פולשנית In vivo קטנים בעלי חיים MRI ו MRS: הפרוצדורות בסיסי
20 באוקטובר 2009
עבודה זו מתארת את הנהלים הבסיסיים של פולשנית חיה MRI קטן MRS In vivo.
כדי להתחיל בניסוי זה, עכבר הרדום מונח על מחזיק בעלי חיים שמוכנס לאחר מכן לסליל תדר רדיו או RF coil. לפני ניסוי MRI או MRS, סליל ה-RF מכוונ לתדר התהודה ומותאם לעכבה אופיינית של 50 ohm. לאחר מכן, רכישת נתוני MRI או MRS מבוצעת לאחר אופטימיזציה של רצף הפולסים, ולבסוף התמונות או הספקטרום מנותחים באמצעות תוכניות ניתוח.
שלום, אני דון לי ממעבדת המחקר R במחלקה לרדיולוגיה באוניברסיטת וושינגטון. ואני דייוויד סנק, גם אני ממעבדת המחקר R וממחלקות הרדיולוגיה והביו-הנדסה באוניברסיטת וושינגטון. היום נראה לכם הליך לבדיקת דימות תהודה מגנטית וספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית בעכברים.
במעבדה שלנו, אנו משתמשים בנהלים אלו כדי לחקור מודלים של גידולי עכבר, דיסטרופיה שרירית ומטבוליזם של השריר. לכן, בואו נתחיל. פרוטוקול זה אינו נועד לכסות כל היבט של MRI בבעלי חיים קטנים, אלא להציג נהלים בסיסיים של ניסויי MRI בעכברים.
המטרה היא לספק הבנה טובה יותר של הליכים בסיסיים לניסויי MR in vivo בבעלי חיים קטנים, כדי שחוקרים חדשים בתחום ה-MR יוכלו לתכנן טוב יותר את הרכיבים שאינם MR במחקריהם. כך, בסופו של דבר, ניתן יהיה לשלב בצורה חלקה בין הליכי MR להליכים שאינם MR. כדי להתחיל בהכנות לניסוי הדימות בתהודה מגנטית או MRI, הניחו עכבר שהורדם באמצעות isoflurane על תומך לבעלי חיים, כאשר אפו מוכנס לתוך קונוס לאף.
ניתן להשתמש במקבע ראש לצילום של הראש, ובמחזיק גוף לצילום של הגוף. שמרו על לחות עיני החיה באמצעות משחה סטרילית לסיכוך העיניים.
יש לשמור על בעל החיים בטמפרטורה של 35 עד 37 מעלות Celsius במהלך הניסוי בתוך מערכת סירקולציה של מים חמים. מערכת ניטור בעלי חיים משמשת הן לניטור טמפרטורת הגוף, הנשימה ומחזור הלב, והן לסנכרון של שער הנשימה והלב (gating) עם רכישת הדימות. לאחר מכן, יש להניח דגימת אגרו (agro) סטנדרטית לצד בעל החיים כדי לנטר שינוי פתאומי באות.
דגימת חקלאות סטנדרטית זו שימושית במיוחד לדימות של מספר פרוסות ומספר נקודות זמן. כאשר מזוהה שינוי לא צפוי באות בפרוסה מתוך התמונות שנרכשו, ניתן להסיר את הפרוסה. לאחר שהחיה מאובטחת וכל רכיבי הניטור במקומם, מקם את מחזיק החיה במרכז של סליל תדר רדיו או RF coil.
העבירו את סליל ה-RF לחדר המגנט והכניסו אותו למערכת סירקולציה של מים חמים הממוקמת בתוך המגנט. כעת התחילו ברכישת נתוני MRI. במהלך תקופת הדימות, כווננו את מד הזרימה ל-0.4 עד 0.8 milliliters per minute והפחיתו את מאייד ה-isof fluorine ל-1.2 עד 1.5%. הגז הנשף היוצא מקונו האף של העכבר מוסר אל תוך ואקום פנימי.
