Encapsulation נייד ב הידרוג 3D עבור הנדסת רקמות
October 26th, 2009
אנו מציגים פרוטוקולים אנקפסולציה (3D) 3 ממדי של תאים בתוך הידרוג סינתטי. ההליך המתואר אנקפסולציה עבור שתי השיטות הנפוצות של crosslinking (מייקל מסוג בנוסף ואור יזומה מנגנוני רדיקלים חופשיים), כמו גם מספר טכניקות להערכת התנהגות התא כמוס.
התהליך ההדרגתי לעטיפת תאים מתחיל בהכנה ועיקור של תבניות הידרוג'ל וחומרים אחרים, ולאחר מכן בידוד תאים לאוכלוסיות בודדות, לצינורות לכל סט ג'ל. לאחר מכן מבוצעת הבדיקה בנוכחות תאים, ואחריה תקופת הדגירה במבחנה או in vivo. ניתוח במורד הזרם להתנהגות תאים עשוי לכלול בדיקות לכדאיות, מורפולוגיה, התפשטות והתמיינות.
היי אמידיו קאהן ממעבדתו של ד"ר ג'ייסון בורדיק במחלקה לביו-הנדסה באוניברסיטת פנסילבניה. היום נראה לכם הליך לאנקפסולציה תאית בהידרוג'לים תלת מימדיים להנדסת רקמות. אנו משתמשים בהליך זה כדי לחקור את ההשפעות של הרכב ומבנה ההידרוג'ל על התנהגותם של תאים עטופים.
אז בואו נתחיל. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו תמיסה של 0.5% משקל של יוזם הצילום ריפוי אוויר 2 9 5 9 או I 2 9 5 9 ב- PBS. מערבבים ודוגרים במשך יומיים-שלושה בחושך בחום של 37 מעלות צלזיוס.
כשהוא מוכן, השתמש במסנן מזרק כדי לעקר את התמיסה ולאחסן אותה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השתמש בתוכנת גיליון אלקטרוני כגון Microsoft Excel כדי לחשב את כמות הפולימר והקישור הדרושים להדגמה. הנה חומצה היאלורונית מתפקדת עם קבוצות תגובתיות אקרילט.
חשב גם את כמות פפטיד התליון המכיל את תחום הדבק הפונקציונלי עם חומצת אמינו ציסטין, ארגינין, גליצין ואספרטט. הציסטין מיועד לקשירה לפולימר. כעת, לאחר שנקבעו הכמויות הנדרשות של פולימר קרוסלינקר ופנט, שקלו אותם והניחו כל אחד מהם בצינור איינור.
התאם את הגיליון האלקטרוני של החישוב בהתאם. למסת הפולימר המתקבלת בפועל, המשך להכין תבניות ג'ל. השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את קצות הסטרילי העטוף בנפרד.
מזרקים חד פעמיים של מיליליטר אחד. ודא שנעשה חיתוך שטוח לתבניות שישמשו לדפוס צילום לג'לים. לבסוף, עקרו את תבניות המזרק, צינורות ה-EOR כשמכסיהם פתוחים וכל חומר נחוץ אחר על ידי הנחתם מתחת למקור אור קוטל חיידקים המובנה בארון הבטיחות הביולוגי למשך 30 דקות.
לאחר השלמת העיקור, המשך להכין את התאים לאחר עיקור ציוד הניסוי. עבדו במכסה המנוע והוסיפו TEA סטרילי לפולימר המשמש בקישור צולב מסוג מיקלי ו-PBS סטרילי לפולימר המשמש לקישור צולב רדיקלים חופשיים. הוסף מאגר תואם לצינורות חלקי התליון ולמערבולת.
