Encapsulation נייד ב הידרוג 3D עבור הנדסת רקמות

התהליך השלבי לכליאת תאים מתחיל בהכנה ועיקור של תבניות הידרוג'ל וחומרים אחרים, ולאחר מכן בבידוד תאים לאוכלוסיות בודדות, לתוך מבחנות עבור כל סט ג'לים. לאחר מכן מתבצעת הפולימריזציה בנוכחות תאים, ולאחריה תקופת דגירה in vitro או in vivo. ניתוח המשך של התנהגות התאים עשוי לכלול בדיקות לבדיקת חיוניות, מורפולוגיה, פרוליפרציה ודיפרנציאציה.

שלום, אני אמידיו קהאן מהמעבדה של ד"ר ג'ייסון ברדיק במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת פנסילבניה. היום נדגים לכם פרוצדורה לאנקפסולציה תאית בתוך הידרוג'לים תלת-ממדיים עבור הנדסת רקמות. אנו משתמשים בפרוצדורה זו כדי לחקור את השפעות ההרכב והמבנה של ההידרוג'ל על התנהגות התאים העטופים.

בואו נתחיל. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הכינו תמיסה בריכוז 0.5% weight של הפוטו-איניציאטור air cure 2 9 5 9 או I 2 9 5 9 ב-PBS. ערבבו ודגרו למשך יומיים עד שלושה בחושך בטמפרטורה של 37 °C.

כאשר התמיסה מוכנה, השתמשו במסנן מזרק כדי לעקר אותה ואחסנו אותה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השתמשו בתוכנת גיליונות נתונים כגון Microsoft Excel כדי לחשב את כמות הפולימר והמקשר (crosslinker) הדרושים כפי שהודגם. כאן מוצגת חומצה היאלורונית הפונקציונלית עם קבוצות רבתיביות של אקרילט.

חשבו גם את הכמות של הפפטיד התלוי המכיל את הדומיין הדביק הפונקציונלי עם חומצות האמינו cystine, arginine, glycine ו-aspartate. ה-cystine משמש לעיגון לפולימר. כעת, לאחר שנקבעו הכמויות הנדרשות של מקשר הפולימר (polymer crosslinker) והפפטיד, שקלו אותם והניחו כל אחד מהם בשפופרת איפנדור (eppendorf tube).

עדכנו את גיליון החישוב בהתאם. עבור המסה בפועל של הפולימר שהתקבלה, המשיכו לשלב של הכנת תבניות ג'ל. השתמשו בסכין גילוח כדי לחתוך את הקצוות של הטיפים הסטריליים העטופים בנפרד.

מזרקים חד-פעמיים של מיליליטר אחד. ודאו כי החיתוך שטוח עבור התבניות שישמשו להעברת תבנית תמונה לג'לים. לבסוף, עקרו את תבניות המזרקים, את צינורות ה-EOR עם המכסים פתוחים וכל חומר נחוץ אחר על ידי הצבתם תחת מקור אור קוטל חיידקים המובנה בתוך קבינת הבטיחות הביולוגית למשך 30 דקות.

לאחר השלמת הסטריליזציה, התקדמו להכנת התאים בעקבות סטריליזציה של הציוד הניסויי. עבדו בתוך מ ihūד והוסיפו TEA סטרילי לפולימר המשמש לקשירה צולבת מסוג mical, ו-PBS סטרילי לפולימר המשמש לקשירה צולבת של רדיקלים חופשיים. הוסיפו באפר תואם למבחנות בעלות ה-pendant moiety וערבבו במכשיר vortex.

כדי להמיס את היחידה התלויה (pendant moiety) הנקשרת לחומצה היאלורונית מאלקילת באמצעות תיול מקבוצת INE על הפפטיד להצמדת היחידה התלויה לפולימר, הוסף אותה לתמיסת הפולימר ואטם עם פאראפילם. בקצרה, ערבב במערבל סיבובי (vortex) והדגר בטמפרטורה של 37 °C עם ערבוב. בזמן שהיחידה התלויה נקשרת, הכן את התאים המיועדים לאנקפסולציה, תאי גזע מזנכיים אנושיים (hMSCs), על ידי שטיפתם ב-PBS.

לאחר מכן, דגרו עם trypsin למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, הסירו את ה-trypsin ודגרו חמש דקות נוספות ב-37 °C. לאחר מכן, הוסיפו מצע גידול HMSC כדי לנטרל את ה-trypsin ולשחרר את התאים מפני השטח של הפיתה. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer).

חלקו את התאים שנספרו למנות המכילות את המספר המתאים עבור כל סט של ג'לים. עבור סט של שלושה ג'לים של 50 µL בצפיפות של 10 מיליון תאים ל-mL, העבירו 1.5 מיליון תאים לפרועת קונית נפרדת. אין להכין יותר מארבעה ג'לים בסט בודד בשל תזמון הפעולה.

בשלב הבא, סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-500 RCF למשך שש דקות. בטמפרטורת החדר, בזמן שהתאים שוקעים, הכינו את תערובת הפולימריזציה לצמירה של ה-mical edition. הוסיפו באפר למקשר (crosslinker) כדי להגיע לריכוז המתאים.

עבור קשירה צולבת של רדיקלים חופשיים בהשראת אור, הוסף את תמיסת ה-I 2 9 5 9 שהוכנה קודם לכן אל תמיסת הפולימר. הוסף 10% מנפח הג'ל הסופי כדי להגיע לריכוז ראשוני סופי של 0.05% משקל. כעת התאים ותערובת הפולימריזציה מוכנים לכליאה בתוך ההידרוג'ל.

