ניטור הלב לתפקד הזחל תסיסנית melanogaster ללימודים פיזיולוגיים
16 בנובמבר 2009
אנו מציגים דרכים שונות כדי לפקח על תפקוד הלב של הזחל תסיסנית להערכת שאלות להתמודדות עם הפונקציה של צמתים הפער, מוטציות ערוץ יון, מודולציה של פעילות קוצב לב ומחקרים פרמקולוגיים.
זבובי הפירות (Drosophila) הם דגם גנטי אטרקטיבי לחקר ההתפתחות והתפקוד של הלב והפעילות של קוצב הלב הבסיסי. נוהל זה מדגים כיצד להכין דגימות של פשפשים שלמים ופשפשים מנובעים, וכיצד לנטר את קצב הלב. ההכנה המנובעת מאפשרת גם הקלטות של פוטנציאלים חוץ-תאיים או תוך-תאיים, כדי לבחון לעומק את תפקודי תעלות היונים.
שלום, אני רובין קופר, חבר סגל במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת קנטקי. היום תלמידיי, אן קופר, קיילה ריימן, מאט וורד ואיסטר בוקו, יציגו בפניכם פרוצדורות שונות לניטור קצב הלב בזחלי *Drosophila*. השיטה הבאה, המתבצעת ללא ריסון, נקראת "חוות נמלים" כיוון שהזחלים נצפים בתוך מישור מוקד אחד.
לקבלת הוויזואליזציה מיטבית של הזחלים, השתמשו במיקרוסקופ דיסקציה עם עדשה אובייקטיבית בסיסית של 2x ועדשת עינית של 0.5x, כדי להשיג את הרזולוציה המרחבית וההגדלה הטובות ביותר עבור מלבן של 1 סנטימטר על 0.5 סנטימטר. ניתן להקליט תמונות וסרטוני וידאו באמצעות מצלמה המותקנת על תושבת העינית. כדי להתחיל בשיטה זו, הניחו זחל עם שכבה דקה של מזון בין שתי זכוכית למקרה (glass slides).
השקופיות מוחזקות במרחק של 1 עד 1.5 מילימטרים זו מזו באמצעות ספייסרים מפלסטיק בכל ארבעת הצדדים. הטו את הדגימה בזווית של בין 20 ל-45 מעלות למשך מספר דקות כדי לעודד את הזחלים להשאיר את ראשם מופנה כלפי מטה. כוון את מראת המיקרוסקופ כדי להשיג את הניגודיות המיטבית של הלב או של שתי הקשרי נשימה (trachea) כדי לצפות בפעימות הלב.
שיטת הדבק היא שיטת קיבוע קבועה לריסון זחליים על גבי זכוכית. כדי להתחיל בשיטת הדבק, הניחו לביבת כיסוי נקייה מעל זכוכית.
בשלב הבא, שטפו את הזחלים במים. כדי להסיר שאריות מזון, ספגו את הנוזל בעזרת טישיו או פינה של נייר סופג. לאחר שהזחל נשטף היטב, הרימו אותו בעדינות בעזרת פינצטה נקייה והניחו אותו על התית (slide) הרחוק מהזכוכית המכסה תחת המיקרוסקופ, כאשר הזחל מונח על בטנו.
על הקיבה יופיעו חריצים אופקיים עמומים עם שערות שחורות דקות. גבם של הזחלים צריך להיות פונה כלפי מעלה וכולל שני פסי מרוצה, שהם הקנה (trachea). באמצעות סט שני של פינצטות המוקדש אך ורק לטיפול בדבק, קחו כמות קטנה מהטיפה שבסוף הזז (slip) והניחו אותה בפינה בצד הנגדי.
השתמשו בכמות מזערית, רק מספיקה כדי לכסות את ראש הפינצטה. הסירו את בעל החיים והניחו אותו על הדבק תוך הבטחה שיישאר במיקום זה. צדו הגחני פונה כלפי מטה אל תוך הפה השחור.
הווים צריכים להיות בקו העזר או קרוב לשולי כיסוי הזכוכית, כך שוויי הפה והספירלה החומה יהיו גלויים. אסור להם לגעת בדבק. לחץ בעדינות על הזחלים כדי להשטיח אותם.