כדי למקסם את קליטת האות, כוון את סליל ה-RF לתדר התהודה של פרוטון H one והתאם את העכבה האופיינית של הסליל ל-50 ohm. בעזרת פאנל הכוונון בסורק ה-MR, רוב סורקי ה-MRI האנושיים אינם דורשים תהליך התאמה נפרד, למעט בפרוצדורות MRS. התחל בביצוע shimming באמצעות רצף פולסים בודד.
תהליך השיומינג (shimming) מייעל את הומוגניות השדה המגנטי באזור העניין. לכל סורק יש דרך משלו לביצוע תהליך השיומינג, כולל תהליכי שיומינג אוטומטיים ומהירים, כגון fast map ושיומינג של גרדיאנטים. עם השלמת השיומינג, יש לייעל את פולס ה-RF.
באמצעות מקסום פרופיל התמונה החד-ממדי. ניתן לסדר את הספקים של פולסי ה-RF תוך שמירה על אורך פולס קבוע והבטחת זמן השהיה (recycle delay) מספיק ארוך. ה-TR צריך להיות בערך פי שלושה עד חמישה מה-T1 של הרקמה; רכשו תמונות סריקה (scout images) לאורך שלושה כיוונים אורתוגונליים כדי ליצור תמונות אקסיאליות, קורונליות וסגיטליות.
ניתן להשתמש ברצף רכישת תמונות מהיר כדי לרכוש את תמונות הסקאוט (scout images). התמונות שירכשו ישמשו לתכנון ההדמיה בפועל תוך קביעת מישורי ההדמיה. במהלך ההדמיה בפועל, נעשה שימוש ברצף spin echo.
ניתן לבצע שתי מדידות באמצעות דימות רב-הד (multi echo imaging) או דימות הד יחיד עם ערכי T מרובים. עם השלמת ניסוי ה-MRI, נבחן ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית (MRS) in vivo לשריר השלד של הגפה האחורית בעכבר, עבור המצב הנח והמצב המיטוכונדרי המקסימלי. ניתן לקבוע ייצור ATP באמצעות שימוש ב-MRS למדידת שינויים בפוספוקראטין במהלך איסכמיה ומיד אחריה.
התחילו בבניית שרוול (cuff) להשראת איסכמיה הפיכה. השתמשו בחתיכת צינור PVC ברוחב של כ-5 עד 7 מילימטרים ובקוטר פנימי של 12 עד 15 מילימטרים. קדחו חור קטן דרך הדופן, וגזרו חתיכה מבלון כך שתהיה פתוחה בשני קצותיה.
בלונים באיכות הליום עובדים בצורה הטובה ביותר. הכניסו את החלק הזה דרך חלק ה-PVC ועטפו אותו בחזרה מסביב. הדביקו את הקצוות יחד על הדופן החיצונית של חלק ה-PVC.
בשלב הבא, השתמשו ב shrink wrap כדי לאטום את קצות הבלון סביב הצינור. התוצאה צריכה להיות שרוול בעל דופן חיצונית קשיחה ודופן פנימית הניתנת לנפח. גזרו חלק מה-shrink wrap ומהבלון סביב החור ההשחלתי.
תוך הקפדה להשאיר מספיק חומר בין החור לקצה פיסת ה-PVC, השהילו חתיכה של 1.5 סנטימטר ממתכת שאינה פרומגנטית (non-ferris) אל תוך החור ב-PVC. פעולה זו תאפשר לכם לנפח את השרוול. אטמו את האזור באמצעות אפוקסי של חמש דקות.
כעת קבעו את השרוול במקומו לצד סליל ה-RF בתוך גשש ה-MRS וחברו אותו למד-לחץ (manometer) חיצוני. כעת מקמו עכבר מוכרז (anesthetized) בתוך גשש ה-MRS על ידי הנחתו כשהוא פונה כלפי מעלה על תמיכת העכבר.
