetting) וערבוב עם הטיפ של ה-perpet, ולאחר מכן סובב באיטיות ברוטטור שולחני במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הערבוב, העבר את התוכן למבחנת PCR חדשה בנפח 1.5 mL.

במהלך שלב דגירת הסיבוב הקודם, ייתכן שחלק מה-DNA שאינו מטרה נדבק לדופן המבחנה. לכן, העברת ת сусפנסיון החרו지를 למבחנה חדשה מונעת את האפשרות ש-DNA זה ישתחרר אל המוצרים הסופיים. במהלך שלב האלוציה בחום, השתמש באסוף חלקיקים מגנטיים כדי לרכז את החרוזים; לאחר 10 עד 20 שניות, כל החרוזים ינדדו לדופן, ויותיר נוזל על עלול (SUP) צלול שיש להסירה כדי לשטוף את החרוזים. הוסף למבחנה 500 µL של באפר BW בריכוז פי 1 ובצע ערבוב במכשיר וורטקס למשך כשלוש שניות במהירות נמוכה.

בפעם אחת כאשר המבחנה זקופה ובפעם נוספת כאשר המבחנה הפוכה, לא צריכים להישאר חרוזים הדבקים לדופן המבחנה. באמצעות צנטריפוגה שולחנית, סובבו את התרחיף במשך אחת עד שלוש שניות, זמן קצר מספיק כדי למשוך את כל הנוזל מדפנות המבחנה. החזירו את המבחנה ל-MPC והמתינו 10 עד 20 שניות עד שכל החרוזים ייאספו בצד המבחנה.

לאחר מכן, הסירו את הנוזל העליון (SUP natant). שלב השטיפה הראשון הושלם כעת. חזרו על הליך זה ארבע פעמים נוספות, לאחר שטיפה אחת אחרונה עם BW והסרת הנוזל העליון.

הוסיפו 500 µL של hot wash buffer בריכוז 1x. ערבבו את התרחיף על ידי vortexing קצר וסבב centrifuging כפי שבוצע קודם לכן, ולאחר מכן נערעו את הפקתור למשך שתי דקות בטמפרטורה של 65 °C על thermal block shaker במהירות של 1000 RPM, ולאחר מכן בצעו סבב centrifuging קצר להסרת שאריות של העלייה (supernatant) תוך דקה מרגע ההוצאה מה-thermal block. שלב זה יסיר מקטעים שעשויים להיקשר למספרי PEC, אך לא הוארכו בשלב ה-primer extension. השעיו את המשקע (pellet) ב-30 µL של EB buffer והעבירו את התערובת לפקתור PCR חדש בנפח 1.5 mL.

דגרו את המבחנה בטרמיקלר בטמפרטורה של 95 °C למשך שלוש דקות. השקיעו את החרוזים באמצעות אספן חלקיקים מגנטי. ייקח בין 10 ל-20 שניות עד שהנוזל העליון יתבהיר לחלוטין; העבירו את הנוזל העליון (S supernatant) למבחנה חדשה ומסומנת.

הקפידו שלא להעביר חרוזים כלשהם. שמרו את העילאי, המכיל את תכסיר מקטעי ה-DNA שנלכדו. ניתן להשליך את החרוזים בשלב זה.

כדי להגביר את המוצר שנלכד, הכינו תערובת PCR לנפח כולל של 100 microliters כפי שבוצע בחלק השני, ובצעו את אותם תנאי מחזוריות של ה-PCR. שוב, לאחר השלמת הגברת ה-PCR של המוצר שנלכד, בצעו טיהור באמצעות עמודת ספין של Qiagen Ute כפי שבוצע קודם לכן בסעיף השני; השחילו את ה-DNA מהעמודה באמצעות 50 microliters של Eeb Buffer. המוצר מוכן כעת לרצף ברב-תפוקה (high throughput sequencing). תכננו 574 פריימרים של PEC כדי לכסות באופן רציף (tile) את כל הגנום המיטוכונדריאלי של הניאנדרטל.

פילקנו אותם לארבע תערובות מולטיפלקס ולשני סבבים סדרתיים של לכידת הארכה ראשונית (primary extension capture) על ספריות מחמישה מאובני ניאנדרטל מארבעה אתרים ברחבי אירואסיה, המתוארכים לבין 40,000 ל-70,000 שנים, ובכך הפקנו בין 170,000 ל-500,000 רצפים לכל פרט והשווינו את התוצאות לרצף ייחוס מיטוכונדריאלי. מצאנו כי הליך ה-PEC העשיר באופן מאסיבי את ה-DNA המיטוכונדריאלי, והשיג כיסוי מלא של ה-DNA המיטוכונדריאלי עבור כל פרט, עם כיסוי ממוצע של בין 18 ל-56.3 פעמים. עם תוצאות אלו, יכולנו להפיק רצף גנומי מיטוכונדריאלי מלא באיכות גבוהה עבור כל פרט.

לאחר מכן ביצענו השוואה פילוגנטית של רצפים אלו עם מדגם עולמי של בני אדם מהיום ועם קרובי המשפחה החיים הקרובים ביותר שלנו, השימפנזה והבונובו. הדבר אישר ממצאים קודמים לפיהם DNA מיטוכונדריאלי של ניאנדרטלים קשור באופן הדוק, אך נבדל בבירור מזה של בני אדם מודרניים. יתרה מכך, השוואה בין הרצפים של הניאנדרטלים עצמם חשפה שונות גנטית נמוכה ביותר בקרב ניאנדרטלים – נמוכה יותר מזו הקיימת בקרב בני אדם ברחבי העולם כיום, ודומה לזו של אירופאים בימינו.

ראיה זו, בשילוב עם ניתוח של אבולוציית חלבונים ברצפים של ניאנדרטלים, מצביעה על כך שפקודי האוכלוסייה של הניאנדרטלים היו נמוכים לאורך זמן, דבר העולה בקנה עם ראיות ארכאולוגיות המצביעות על כך שצפיפות האוכלוסייה של הניאנדרטלים מעולם לא הגיעה לרמות שהשיגו בני אדם מודרניים. הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבצע לכידת הארכה של פרימטים (primate extension capture) כדי להגביר וללכוד רצפים מטרים כהכנה לרצף בתושבה גבוהה (high throughput sequencing). בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להקפיד על כל מפרטי הטמפרטורה במכשיר התרמוסייקלר, אך שימו לב כי לפריימרים עשויות להיות טמפרטורות התאבכה (annealing temperatures) שונות, ולכן ייתכן שתצטרכו להתאים את טמפרטורת ההתאבכה לסוג הפריימרים הספציפי שלכם, ולהקפיד במהלך כל שלבי השטיפה להסיר כמה שיותר נוזל.

תודה לכם על הצפייה ובהצלחה בניסוייכם.