כדי להחיל את חומר הבדיקה, מומלץ להעביר טיפות קטנות באמצעות מזרק ליד ראש הזחל. יש לעקוב אחר קצב הלב על ידי ספירת מספר הפעימות של הספירלות בדקה אחת. לתצפיות ממושכות יותר, ניתן להאכיל את הזחלים במקומם ולהרטיב אותם כדי למנוע התייבשות. כדי להכין פלטת ניתוח השמישה לשימוש תחת המיקרוסקופ, השתמש בסכין מנתס כדי לחתוך חור בקוטר של שני סנטימטרים במרכזה של פיסת סרט מגנטי והדבק אותה לשקף זכוכית.
השתמשו בסיכות ניתוח שכוופפו והודבקו למהדקי נייר כדי להקל על הקיבוע. במהלך הניתוח, הניחו זחלי כוכב בשליש השלישי שלם על לוח הניתוח. כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה, הקשירה (trachea) צריכה להיות גלויה דרך הקוטיקולה.
מקם שני סיכות בזחלים משני צדדיו של וו הפה, ושתי סיכות נוספות משני צדדיהם של הספירלות. לאחר מכן, הוסף תמיסת מלח כדי לשמור על לחות הזחלים. לאחר מכן בצע חתך אופקי ליד הקצה, ואחריו חתך לאורך שיוסיף להמשיך לצד הספירלות לכיוון ראשו של בעל החיים.
הרימו סיכה גבית אחת והשחילו אותה מתחת לקוטיקולה. השתמשו בסיכה כדי להרחיב. פתחו את חלל הגוף.
חזור על הפעולה עם שלושת המסמרים האחרים. לאחר שהבעל חיים ננעץ במצב פתוח, הסר את האיברים הפנימיים בזהירות כדי לא לפגוע בקנה הנשימה או בלב. חלק מהמבנים, כולל המוח וגופי שומן מסוימים, מחוברים ללב ועלולים לגרום לנזק לו בעת הסרתם.
יש לאפשר לדגימה להירגע במימחי HL three saline למשך שלוש עד חמש דקות לאחר הניתוח; רישומים תוך-תאיים ורישומים של שדות פוטנציאל מבוצעים בדגימה זו תוך כדי החלה ישירה של סוכנים פרמקולוגיים על הלב. הזמן הכולל לשלב ניתוח זה הוא שלוש עד שש דקות. לביצוע קוצביות חשמלית (pacing), תחילה יש להכין אלקטרודות מוקדיות; כדי להכין אלקטרודה מוקדית, העבירו אלקטרודת זכוכית מעל גוף חימום לביצוע ליטוש באש (fire polish) ויצירת כיפוף הדרגתי של כ-45 מעלות, ולאחר מכן רכבו על המניפולטור אלקטרודה מוקדית המולאה ב-HL three saline בטמפרטורת החדר, כאשר הקצה מופנה כלפי מטה.
וודאו שחוט הגירוי נוגע בתמיסת המלח בתוך האלקטרודה ושהגירוי כבוי. הצמידו למסבך מיקרוסקופ דגימה טרייה של נתיחה של לב. הניחו את חוט ההארקה בתוך תמיסת המלח.
הקפידו לא לגעת בפינים או להפריע להכנה. שמרו על מיקוד באלקטרודה תוך שימוש במניפולטור להורדתה אל תוך התמיסה המלחית. לאחר ההגעה לתמיסה המלחית, מקמו את קצה האלקטרודה כך שהלומן יהיה שטוח כנגד הלב ויגע בו קלות.
לאחר מיקום האלקטרודה, הגדירו את תדר הגירוי ל-two hertz עם המתח בהגדרה הנמוכה ביותר. הפעילו את הגירוי. כווןו את התדר לכ-three hertz והעלו באיטיות את המתח עד שקצב הלב יאיץ ויתאים למקצב הגירוי.
כעת ניתן לשלוט בקצב באמצעות הגירוי. ניתן להוסיף תרכובות כדי לבחון אם הן משפיעות על הכיווץ או על ההולכה החשמלית. לצורך ביצוע הקלטות של פוטנציאל שדה, מלאו אלקטרודת הקלטה מסוג macro patch בתמיסת רחצה והניחו אותה במניפולטור על מיקרוסקופ מורכב.
חבר את האלקטרודה למגבר ולמערכת הקלטה. השתמש במניפולטור כדי להוריד את חלל האלקטרודה מעל לב של דגימת נתיחה המקובעת למיקרוסקופ. גע בלב קלות מאוד עם קצה האלקטרודה.