הנח את הבלון הממולא בנוזל על הצד הגחוני של העכבר ואבטח אותו במקומו באמצעות רצועות תמיכה לעכבר. הכנס את העכבר ואת תמיכת הגוף לתוך גשושית ה-MRS. משוך גפה אחורית אחת דרך השרוול האיסכמי וסליל ה-MRS.
יש למרכז את הרגל בתוך הסליל ככל האפשר. סידור זה מאפשר מיקום אופקי של גוף החיה. בתוך מגנט עם פתח אנכי (bore), יש להניח את גוף הגשש בתוך המגנט, לבצע כיוון (tune), התאמה (match) ושימינג (shim) כדי למקסם את יחס אות לרעש ב-MRS כפי שמתואר עבור MRI, למעט שב-MRS, פולס ה-RF ממוטב על ידי מקסום אמפליטודת הספקטרום.
כעת השתמש ב-P 31 MRS כדי לאסוף ספקטרום רגוע לחלוטין עם יחס אות לרעש גבוה, או ב-FRS כדי לקבוע את היחסים בין פוספט אנאורגני ופוספוקריאטין ל-TP תחת תנאים רגועים לחלוטין. לביצוע ניסוי איסכמי, אסוף תחילה את ספקטרומי המנוחה למשך כחמש דקות. כעת גרם לאיסכמיה על ידי ניפוח השרוול ל-270 עד 300 millimeters mercury למשך 10 עד 12 דקות.
שחררו את השרוול ואספו ספקטרום התאוששות במשך חמש דקות. ניתן לחזור על הניסויים בימים עוקבים. כעת נציג מספר תוצאות מייצגות של MRI ו-MRS in vivo.
לעכבר עירום יש גידול מוחי מסוג xenograft D 2 82 על גבו, והוא נסרק באמצעות רצף spin echo קונבנציונלי עם השפעות רילקסציה שונות. בתמונה המשוקללת ל-T one, הגידול מופיע בעצימות דומה לזו של הרקמה הסמוכה. לעומת זאת, תמונת ה-T two התואמת מדגישה בבירור את הגידול כאזור היפראינטנסי.
רכישת הדים מרובים (Multip echo acquisition) מאפשרת חישוב של מפת T2 המכילה מידע כמותי על שינויי T2 בגופו של בעל החיים. ניתן לנטר שינויי T2 אזוריים באזור הגידול לאורך זמן על גבי התמונה המודבקת. כאן מוצג ספקטרום P 31 MRS ברגיעה מלאה מגפי နောက် של עכבר.
ספקטרום זה מייצג 16 סכומים של FIS. סדר הפסגות משמאל לימין מייצג את המטבוליטים הבאים של השריר: פוספט אנאורגני Pi, פוספו-קראטין, PCr, והפוספטים של ATP (גמא, אלפא ובטא). ספקטראי ³¹P MRS שנאספו לאורך ניסוי האיסכמיה-רפרפוזיה הדינמי מוצגים כאן; במהלך האיסכמיה, רמות ה-PCr יורדות ורמות ה-Pi עולות. קצב הירידה של ה-PCr במהלך האיסכמיה שווה לייצור ה-ATP המיטוכונדרי במצב מנוחה.
ניתן להשתמש בהתאוששות ה-PCR לאחר איסכמיה כדי לחשב את ייצור ה-ATP המיטוכונדרי המקסימלי. הרגע הצגנו בפניכם כיצד להשיג תמונות in vivo של עכברים ולמדוד מטבוליזם של שרירי עכבר in vivo באמצעות ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית (MRS) והדמיה תהודה מגנטית (MRI). עבור ה-MRS, בנינו גשושית RF מותאמת אישית המאפשרת לשמור את גוף העכבר במצב אופקי בתוך מגנט בעל חור אנכי.