התחל בשאיבה של הנוזל מהתאים שסובבו בצנטריפוגה. המתן להשכבת הנוזל לאחר השאיבה הראשונית ושאוב שוב כדי להסיר כמה שיותר מדיום מבלי להפריע למשק התאים. השהה את משק התאים בתמיסת הפולימר כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.

העבר את התמיסה באיטיות מעלה ומטה באמצעות פיפט כ-10 פעמים, פעולה שאמורה להספיק לפיזור אחיד של התאים. עבור תגובת הוספה מסוג mical, השתמש בקצה פיפט עם פיה רחבה כדי להוסיף את הנפח המתאים של תמיסת המקשר (crosslinker) לתא הפולימר. ערבב. כוון את הפיפט לנפח הג'ל האינדיבידואלי הרצוי.

שאבו והשריצו את התמיסה בעזרת פיפטה כדי להבטיח הומוגניות, והעבירו אותה לתבניות של קצות המזרקים. בצעו את השלב במהירות כדי להבטיח התפלגות אחידה של התאים, והמתינו 10 עד 30 דקות של דגירה במנדף התרביות לצורך קישור צולב. עבור קישור צולב של רדיקלים חופשיים המופעל על ידי אור.

חלקו את הנפח המתאים לתבניות של קשרי מזרק. חשפו את המזרקים לאור UV לצורך קשירה רדיקלית (radical cross-linking) בחשיפה של 10 דקות לאור באורך גל של 365 nanometer. עוצמה של 4 milliwatts per centimeter squared של אור UV היא נפוצה עבור פולימרים עם פונקציונליזציית ACRL.

בצע את השלב במהירות כדי למזער את שקיעת התאים לפני החשיפה לאור UV. לאחר הקשירה הצלבית, טבול את הג'לים לבארות של פלטת תרבית רקמות המכילה מדיום עבור דגירה ואנליזה. ניתן לבצע את הקשירה הצלבית של ההידרוג'ל גם באופן סדרתי.

ראשית, יש להוסיף את הצבע הפונקציונלי metholated rumine לריכוז סופי של 20 nanomolar בתוך הג'ל. הצבע מסייע בהדמיית התבנית מאחר שהוא נטמע באופן מועדף באזורים בעלי קשירה צולבת רדיקלית בג'ל. לאחר מכן, התחילו בתגובת פולימריזציה מסוג mic המניבה חלק מהקשירות הצולבות התאורטיות עבור השלבים הבאים.

עבור קשירה צולבת של רדיקלים חופשיים, יהיה צורך להשתמש במסכה שתוכננה בתוכנה כגון Adobe Photoshop או Illustrator והודפסה ישירות על מסכות שקיפות. מימדי המסכה חייבים להתאים לחלק העליון העגול של המזרק. השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להניח מסכה סטרילית ישירות על פני השטח של הג'ל, וחשפו לאור כדי לבצע קשירה צולבת לג'ל.

כאן מוצגים בנוסף HMCs בתוך הידרוגלים מבוססי HA שעה אחת לאחר הכמוסה. מכיוון שהידרוגלים מסונתזים הם בדרך כלל שקופים, ניתן להדמות את התאים לצורך בחינת המורפולוגיה באמצעות מיקרוסקופיה של אור. אותם תאים הודמגו לבדיקת חיוניות 24 שעות לאחר הכמוסה באמצעות ערכת צביעה פלואורסצנטית של חיים-מתים.

השתמשנו ב-calcium M כדי לזהות תאים חיים וב-atherium homodimer עבור תאים מתים, וצפינו בחיוניות של מעל 95%. כמו כן, השתמשנו בבדיקת alamar blue כדי לקבוע את רמת השגשוג של התאים, שנמדדה על פי היכולת של התאים למטבליזם את ריאגנט הבדיקה, דבר שהוביל לשינוי בצבע. צביעת התאים בוצעה ב-H HMCs שבעה ימים לאחר כליאה בתוך הידרוג'ל מבוסס HA הניתן לפירוק והדבקה, תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים של קיבוע והחדרה.

ניתן להדגים את השלד התאי באמצעות פאלין המסומן בפלואורסצאין ואת הגרעינים באמצעות dpi. צביעה אימונוהיסטוכימית נגד קולין משמשת להדמיית נקודות היצמדות (focal adhesions) בתוך מטריצת ההידרוג'ל. צביעה היסטולוגית מבוצעת לאחר התייבשות, הטמעה בפאראפין וחיתוך של ההידרוג'לים לפי פרוטוקולים סטנדרטיים עבור הידרוג'לי HA המכילים HMSC שעברו פולימריזציה רדיקלית.

לאחר שבוע אחד בתרבית, בוצע צביעה ב-hematoxylin לסימון הגרעינים ו-ASIN לסימון הרקמה החיבורית, וצביעות בכחול עבור גליקוזאמינוגליקנים. Real-time PCR משמש לכימותה של התמיינות תאי גזע עטופים. לאחר הפחתת הרקע, רמת הביטוי של הגן הנחקר נקבעת לפי מספר המחזורים שבהם הושגה פלואורסצנציית סף בהשוואה לאות ייחוס פסיבי, שהוא גן ביתי (housekeeping gene) בעל פעילות קבועה. כך הצגנו בפניכם כיצד לעטוף תאים בהידרוגלים בתלת-ממד ולחקור את התנהגות התאים בג'לים.

בעת שימוש בפרוצדורות אלו, חשוב להבטיח סטריליות מלאה של החומרים, בין אם על ידי שמירה ארוכת טווח של תמיסות בופר וריאגנטים סטריליים, ובין אם על ידי עיקור באמצעות מנורת UV קוטלת חיידקים. זהו כל התהליך. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.