כדי להמיס את חלק התליון נקשר לחומצה ההיאלורונית האלקילית באמצעות תיול מקבוצת INE על הפפטיד כדי לחבר את חלק התליון לפולימר, הוסף אותו לתמיסת הפולימר ואוטם עם פרם. בקצרה, מערבולת ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס עם ערבוב. בזמן הכנת התאים, בזמן שחלק התליון מחובר, הכינו את התאים ל-tryis עטופים, תאי גזע מזנכימליים אנושיים או HMCs על ידי שטיפתם ב-PBS.
לאחר מכן דגרו עם טריפסין למשך דקה בטמפרטורת החדר, הסירו את הדגירה של הטריפסין חמש דקות נוספות בחום של 37 מעלות. לאחר מכן הוסף אמצעי גידול HMSC כדי לנטרל את הטריפסין ולשחרר את התאים מפני השטח של הצלחת. ספרו את התאים בעזרת ציטומטר המו.
הפרד את התאים שנספרו לחלקים המכילים את המספר המתאים לכל סט ג'לים. עבור סט של שלושה ג'לים של 50 מיקרוליטר בצפיפות של 10 מיליון תאים למיליליטר, הפרד 1.5 מיליון תאים לצינור חרוטי בודד. אין להכין יותר מארבעה ג'לים בסט בודד בגלל עיתוי הפעילות.
לאחר מכן צנטריפוגה את התאים ב-500 RCF למשך שש דקות. בטמפרטורת החדר בזמן שהתאים מסתובבים מטה, הכינו את תערובת הפילמור למהדורה המיקלית. הוסף חוצץ לקישור הצולב כדי להשיג את הריכוז המתאים.
לקישור צולב רדיקלים חופשיים שיזם האור, הוסף את תמיסת I 2 9 5 9 שהוכנה בעבר לתמיסת הפולימר. ב-10% מנפח ערכת הג'ל הכולל לריכוז יוזם סופי של 0.05% משקל. כעת התאים ותערובת הפילמור מוכנים לאנקפסולציה בהידרוג'ל.
התחל בשאיבת החרטום מתאי הצנטריפוגה. המתן עד שהנוזל ישקע לאחר השאיפה הראשונית ושאף מחדש כדי להסיר כמה שיותר מדיה מבלי לשבש את כדור התא Resus. השעו את גלולת התא עם תמיסת הפולימר כדי למנוע בועות אוויר.
פיפטה לאט את התמיסה למעלה ולמטה כ -10 פעמים, מה שאמור להספיק כדי להפיץ את התאים באופן שווה. לתגובת התוספת מסוג מיקלי, השתמש בקצה פיפטה רחב של פתח כדי להוסיף את הנפח המתאים של תמיסת הצלב לתא הפולימר. לערבב. יש לכוון את הפיפטה לנפח הג'ל האישי הרצוי.
פיפטה את התמיסה למעלה ולמטה כדי להומוגניזציה ו-Eloqua לתוך תבניות קצה המזרק. בצע את השלב במהירות כדי להבטיח פיזור אחיד של תאים ולאפשר דגירה של 10 עד 30 דקות במכסה המנוע לקישור צולב. כי האור התחיל קישור צולב של רדיקלים חופשיים.
יש להכניס את הנפח המתאים לתבניות קצה המזרק. חשוף את המזרקים לאור UV לקישור צולב רדיקלי של חשיפה של 10 דקות ל-365 ננומטר. אור UV של ארבעה מילי-וואט לסנטימטר מרובע נפוץ עבור פולימרים פונקציונליים של ACRL.
בצע את השלב במהירות כדי למזער את שקיעת התאים לפני חשיפה לאור UV. לאחר קישור צולב צללו את הג'לים לבארות של צלחת תרבית רקמה המכילה מדיה לדגירה וניתוח. קישור צולב של ההידרוג'ל יכול להיעשות גם ברצף.
ראשית, הוסף את הרומין הפונקציונלי לריכוז סופי של 20 ננו-מולר בג'ל. הצבע עוזר לדמיין את הדפוס מכיוון שהוא משתלב באופן מועדף באזורים צולבים באופן קיצוני של הג'ל. לאחר מכן התחל עם תגובת הפילמור מסוג מיקרופון המניבה שבריר מהקישורים הצולבים התיאורטיים עבור הדברים הבאים.