לפיכך, ניתן לבצע ניסויים אלו בכל מערכת אנכית בעלת קוטר פנימי רחב. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבצע את הפרוצדורה בתנאים אופטימליים, כגון כוונון והתאמה משופרים של סליל ה-RF ושיפור בזרימת השדה המגנטי. חשוב גם לנטר את מצב החיה באמצעות מערכת לניטור בעלי חיים כדי לשמור על מצב פיזיולוגי יציב של החיה ולמנוע מדידות ארטיפקטואליות פוטנציאליות.
זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
עבודה זו מתארת פרוצדורות בסיסיות של MRI ו-MRS לא פולשניים בבעלי חיים קטנים in vivo. המחקר מתמקד באופטימיזציה של טכניקות הדימות לצורך ניתוח טוב יותר של תהליכים ביולוגיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- רדיולוגיה
- הנדסה ביו-רפואית
רקע
- דימות תהודה מגנטית (MRI) וספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית (MRS) הם כלים חיוניים במדעי העצבים.
- טכניקות אלו מאפשרות בדיקה לא פולשנית של מודלים של בעלי חיים קטנים.
- הבנת הפרוצדורות משפרת את היכולת לנתח תהליכים מטבוליים.
- אופטימיזציה של רצפי פולסים היא קריטית להשגת תמונות וספקטרום באיכות גבוהה.
מטרת המחקר
- להדגמת הפרוצדורות לביצוע MRI ו-MRS בעכברים.
- לספק תובנות לגבי אופטימיזציה של טכניקות דימות.
- לאפשר ניתוח טוב יותר של נתונים ביולוגיים באמצעות שיטות דימות מתקדמות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- עכברים שהורדמו מונחים בסליל RF לצורך הדמיה.
- סליל ה-RF מכוון לתדר התהודה.
- רכישת הדמיות מבוצעת לאחר אופטימיזציה של רצף הפולסים.
- תמונות וספקטרום מנותחים באמצעות תוכנה ייעודית.
תוצאות עיקריות
- רכישה מוצלחת של נתוני MRI ו-MRS ממודלים של בעלי חיים קטנים.
- הדגמת החשיבות של כיוונון סליל ה-RF להשגת תוצאות אופטימליות.
- מתן מסגרת לניתוח תהליכים ביולוגיים באמצעות טכניקות דימות.
- הדגשת שיתוף הפעולה בין רדיולוגיה להנדסה ביו-רפואית במחקר.
מסקנות
- המחקר מתווה שיטות יעילות לדימות לא פולשני בבעלי חיים קטנים.
- אופטימיזציה של טכניקות דימות היא חיונית לצורך ניתוח ביולוגי מדויק.
- עבודה זו תורמת לקידום מתודולוגיות מחקר בתחום מדעי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקות MRI/MRS לא פולשניות בבעלי חיים קטנים מאפשרות ניטור אורך של מודלי מחלות ופנוטיפים מטבוליים ללא קרינה מייננת, ובכך תומכות בתיקוף מוקדם של מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי. הטכניקה מספקת מדדים כמותיים בעלי רלוונטיות תרגומית, כגון מיפוי T2 ויחסי פוספו-מטבוליטים, המגשרים בין ממצאים פרה-קליניים לבין ביומרקרים של דימות קליני. באמצעות שילוב נתוני MR עם נקודות קצה שאינן מבוססות MR, צוותי מחקר יכולים לשפר את רמת הביטחון בחיזוי בזיהוי מועמדים מובילים ולהפחית את שיעורי הכישלון הביולוגי בתוכניות למחלות אונקולוגיות, נוירו-מוסקולריות ומטבוליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מעקב אורך של צמיחת הגידול ותגובה מטבולית במודלים של קסנוגרפט (xenograft).
- ערך תפעולי: מספק מדידות לא פולשניות וחוזרות המפחיתות את מספר בעלי החיים בשימוש ותומכות בתכנון מחקר אתי.
- ערך ניבוי: שינויים כמותיים ב-T2 וקינטיקה של התאוששות פוספוקריאטין מספקים תובנות מכניסטיות לגבי מעורבות מטרות התרופה ומודולציה של מסלולים.