כעת ניתן לבצע הקלטות שדה כדי להקליט פוטנציאלי שדה מאזור אחר של הלב. הרם בעדינות את קצה האלקטרודה והעבירו אותו לאזור חדש באמצעות המניפולטור, ולאחר מכן בצעו שוב הקלטות של פוטנציאל השדה של הקצה. אפשרו ניטור מדויק של קצב ומשך האותות החשמליים בלב כדי למדוד פוטנציאלים ממברנליים של מיוציטים של זחלים.
ראשית, ודאו שהלומן של אלקטרודה חדה המולאה ב-three molar potassium chloride מונח בצורה שטוחה כנגד הלב בזווית של כ-45 מעלות מהאנך. לאחר מיקום נכון, געו בעדינות בלב עם קצה האלקטרודה והחדירו את הקצה לתוך תא. ניתן להשתמש באלקטרודה שוב אם היא לא נשברה.
ההקלטות התוך-תאיות מאפשרות למדוד את הבסיס היוני של פוטנציאל הפעולה ואת הצורות האופייניות של הפוטנציאלים, כדי לבחון את ההשפעות של מוטציות בתעלות יונים או של מודולטורים של תעלות. כך שהראינו לכם כיצד לבצע הקלטות מהלב, כמו גם כיצד למדוד פוטנציאלים תוך-תאיים ופוטנציאלי שדה. ניתן להשתמש בטכניקות אלו כדי לבחון שינויים בלב, כמו גם מניפולציות פרמקולוגיות ושינויים גנטיים.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב שלא למשוך מבנה קשור המחובר ללב או ללחוץ חזק מדי עם האלקטרודה המוקדית. כמו כן, בשיטת ההדבקה, יש להקפיד לא להדביק את הפה או לסגור את הכדור. זהו כל הפרוצדורה.
תודה לצפייה ובהצלחה בניסויים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטות לניטור תפקודי הלב בפסילת Drosophila, תוך התמקדות בהערכה של צמתי פער (gap junctions), מוטציות בתעלות יונים ופעילות קוצב הלב. הטכניקות כוללות both הכנות שלמים ושלבים מבודדים לצורך ניתוח מפורט.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- פיזיולוגיה
- גנטיקה
רקע
- זבובים מסוג Drosophila הם בעלי ערך רב לחקר התפתחות הלב ותפקודו.
- הבנת פעילות קוצב הלב היא קריטית להשגת תובנות לגבי פיזיולוגיה לבבית.
- ניתן להעריך את תפקוד תעלות היונים באמצעות מערכים ניסיוניים שונים.
- מחקרים פרמקולוגיים יכולים לחשוף את השפעתם של תרכובות שונות על תפקוד הלב.
מטרת המחקר
- להדגמת טכניקות לניטור קצב הלב בפסילוני Drosophila.
- לבחינת ההשפעות של חומרים פרמקולוגיים על תפקוד הלב.
- לספק מתודולוגיה מפורטת הן עבור דגימות שלמות והן עבור דגימות מופרדות (dissected).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שיטת ויזואליזציה ללא קיבוע באמצעות מיקרוסקופ סטריאו.
- שיטת הדבקה להרכבה קבועה של זחלים על תגליות.
- טכניקות דיסקציה (ניתוח) להגעה ללב ולקנה הנשימה.
- קוצב חשמלי והקלטות פוטנציאל שטח להערכת פעילות הלב.
תוצאות עיקריות
- ניטור מוצלח של קצב הלב בהכנות זחלים שונות.
- הדגמה של השפעותיהם של חומרים פרמקולוגיים על התכווצויות הלב.
- אספקת פרוטוקול ברור לניתוח ולמיקום האלקטרודות.
- הצגת ההיתכנות של שימוש ב-Drosophila למחקרי לב.
מסקנות
- זחלי דרוזופילה הם מודלים יעילים לחקר תפקודי הלב.