קישור צולב רדיקלים חופשיים יצטרך להשתמש במסכה שתוכננה בתוכנה כמו Adobe Photoshop או Illustrator ומודפסת ישירות על מסכות שקיפות. מידות המסכה חייבות להתאים לחלק העליון של המזרק העגול. השתמש בפינצטה מעוקרת כדי למרוח מסכה סטרילית ישירות על משטח הג'ל וחשוף לאור כדי לקשר את הג'ל.
בהמשך מוצגים כאן HMCs בתוך הידרוג'לים מבוססי HA שעה לאחר האנקפסולציה. מכיוון שהידרוג'לים מסונתזים הם בדרך כלל שקופים, ניתן לדמיין תאים למורפולוגיה באמצעות מיקרוסקופ אור. אותם תאים הודגמו לצורך כדאיות 24 שעות לאחר האנקפסולציה באמצעות ערכת צביעה חי פלואורסצנטי.
השתמשנו בסידן M כדי לזהות את התאים החיים ואת הומודימר האתריום עבור התאים המתים וראינו יותר מ-95% כדאיות. השתמשנו גם במבחן הכחול של אלמר כדי לקבוע את רמת התפשטות התאים הנמדדת על ידי עד כמה התאים מפרקים את מגיב הבדיקה וכתוצאה מכך שינוי צבע. צביעת תאים בוצעה על H HMCs שבעה ימים לאחר האנקפסולציה בתוך הידרוג'ל מתכלה ודביק מבוסס HA ותוך שימוש בהליכים סטנדרטיים של קיבוע וחדירות.
אקטון תאי נראה באמצעות פלואורסצאין המסומן פין וגרעינים מרוסנים עם dpi. צביעה חיסונית נגד קולין משמשת להדמיה של הידבקויות מוקדיות בתוך מטריצת ההידרוג'ל. צביעה היסטולוגית מתבצעת לאחר התייבשות, הטמעת פרפין וחתך של ההידרוג'לים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של הידרוג'לים HA עטופים בפולימר HMSC באופן קיצוני.
לאחר שבוע בתרבית, נצבעו ב-hemat toin המסמן את הגרעינים ו-ASIN המסמן את רקמת החיבור A וכתמים כחולים לגליקוזאמינוגליקנים. זמן אמת. PCR משמש לכימות התמיינות של תאי גזע עטופים לאחר הפחתת הרקע, רמת הביטוי של גן מעניין נקבעת על ידי מספר המחזור שבו הושגה פלואורסצנטיות סף בהשוואה לאות ייחוס פסיבי, שהוא גן משק בית פעיל מבחינה מכוננת. אז זה עתה הראינו לכם כיצד לעטוף תאים בהידרוג'לים תלת-ממדיים ולחקור את התנהגות התאים בג'לים.
בעת שימוש בהליכים אלה, חשוב להבטיח חומרי סטריליות מלאים, בין אם על ידי שמירה על תמיסות חיץ סטריליות וריאגנטים לטווח ארוך או עיקור עם מנורת UV קוטל חיידקים. אז זהו. תודה על הכביסה ובהצלחה בניסויים שלך.
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקולים לכליאה תלת-ממדית של תאים בתוך הידרוג'לים סינתטיים, ומפרט שיטות לקישור צולב ולהערכת התנהגות התאים.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביו-הנדסה
- הנדסת רקמות
רקע
- כליאה תלת-ממדית של תאים חיונית ליישומים בהנדסת רקמות.
- הידרוג'לים מספקים סביבה תומכת לצמיחת תאים והתמיינותם.
- שיטות קישור צולב שונות יכולות להשפיע על התנהגות התאים.
- הבנת שיטות אלו יכולה לשפר אסטרטגיות בהנדסת רקמות.