סקר ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הליכי כיוונון (tuning) ושימינג (shimming) אופטימליים של סליל ה-RF מבטיחים יחס אות לרעש הניתן לשחזור עבור יישומים של סריקה אורכית.
- פלט כמותי: דימות רב-הד (Multi-echo) מייצר מפות T2 בדיוק מספרי, המאפשר השוואה אובייקטיבית בין קבוצות טיפול.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: תהליכי עבודה סטנדרטיים להכנה וניטור של בעלי חיים תומכים בעקביות בין מחקרים שונים במודלים של מחלות של השלד והשרירים, נוירו-אונקולוגיה ומחלות מטבוליות.
מחקר תרגומי ופקליני
- המשכיות תרגומית: יחסי פוספוקריאטין/פוספט אנאורגני הנגזרים מ-31P MRS משמשים כסמנים ביולוגיים לתפקוד מיטוכונדריאלי עם מקבילות קליניות ישירות ב-MRS.
- תיקוף פרה-קליני: מודלים של אתגר איסכמי בשריר השלד מאפשרים הערכה של ייצור ATP מקסימלי, ובכך תומכים בהפחתת סיכונים של משני מטבוליזם.
- קידום מותאם סיכון: ניטור אורך של T2 של הגידול ושינויים במטבוליטים מאפשר קבלת החלטות המשך (go/no-go) המבוססות על אפקטים ביולוגיים מתווכים במטרה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של מולקולת העופרת, ומספקת קריאות פנוטיפיות ביניים המנחות איטרציות כימיות ומחקרי מנגנון פעולה.
- ביולוגיה של התגליות: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי קישור הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות לשינויים מדידים במטבוליזם של רקמות ובתוכן המים.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה של בדיקות באמצעות אופטימיזציה של סליל RF וניטור פיזיולוגי, מה שמבטיח הערכה אמינה של תרכובות לאורך נקודות זמן שונות.
- אנליטיקה: מייצרת משתנים תלויים כמותיים, כולל זמני רלקסציית T2 ויחסי שיאי מטבוליטים, לצורך השוואה סטטיסטית של תנאי ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר להמשכיות פרה-קלינית באמצעות ביומרקרים של מטבוליטים המשקפים מסלולי מטבוליזם אנרגטי שנשמרו בין מינים שונים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת דימות הניתנת לשימוש חוזר לצורך פנוטיפיקה לרוחבה במודלים של מחלות כרוניות הדורשים הערכות חוזרות שאינן טרמינליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי אספקת נתונים מטבוליים ומבניים כמותיים עם רזולוציה מרחבית באורגניזמים שלמים.
- ערך תפעולי: נהלים סטנדרטיים להרדמה, ניטור ואופטימיזציה של RF משפרים את השחזוריות בין אתרים ומבצעים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי מתן אפשרות לגילוי מוקדם של מועמדים שאינם יעילים, ובכך מפחית את ההשקעה בתרכובות שאינן פעילות ביולוגית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים באמצעות מדדי יעילות אובייקטיביים מבוססי דימות, המשלימים את נקודות הקצה המסורתיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהרדמה של בעלי חיים קטנים, ניטור פיזיולוגי ופרוטוקולי בטיחות ב-MR.
- תלוי בגישה לסלילי RF רחב-פס, יכולות שימינג (shimming) וכלים ללוקליזציה ספקטרלית עבור 31P MRS.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של טיפול בבעלי חיים, מישורי דימות ושיטות לכימות ספקטרלי.
- שיקולי התאמה כוללים מיקום ספציפי למודל (למשל, מחקרים בגידולים לעומת מחקרים בשרירים) ובחירת סליל עבור אנטומיות שונות.
- מגבלות מעשיות כוללות הגבלות של יחס אות לרעש ברקמות עמוקות והצורך בייצוב פיזיולוגי בסיסי לפני רכישת הנתונים.