- ניתן להתאים את השיטות המתוארות לצרכים ניסויים שונים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על טכניקות אלו כדי להעמיק את חקר הפיזיולוגיה של הלב.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
מודלים של לב זחלי Drosophila מאפשרים הפחתת סיכונים מכניסטית של תפקוד תעלות יונים ובקרים (pacemakers) בשלבים מוקדמים של הגילוי, ובכך תומכים בתיקוף מטרות עבור מסלולים הקשורים למערכת הלב. ההכנה מספקת מדדים כמותיים וניתנים לשחזור של קצב הלב והפעילות החשמלית, ובכך מקלה על פיתוח בדיקות לסריקת תרכובות. מערכת זו מציעה מודל רלוונטי למחלה וניתן לשליטה גנטית להערכת הפוטנציאל של ביומרקרים תרגומיים וביטחון ניבוי בזיהוי מולקולות מובילות (leads).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות לתפקוד תעלות יונים ופעילות קוצבי לב במערכת נגישה גנטית.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות ליישום ישיר של סוכנים פרמקולוגיים על הלב החשוף.
- ערך ניבוי: מספק מדידות כמותיות של קצב הלב ופוטנציאלים של קרומי התאים להערכת מעורבות המטרה ומודולציה של מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יוצר פלטים סטנדרטיים וכמותיים (קצב לב, פוטנציאלי שדה, הקלטות תוך-תאיות) להערכה מהימנה של תרכובות.
- ערך תפעולי: מאפשר שחזור של הבדיקה באמצעות תכשירים מופרדים המאפשרים חשיפה מבוקרת לתרכובות ובקרה סביבתית.
- יכולת הרחבה: ניתן להשתמש בתכשירים של לבבות מופרדים לצורך התאמה לפורמט של מספר בארות כדי לתמוך בסריקה בעוצמה בינונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות תרגומית: הכנת לב של זחלים משמשת כמערכת רלוונטית למחלה למידול תקלות יוניות הקשורות לגנים ספציפיים הקשורים למחלות לב ביונקים.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מאפשרת בחינה של הבסיס היוני של פוטנציאלי פעולה והשפעות של מוטציות בתעלות יונים או של מודולטורים, ובכך מפחיתה עמימות מנגנונית.
- המשכיות ניבוי: תומכת בתיאום של סמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי קישור אלקטרופיזיולוגיה של זחלים למנגנונים יוניים ידועים באורגניזמים גבוהים יותר.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מוביל, ומספקת תובנות מכניסטיות המייגדות את הערכת הסיכונים הפרה-קלינית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות לגבי תרומתם של תעלות יונים וקוצבי לב לתפקוד הלב באמצעות קריאות אלקטרופיזיולוגיות ישירות.
- סריקה: מספקת מדידות כמותיות וניתנות לשחזור של קצב הלב ופוטנציאלים, המאפשרות השוואה בין תרכובות או תנאים גנטיים שונים.
- אנליטיקה: מייצרת נתונים אלקטרופיזיולוגיים (קצב לב, פוטנציאלי ממברנה, פוטנציאלי שדה) המסייעים לצוויות להעריך את השפעת התרכובות על ההולכה החשמלית והכיווץ.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית באמצעות מידול של זרמים יוניים העומדים בבסיס פוטנציאלי פעולה, הרלוונטיים לפתופיזיולוגיה של לב יונקים.
- שימוש חוזר ארגוני: מקימה פלטפורמה לשימוש חוזר עבור פנוטיפ לב ברחבי פרויקטים מרובים הכוללים מטרות של תעלות יונים או מודלים של מחלות גנטיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי קישור הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות למדדי תפקודי לב.
- ערך תפעולי: מספק הכנות סטנדרטיות וניתנות להרחבה המפחיתות שונות ותומכות בעקביות בין צוותים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go על ידי אספקת נתונים מכניסטיים מוקדמים על סיכונים לבביים הקשורים לתעלות יונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם סיכון, בהתבסס על בטיחות לבבית ופרופילי מעורבות מטרה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-Drosophila, בניתוח ובטכניקות של רישום אלקטרופיזיולוגי.
- תלוי במיקרוסקופיה, במניפולציה של אלקטרודות ובחומרת גירוי עבור רישומים תוך-תאיים ושל פוטנציאל שדה.
- מחייב סטנדרטיזציה של תזמון הניתוח, הרכב התמיסה המלוחית ומיקום האלקטרודות בין משתמשים ומעבדות שונות.
- שיקולי התאמה כוללים את האנטומיה הספציפית של הלב למין ואת ההרכב היוני בעת הרחבה למודלים של חרקים או חסרי חולר אחרים.
- מגבלות מעשיות כוללות את יציבות ההכנה לאורך זמן ונזק אפשרי לרקמה במהלך הניתוח, העלולים להשפיע על איכות הרישום.