מטרת המחקר
- לתאר נהלים לכליאת תאים בהידרוג'לים.
- להשוות בין טכניקות קישור צולב שונות.
- להעריך את התנהגות התאים הכלואים בתנאים שונים.
שיטות ששימשו
- הכנה ועיקור של תבניות הידרוג'ל.
- בידוד והכנה של אוכלוסיות תאים.
- קישור צולב באמצעות תוספת מסוג מייקל ומנגנונים של רדיקלים חופשיים המיוזמים באור.
- ניתוח תוצאות של חיוניות תאים, מורפולוגיה, ריבוי ודיפרנציאציה.
תוצאות עיקריות
- הושגה כליאה מוצלחת של תאים בהידרוג'לים.
- שיטות קישור צולב שונות השפיעו על התנהגות התאים.
- נבדקו חיוניות ומורפולוגיה של תאים כלואים.
- הרכב והמבנה של ההידרוג'ל השפיעו על התוצאות.
מסקנות
- ניתן להשתמש בפרוטוקולים שהוקמו ליישומים שונים בהנדסת רקמות.
- הבנת השפעות הקישור הצולב חיונית לאופטימיזציה של התנהגות התאים.
- מחקרים עתידיים יכולים לבנות על ממצאים אלו כדי לשפר טכניקות של הנדסת רקמות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
3D hydrogel encapsulation enables physiologically relevant cell culture models that improve predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking. By mimicking native tissue microenvironments, this approach supports more translatable assessments of stem cell behavior, differentiation, and response to bioactive cues. It addresses a key discovery-stage challenge: reducing biological ambiguity when evaluating therapeutic candidates in preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a tissue-like 3D context that better reflects in vivo conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation by allowing observation of cellular phenotype, viability, and differentiation under controlled matrix properties.
- Predictive Value: Improves confidence in lead identification by linking hydrogel composition to stem cell behavior and lineage specification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible platform for preparing validated biological systems suitable for downstream compound screening.
- Operational Value: Enables quantitative readouts such as proliferation (via Alamar Blue), viability (live/dead staining), and morphology, supporting assay reproducibility.
- Platform Utility: Compatible with multiple crosslinking mechanisms (Michael-type addition, free radical) and polymer types (e.g., hyaluronic acid, PEG), allowing assay adaptation across target classes.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains biological relevance from discovery through preclinical validation by preserving stem cell multipotency and differentiation capacity in degradable, adhesive hydrogels.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of cellular behavior over time (e.g., one-week culture) to inform go/no-go decisions based on matrix-mediated effects on proliferation and lineage commitment.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development through immunostaining of focal adhesions (e.g., vinculin) and histological analysis of glycosaminoglycan deposition.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for modalities requiring assessment of cell-matrix interactions and differentiation potential.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled study of how hydrogel structure influences stem cell fate and mechanotransduction.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible 3D cultures with quantifiable outputs for viability, proliferation, and morphological analysis.
- Analytics: Generates measurable readouts including gene expression (via qPCR), protein localization (immunostaining), and metabolic activity, facilitating comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work through degradation-adaptive hydrogels and extracellular matrix-like cues that model tissue remodeling.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, modular capability applicable across multiple projects in regenerative medicine, disease modeling, and mechanistic screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in stem cell responses to biomaterial cues.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through defined sterilization, crosslinking, and cell encapsulation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by providing earlier, more physiologically relevant functional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on their performance in tissue-mimetic environments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique, hydrogel chemistry, and stem cell culture.
- Depends on access to UV light sources for photoinitiated crosslinking and standard tissue culture equipment.
- Necessitates cross-team standardization of hydrogel formulation and cell preparation protocols.
- Involves adaptation considerations when transferring across different stem cell types or polymer backbones.
- Includes practical limitations such as gel settling timing constraints and the need for rapid processing to ensure uniform crosslinking.
